Functional Cloning Mit ein Xenopus Eizellen Expression System

Summary

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Abstract

Die Identifizierung von Genen, die für die embryonale Induktion verantwortlich sind, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar; um nur einige zu nennen: Sekretierte Moleküle von Interesse können in der Häufigkeit gering sein, nicht sezerniert werden, sondern an die Signalzelle(n) gebunden sein, oder das Vorhandensein von Bindungspartnern oder vorgeschalteten regulatorischen Molekülen erfordern. Auf der Suche nach Genprodukten, die in der Lage sind, eine frühe linseninduktive Reaktion in kompetenten Ektodermen hervorzurufen, verwendeten wir daher ein Expressionsklonierungssystem, das die Identifizierung von parakrinen oder juxtacrinen Faktoren sowie transkriptionellen oder anderen regulatorischen Proteinen ermöglicht. mRNA-Pools wurden in Xenopus-Eizellen injiziert und das reagierende Gewebe direkt auf die Eizellen aufgesetzt und co-kultiviert. Nach der funktionellen Klonierung von ldb1 aus einer cDNA-Bibliothek im Neuralplattenstadium basierend auf seiner Fähigkeit, die Expression des frühen Linsenplacode-Markers foxe3 in linsenkompetenten tierischen Kapektodermen hervorzurufen, charakterisierten wir das mRNA-Expressionsmuster und untersuchten die Entwicklungsprogression nach Überexpression oder Knockdown von ldb1. Dieses System eignet sich für eine Vielzahl von Kontexten, in denen die Identifizierung eines Induktors oder seiner vorgeschalteten regulatorischen Moleküle anhand einer funktionellen Reaktion in kompetentem Gewebe angestrebt wird.

Introduction

Vorausschauende genetische Ansätze zur Identifizierung von Genen von Interesse durch ihre Funktion oder ihren Funktionsverlust^1,2 sind ein integraler Bestandteil des Verständnisses komplexer Musterereignisse in der Entwicklung. In Verbindung mit leistungsstarken reversen genetischen Techniken, die einem immer breiteren Spektrum von Systemen und Forschern zur Verfügung stehen^3-5, ist es nun möglich, Gene mit einer wichtigen funktionellen Rolle in einem Signalweg zu identifizieren und diese Funktion dann auf zellulärer Ebene und in Interaktion mit anderen Genprodukten aufzuklären. Ein Ansatz zur funktionellen Identifizierung von Genen von Interesse, der in der Vergangenheit viele wichtige Erkenntnisse erbracht hat, ist das Expressionsklonieren^6,7.

Unser jüngstes Ziel⁸ war es, frühe linseninduktive Faktoren zu identifizieren, da gezeigt wurde, dass erste Schritte im linseninduzierten Prozess von Wirbeltieren bereits in den Gastrula-Stadien stattfinden. Zu diesem Zweck verwendeten wir das transient linsenkompetente^9-tierische Kapektoderm (Stadium 11-11.5¹⁰) von Xenopus-Embryonen als ansprechendes Gewebe für die Induktion und die Xenopus-Eizelle im Stadium VI als Produktionsquelle für die induzierenden Faktoren.

Das folgende Protokoll baut auf den Expression-Klonierungs- und Sib-Auswahlprotokollen von Smith und Harland^6,7 auf, die auch von anderen^11-13 erfolgreich verwendet werden. In unserem Oozytenexpressionssystem (das erstmals von Lustig und Kirschner¹⁴ zur Produktion von induzierenden Faktoren verwendet wurde) werden Pools von injizierten Transkripten ausgewählt und identifiziert, die in der Lage sind, die Eizellen direkt oder indirekt dazu zu bringen, Faktoren zu produzieren, die eine linseninduktive Reaktion im tierischen Kapektoderm hervorrufen. Da das System für die direkte Expression sekretierter induzierender Moleküle nützlich ist (Eizell-injizierte INHBB-mRNA bewirkt eine Mesoderminduktion bei mesoderm-kompetenten tierischen Kapektodermen⁸), erwarteten wir ursprünglich, dass das Screening-Verfahren vor allem für die Identifizierung parakriner Faktoren nützlich sein würde. Da wir jedoch einen nuklearen Faktor in unserem Screening (ldb1⁸) identifiziert haben, ist klar, dass das System zur Identifizierung einer Vielzahl von Molekülen wie transkriptionellen oder translationalen regulatorischen Faktoren, miRNAs, Cofaktoren oder juxtacrinen Faktoren verwendet werden kann.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden von der University of Virginia Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die experimentellen Verfahren.

