Method Article

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

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Wir beschreiben zwei komplementäre Methoden, die den Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklus-Indikator (FUCCI) und Bildanalyse oder Durchflusszytometrie verwenden, um Zellen in den inneren G1-arretierten und äußeren proliferierenden Regionen von 3D-Sphäroiden zu identifizieren und zu isolieren.

Abstract

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Dreidimensionale (3D) Tumorsphäroide werden in der Krebsforschung als genaueres Modell der in vivo Tumormikroumgebung verwendet, verglichen mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturen. Das Sphäroidmodell ist in der Lage, die Auswirkungen von Zell-Zell-Interaktion, Hypoxie und Nährstoffentzug sowie der Medikamentenpenetration nachzuahmen. Charakteristisch für dieses Modell ist die Entwicklung eines nekrotischen Kerns, der von einem Ring aus G1-fixierten Zellen umgeben ist, mit proliferierenden Zellen auf den äußeren Schichten des Sphäroids. Im Bereich Krebs ist interessant, wie verschiedene Regionen des Sphäroids auf medikamentöse Therapien sowie genetische oder umweltbedingte Manipulationen reagieren. Wir beschreiben hier die Verwendung des Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklusindikator-Systems (FUCCI) zusammen mit Zytometrie und Bildanalyse unter Verwendung kommerzieller Software, um den Zellzyklusstatus von Zellen in Bezug auf ihre Position in Melanom-Sphäroiden zu charakterisieren. Diese Methoden können verwendet werden, um Veränderungen des Zellzyklusstatus, der Gen-/Proteinexpression oder der Zellviabilität in verschiedenen Subregionen von Tumorsphäroiden im Laufe der Zeit und unter verschiedenen Bedingungen zu verfolgen.

Introduction

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Mehrzelligen Sphäroiden 3D haben als Tumor-Modell seit Jahrzehnten bekannt, aber es ist erst vor kurzem, dass sie in häufiger Verwendung als in vitro-Modell für viele soliden Tumoren kommen. Sie werden zunehmend in Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche Bildschirme als Vermittler zwischen komplex, teuer und zeitaufwendig in vivo-Modelle und die einfache, kostengünstige 2D-Einzelschicht-Modell 1-6 verwendet. Studies in 2D Kultur sind oft nicht in der Lage, um in vivo repliziert werden. Spheroid Modelle von vielen Arten von Krebs in der Lage, die Wachstumseigenschaften, Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Drogen-Penetration, Zell-Zell-In....

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Protocol

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1. Fucci Transduktion und Zellkultur

  1. Fucci Transduktion
    1. Erstellen Zelllinien stabil exprimieren die Fucci Konstrukte mKO2-hCdt1 (30-120) und Mag-hGem (1-100) 15 mit Lentivirus-Cotransduktion wie zuvor beschrieben 7.
      Hinweis: Die Fucci System ist jetzt im Handel erhältlich.
    2. Generieren Unter Klone mit heller Fluoreszenz durch Einzelzellsortierung. Sortier einzelnen Zellen positiv für beide AG und KO (gelb) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung in eine 96-Well-Platte wie oben beschrieben 7,16.
  2. Melanom-Zellkultur
    1. Kultur C8161 menschlichen Melanomzellen, wie zuvor besc....

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Results

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Es gibt mehrere Verfahren zur Herstellung Tumorsphäroide Dieses Protokoll verwendet die nicht-haftenden Wachstumsverfahren, bei dem Zellen auf Agar oder Agarose 3,7,9 kultiviert werden. 1 zeigt ein Beispiel eines C8161-Melanom Sphäroid nach 3 Tagen auf Agar. C8161 Sphäroide bilden regelmäßige Größe Sphäroiden mit einem Durchmesser von 500 bis 600 & mgr; m (Mittelwert = 565, SD = 19, n = 3) nach 3 Tagen. Andere Melanom-Zelllinien, die Sphäroide bilden gehören: WM793, WM983C, WM983B, WM164,.......

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Discussion

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Halbautomatische Bildanalyse identifizierte die Sphäroid Innen G1 festgenommen Region und wuchernden äußeren Schichten. Dieses Verfahren kann auf Live-Sphäroiden mit einem optischen Abschnitt verwendet werden, oder in festen Sphäroid Abschnitte, auf Veränderungen nicht nur des Zellzyklus, sondern Markerexpression (über Immunfluoreszenz), Zelltod oder Zellmorphologie in diesen verschiedenen Regionen zu identifizieren. Zellbeweglichkeit in verschiedenen Regionen Sphäroid kann auch quantifiziert werden -, wenn Live-konfoka.......

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Disclosures

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PerkinElmer beteiligte sich an den Kosten der Veröffentlichung.

Acknowledgements

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Wir danken Frau Danae Sharp und Frau Sheena Daignault für die technische Unterstützung. Wir danken Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, für die Bereitstellung der FUCCI-Konstrukte, Dr. Meenhard Herlyn und Frau Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, für die Bereitstellung von Zelllinien, der Imaging and Flow Cytometry Facility am Centenary Institute für die hervorragende technische Unterstützung. Wir danken Chris Johnson und Dr. Andrew Barlow für den technischen Support der Volocity-Software. N.K.H. ist Cameron-Stipendiat des Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australien. K.A.B. ist Fellow des Cancer Institute New South Wales (13/ECF....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
Agarose niedriger SchmelzpunktLife Technologies16520-050Zum Schneiden von
Edelagar SigmaA5431Zur Herstellung von Sphäroiden
Agarose für SphäroideFisher ScientificBP1356-100Zur Herstellung von Sphäroiden
0,05 % Trypsin/EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10 % FormalinSigmaHT5014-1CSACHTUNG: Schädlich, ätzend. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung, tun   keine Atemdämpfe (in einem Abzug öffnen).
lebend/tot in der Nähe von IRLife TechnologiesL10119
VibratomTechnical Products International, Inc
GeierbecherThermo-Fisher ScientificSIE936Form zum Schneiden von Sphäroiden
HämozytometerSigmaZ359629
96-Well-GewebekulturplatteInvitroFAL353072
KollagenaseSigmaC5138 
KonfokalmikroskopLeicaTCS SP5
Durchflusszytometer-AnalysatorBecton DickinsonLSRFortessa
volocityPerkinElmerBildgebungssoftware
flowjoTree StarDurchflusszytometrie-Software
VakuumfettSigmaZ273554
EinbettmedienVektor LaboratorienH1000
FUCCI (kommerzielle Konstrukte)Life TechnologiesP36238Nur transiente Transfektion
Zellsieb 70 μ mIn VitroFAL352350
5 ml Röhrchen mit rundem Boden (steril)In VitroFAL352003
5 ml Röhrchen mit rundem Boden (unsteril)In VitroFAL352008

References

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  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

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3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

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