1. Herstellung von Oozyten

1. Pre-prime X. laevis Weibchen mit 150 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) etwa eine Woche im Voraus über Eizelle Isolation. Injizieren Sie 1 ml 150 U / ml PMSG in Rücken Lymphsack mit 1 cc sterile Spritze mit 29 G-Nadel.
2. Bereiten Sie Lösungen für Oocyteninjektion und Oozyten-Tierkappe Assay.
   1. Vorbereitung Ca ^{++ /} Mg ⁺⁺ -freier OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na _{2 HPO 4,} 50 mM HEPES pH 7,2.
   2. Bereiten OR2: OR2- plus 1 mM CaCl _{2 und 1} mM MgCl _2.
   3. Vorbereitung OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml Gentamycin, pH 7,8.
   4. Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM _CaCl 2, 1 mM MgSO _{4, 5} mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO _3.
   5. Bereiten Sie 3% Ficoll in 1x MBS.
   6. 1fach NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca _(NO 3) 2, 1 mM MgSO _4, 0,1 mM EDTA, 1 mM _NaHCO 3, 2 mM Na _{3 PO 4,} pH 7,4.
3. Betäuben die Frau in einer 0,03% igen Lösung von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS222) in 0,1 MBS (erste aufzulösen 0,3 g MS222 in 10 ml 95% Ethanol, dann in 1 L 0,1 x MBS verdünnen), indem Frosch in Lösung 10-15 Minuten oder bis nicht mehr reagiert.
   1. Prüfen Sie, ob der Anästhesie abgeschlossen durch Drehen narkotisierten Frosch auf den Rücken, um sicherzustellen, es reagiert nicht (vollständig betäubten Froschschenkel zu bewegen oder drehen Körper über) ist.
4. Chirurgisch zu isolieren Eierstockfragmente, indem sie ein Bauchschnitt durch die Haut und Körper Wand mit Skalpell, Isolieren Eierstockgewebe mit einer Pinzetteund Schere. Zeigen Eierstock Fragmente in OR2-. Schließen Sie die Körperwand mit einem 3-0 Seidennaht auf einem 24 mm gebogene Nadel und schließen Sie die Haut separat mit den gleichen Nähten. Eine Wiederherstellung der weiblichen in 1 g / l Aquarium Salz in Wasser.
5. Verwenden feinen Pinzette, reißEierStockGewebe in kleine (10 - 20 Eizellen) Stücke und Transfer zum frischen OR2-.
6. Defolliculate ovarian Fragmente in 2,0 mg / ml Collagenase A in OR2- durch Rühren vorsichtig auf einem Schüttler für 1 Stunde, der Übertragung auf frische Kollagenase und Rühren für eine weitere Stunde.
7. Wasch Oozyten 10mal OR2 [Ca ^{++ /} Mg ⁺⁺ enthält], Verwerfen kleiner Oozyten.
8. Waschen Sie Oozyten in OCM zweimal und übertragen an die frische OCM. Isolieren Stufe VI Oozyten nach Größe bei Sichtprüfung und entsorgen unreifen (kleinere) Oozyten: Stufe VI Oozyten sind größer als die unreifen Eizellen mit noch Pigmentierung im Tier Hemisphäre und etwa 1,2 bis 1,4 mm Durchmesser.
9. Pflegen Oozyten bei 18 - 20 ° C in OCM vor der Injektion. Hinweis: Agarose-beschichteten Petrischalen verwendet werden, um ein Anhaften von Eizellen zu minimieren, austeilen wird.

2. Injektion Bibliothek Transcripts

1. Vorbereitung einer direktionalen cDNA-Bank ¹⁵ unter Verwendung von RNA in einem geeigneten Stadium der Entwicklung (beispielsweise neuronale Platte Stufe 14 ¹⁰⁾ extrahiert. Erwerben Sie eine cDNA-Bibliothek oder konstruieren eine Verwendung eines kommerziellen Kits pro Übersicht in den vier Schritten unten.
   1. Isolieren Sie etwa 5 ug mRNA mit einem Produkt, für Poly (A) + RNA (Siehe Tabelle der Materialien) zu bereichern und nach den Anweisungen des Herstellers. Anmerkung: Die Transkripte verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek kann auf ein induzierendes Gewebe beschränkt sein zu erzeugen (wie beispielsweise das neuronale Platte nach Mikrodissektion des gewünschten Gewebes) oder kann aus ganzen Embryonen in einem bestimmten Stadium können.
   2. Produzieren cDNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen.
   3. Ligieren ungefähr 20 ng cDNA in einen vector, das mit dem kommerziellen Kit oder einem anderen geeigneten Vektor. Einen geeigneten Plasmidvektor enthält Sequenzen, die für mRNA-Stabilität, wie beispielsweise 5'-β-Globin-3 Poly (A) -Sequenzen (pCS2 +, pTnT, pCS105).
   4. Transform-Ligation in kompetente Bakterienzellen mit Lieferanten empfohlenen Protokoll für Hitzeschock-Transformation.
      Hinweis: Alternativ ist eine Sammlung von offenen Leserahmen (ORFeome) Klone Handel erhältlich und können verwendet werden, um Transkripte für die Injektion zu erzeugen.
2. Herstellung von 10 Pools von Plasmiden ^von 10 3 bis 10 ⁴ Komplexität ^(10. April - 10. MAI Gesamtkomplexität). Dies entspricht 10 Platten mit 1.000 - je 10.000 Kolonien.
   1. Plattenbibliothekskultur auf 10 15-cm-LB-Ampicillin-Platten, wachsen 12 bis 18 h bei 37 ° C, und sammeln Sie Kolonien von jeder durch sanften Druck mit einem Glas Treuer in 7 ml LB.
   2. Bereiten Sie eine Glycerin-Stamm von 0,5 ml (0,2 ml sterilem Glycerin und Speicher hinzuzufügen bei -20 &# 730; C), und verwenden Sie die verbleibenden 6,5 ml, um DNA mit einem Standard-Vorbereitung im Handel erhältlichen DNA Miniprep Kit folgenden Herstellers.
3. Linearisieren gepoolte Plasmid-DNA (1,0 bis 2,0 & mgr; g) mit geeigneten Restriktionsenzymverdau ¹⁶ bei 37 ° C für 1 - 1,5 Stunden. Isolieren Sie die linearisierte DNA mit Phenol / Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanolfällung und Resuspension in Wasser nach den Vorgaben der RNA-Polymerase-Kit verwendet wird. Synthetisieren Sinn-RNA mit einer RNA-Polymerase kommerziellen Kits nach Herstelleranweisungen.
4. Vorbereitung Nadeln für die Mikroinjektion (Verwendung einer Nadel Abzieher mit Glaskapillarröhren) von etwa 20 um Durchmesser; messen Nadelspitzen auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Hinweis: Nadelzieher Einstellungen müssen empirisch bestimmt, um eine Nadel mit einer feinen Spitze, so dass, wenn sie mit einer feinen Pinzette gebrochen ergibt die gewünschte Düsengröße zu erzeugen.
5. Prepare (Push Ton ingleichmäßige Schicht auf der Unterseite der Schale) Lehm ausgekleideten 35 x 10 mm Petrischalen mit parallelen Rillen an Eizellen in während Mikroinjektion zu halten; produzieren Nuten mit einem Einkaufszentrum Sonde oder Pasteur-Pipette an der Spitze in Flammen fusioniert. Als Alternative zu Ton, vorzubereiten Agarose Gerichte machen Vertiefungen mit einem Elastomer ^Form 17. Übertragungs Oozyten mit weiter Bohrung Pipette bis 3% Ficoll in 1X MBS (ca. 2 ml) in Reihen in den Lehm ausgekleidet Gerichte.
6. Verwendung Mikroinjektor, füllen Nadel mit 1 ng / nl RNA und stellen Balance leichten Überdruck zu erzeugen (Ausarbeitung Eizelle Zytoplasma zu verhindern).
7. Injizieren Oozyten, die mit etwa 20 nl RNA in der Äquatorregion. Lassen Sie 1 Stunde für die injizierten Oozyten in Ficoll-MBS bleiben, dann übertragen Sie vorsichtig, um 1x MBS. Inkubation für 8 bis 24 Stunden bei 20 ° C vor der animal cap Assay.

3. Tier Cap Assay

1. Bereiten Sie 3 / 4x NAM und erhalten feinen Pinzette, Haarschleife, gekrümmte Deckglas-Fragmente, Ton ausgekleideten dishes mit becherförmigen Vertiefungen, um Eizellen zu halten. Machen Sie gebogene Deckglas-Fragmente durch Auseinanderbrechen Deckgläser in kleine Fragmente (ungefähr 1-2 mm x 2 - 4 mm) und durch Flammen, bis Kanten polieren und hängen, wodurch ein Kurvenstück.
2. Düngung X. laevis Eiern ^{18 durch} in vitro oder natürliche Paarung und Kultur Stufen Gastrula (10 - 11 Stunden nach der Befruchtung bei RT) in 0,1 x MBS vor der Sortierung nach Stufe; Sammeln Mitte der Gastrula (Stufe 11 bis 11,5) ¹⁰ Embryonen.
3. Transfer-Embryonen in eine Petrischale etwa zur Hälfte mit 3/4-fach NAM. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, entfernen Fertilisation (Dotter) Membran von Gastrulen.
4. Transfer Oozyten bis 3 / 4x NAM (etwa 2 ml) in Ton ausgekleideten Gerichte und unbeweglich in einzelnen Eindrücke im Ton, Erzeugung Eindrücke auf einzelne Embryonen unterzubringen als Nuten wurden oben beschrieben.
5. Transfer-Embryonen, um den Ton ausgekleideten Gerichte und schneiden animal caps off gastrulae mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Achten Sie darauf, Tierkappe Ektoderm nur und nicht die Äquatorial Gewebe ¹⁸ zu isolieren.
6. Platzieren eines Tieres Kappe auf dem Tierhemisphäre jede Oozyte mit der Innenfläche des Tierkappe Kontaktieren der Eizelle. Halten Rekombinanten gemeinsam durch Anlegen gekrümmten Deckglas-Fragment und nach unten gedrückt, um das Glas, Abflachen des Ektoderms wie die Deckkontakte des Tons (animal caps kann mit der Innenschicht auf die Oberfläche der Eizelle für 6 ausgesetzt bleiben offen - 8 h oder länger ).
   Hinweis: Sie können auch den Tierkappe in einem Ton-Einzug mit seiner Innenfläche nach oben und legen Sie eine Eizelle an der Kappe; sichern die rekombinante mit kleinen Erweiterungen von Ton.
7. Kultur bei 20 ° C, bis Steuer Embryonen reach gewünschte Bühne für Assay.
8. Separate rekombinanten durch Entfernen Deckglas / Ton und Isolieren Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife.
9. Fix ektodermalen Fragmente für 1 Stunde in MEMFA (3,8%Formaldehyd in MEM [0,1 M MOPS, pH 7,4, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO _4]).
10. Transfer-Fragmente (und Kontrolle Embryonen) aus MEMFA zu Ethanol und bei -20 ˚C.

4. Analyse der Antwort in Ektoderm durch in situ Hybridisierung (ISH)

1. Bereiten Sie Lösungen für die ISH.
   1. Vorbereitung 1x PBS: 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,138 M NaCl, pH 7,4
   2. Vorbereitung PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20
   3. Vorbereitung 100x Denhart-Lösung: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
   4. Vorbereitung Hybridisierungspuffer: 50% Formamid, 5 × SSC, 1 mg / ml Hefe-RNA torula, 1 ug / ml Heparin, 1x Denhart-Lösung, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H _{2 O}
   5. Vorbereitung Maleinsäure-Puffer (MAB): 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5
   6. Bereiten MAB + Block: MAB, 2% Blockierungsreagenz (Wärme bis 60 ° C zu lösen)
   7. Vorbereitung alkalische Phosphatase (AP) Puffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl _{2, 100} mM NaCl, 0,1% Tween, dH _{2 O}
2. Bereiten Sie die RNA-Sonde.
   1. Unter Verwendung eines kommerziellen RNA-Polymerase-Kit und graben-NTP-Mix, fügen Sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (50 & mgr; l-Reaktion): 25,5 & mgr; l _DEPC-H 2 O, 10 ul 5X Transcription Buffer, 2,5 ul 10x dig-NTP-Mix, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul linearisierte DNA-Templat (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 90 min.
   2. In 2 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 60 min.
   3. Prüfen 2 ul Reaktions auf 1% Agarose-Gel.
   4. 1 ul RQ1 RNase-Free DNase und Inkubation 37 C für 20 min.
   5. Fällt die Sonde durch Zugabe von 50 & mgr; l DEPC-H _{2 O,} 25 ul 10 M Ammoniumacetat und 313 ul Ethanol. Lagerung bei -20 C über Nacht (O / N), dann erholen RNA durch Zentrifugation bei 13.800 × g für 20 min. Mit 500 ul 75% Ethanol waschen, kurz drehen, entfernenEthanol und ermöglichen Pellet an der Luft trocknen. In 50 ul _DEPC-H 2 O.
   6. Hinzufügen Hybridisierungspuffer bis zu einer Endkonzentration von ~ 0,5 ug / ul.
3. Bereiten Tissue für die Hybridisierung. Wenn nicht anders angegeben, füllen Fläschchen an die Spitze mit jeder Lösung Änderung beschrieben (ca. 4 ml).
   1. Entfernen von Ethanol aus Fläschchen und Transfer-Embryonen in 75% Ethanol / PTW, dann 50% Ethanol / PTW für jede 10 min, horizontal auf Wippe.
   2. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
   3. Transfer zum 10 ug / ul Proteinase K-Behandlung in PTW; Rockröhren vertikal 15 min.
   4. Spülen Sie zweimal je 10 min in 0,1 M Triethanolamin pH-Wert 7,8 - Rockröhren vertikal.
   5. In 12,5 ul Essigsäureanhydrid, um Rohre und Rock vertikal 5 min. Wiederholen Sie mit zusätzlichen 12,5 ul Essigsäureanhydrid für 5 min.
   6. Waschen Sie in PTW 5 min vertikal auf Wippe.
   7. REFIX in 4% Paraformaldehyd 20 min auf Wippe. Wärmehybridisierungspufferbis 60 ° C.
   8. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
   9. Entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml PTW aus jedem Röhrchen und fügen Sie 250 ul Hyb-Puffer; leicht schwenken Rohre zu mischen. Rockröhren vertikal 5 min.
   10. Ersetzen Sie mit 60 ˚C Hyb-Puffer (0,5 ml) und leicht rühren bei 60 ° C 10 min. Ersetzen mit frischem Hyb Puffer und rühren bei 60 ° C zwei bis 4 Stunden.
   11. Wärmesonde (1 ml bei 0,5 ug / ul in Hyb-Puffer) bis 60 ° C (3 min). Entfernen Hyb Puffer und Sonde in Rohren. Leicht bewegen O / N bei 60 ° C.
4. Bereiten Tissue für Antikörper.
   1. Warm Hyb Puffer und 2x SSC + 0,1% Tween-20-Lösungen bis 60 ° C.
   2. Ersetzen Sondenlösung mit Hyb Buffer (Speichern Sonden bei -20 ° C für 2 - 3x Wiederverwendung). Für 10 Minuten bei 60 ° C waschen.
   3. Dreimal bei 60 ° C in 2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
   4. Dreimal bei 60 ° C in 0,2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
   5. Zweimal für jeweils 15 min horizontal auf Wippe waschen in MAB (RT).
   6. 1 ml MAB + Block. Waschen Sie 2 Stunden vertikal auf Wippe.
   7. Transfer zum 1 ml MAB + Block mit einer 1 / 2.000 Anti-Digoxygenin-AP. Rock vertikal bei 4 CO / N.
5. Bereiten Tissue für Farbreagenz.
   1. Ersetzen Antikörperlösung mit MAB; waschen dreimal MAB 5 min jeweils horizontal auf Wippe.
   2. Drei Mal in MAB 1 Stunde jeweils horizontal auf Wippe waschen.
   3. Zweimal in AP-Puffer jeweils 10 Minuten horizontal auf Wippe waschen.
   4. Bringen Gewebe Mehr auch Kunststoffwanne, entfernen AP-Puffer und fügen BM Lila Reagenz (~ 1 ml). Erlauben Reaktion auf in der Dunkelheit 5 Minuten bis O / N fortfahren.
   5. Wenn entsprechende Färbung erreicht ist, zu übertragen, um Gewebedurchstechflaschen mit PTW. Zwei Mal jeweils 10 Minuten auf Wippe waschen in PTW.
   6. Fix in Bouin-Lösung bei 4 CO / N auf Wippe.
   7. Waschen Sie Bouin-mit drei 70% Ethanol / 30% PTW Wäschen bei RT. Gehen to Aufnahme von Bildern mit Auflicht und ein Mikroskop montierten Kamera, Bleichen wenn nötig ^18.

5. Sib Auswahl und Klonierung

1. Wählen Sie Pool mit der höchsten Aktivität (größte Resonanz in ektodermalen Gewebe).
2. Man titriert (verdünnte mit LB, geeignete Dichte) das Glycerin Lager für den Pool mit der höchsten Aktivität und Platte aus zehn neuen Platten mit etwa einem Zehntel der Kolonien aus dem vorherigen Schritt (unter Verwendung von Abschnitt 2 in Protokoll oben).
3. Poolgröße zu reduzieren, bis Aktivität auf einzelne Kolonie zurückverfolgt.
4. DNA-Sequenz zu erhalten, unter Verwendung von Standard-Primer im Vektor.

Results

Als Reaktion auf die Expression von mRNA in Oozyten injiziert und reagiert animal cap-Gewebe wurde für die Expression von OTX2 durch in situ-Hybridisierung (Figur 2 und Tabelle 1) untersucht; OTX2 wird in der mutmaßlichen Linsen Ektoderm (PLE) aus Neuralrohrschlusses durch Linsenplakode exprimiert Verdickung ^19. Da jedoch OTX2 ist auch in der vorderen neuronalen Ektoderm sowie nichtneuralen Kopf Ektoderm außerhalb des PLE au...

Discussion

Die für die funktionale Klonierung von Genen in der Lage, eine Antwort in kompetente Ektoderm Induzieren hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Genprodukten zu identifizieren. Diese Methode baut auf früheren Arbeiten durch die Kombination von Gewebe-induzierende Assays mit Ausdruck Klonierungstechniken. Wir nutzen die Stoffwechselwege des Xenopus-Oozyten als Quelle der Erzeugung von induzierende Faktoren, die direkt oder indirekt folgende RNA-Injektion. Dies in Kombination mit d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101	Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	12/101	Monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Muskelgewebe
20x SSC Buffer	Sigma	S6639	für ISH
Essigsäureanhydrid	Sigma	A6404	für ISH
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	für ISH
Aurum Plasmid Mini Kit	Bio-Rad	732-6400	Aufreinigung von Plasmid-DNA
Blockierungsreagenz	Roche	11096176001	für ISH
BM Purple	Roche	11442074001	für ISH
Boekel Hybridisierungsofen	Fisher Scientific	13-245-121	für ISH
Bouin's Solution	Sigma	HT10132	für ISH
BSA	Sigma	A9647	für OCM
CHAPS	Sigma	C3023	für ISH
Kollagenase A	Roche	10103578001	Defollikulation von Eizellen
Cystein	Sigma	C121800	Dejelly Embryonen
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	für ISH
Dig-RNA Labeling Mix	Roche	11277073910	für ISH-Sonden
Dumont #5 Pinzetten	World Precision Instruments	500233	für Vitellline Envelope Entfernung
Ethyl-3-aminobenzoat	Sigma	A5040	MS222 Anästhetikum
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	für Injektionsmedien
Formamid	Sigma	F9037	für ISH
Gentamicinsulfat	Sigma	G1914	für OCM
Glaskapillaren	World Precision Instruments	4878	3,5" lang, I,D, 0,530 mm
Probenfläschchen aus Glas	Fisher Scientific	06-408B	für ISH
Hair Loop			In einer Pasteurpipette für die Gewebemanipulation befestigtes Haar
Heparin-Natriumsalz	Sigma	H4784	für ISH
Injector Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	Mikroprozessorgesteuerter Mikroinjektor
Instant Ocean	Carolina	972433	Aquarium Salt for Frog
Recovery IRBG XGC Xenopus verifizierte Cam cDNA-Quelle in voller Länge	Bioscience	989_IRBG	cDNA-Bibliothek
LB Agar Platten mit 100 & Mikro; g/ml Ampicillin	Teknova	L5004	150 mm vorgegossene LB-Amp Platten für die Geschwisterauswahl
LB Luria	Broth Teknova	L8650	LB für die Entnahme von Kolonien in der Geschwisterauswahl aus Platten und Verdünnung von Kulturen
Magnetisches mRNA Isolation Kit	New England BioLabs	S1550S	für die Isolierung von poly(A)-angereicherter RNA
Maleinsäure	Sigma	M0375	für ISH
Manueller Microfil Mikromanipulator	World Precision Instruments	M3310R	Manueller Mikromanipulator
Nutating Mixer	Fisher Scientific	22-363-152	Wippe für ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	Ton für Injektions- und Sezierschalen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P5368	für ISH
PMSG	Sigma	G4877	zur Stimulierung der Eizellentwicklung
Polyvinylpyrrolidon	Sigma	PVP40	für ISH
Programmable Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Mikropipette Nadelabzieher
Proteinase K	Sigma	P6556	für ISH
pTnT Vektor	Promega	L5610	cDNA-Bibliotheksbau
Riboprobe Combination System	Promega	P1450	in vitro Transkription
Hochgestelltes cDNA-Bibliotheksbauset in voller Länge	Life Technologies		18248013-Kit für den Bau von cDNA-Bibliotheksnähten
, 3-0 Seide	Fisher Scientific	19-037-516	Nahtfaden und Nadel für die Entfernung nach der Eizelle
Torula RNA	Sigma	R3629	für ISH
Triethanolamin	Sigma	T1502	für ISH
Tween 20	Sigma	P9416	für ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesesystem	Promega	C4360	alternatives Kit für den Aufbau von cDNA-Bibliotheken
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells	Agilent Technologies	200150	Zellen für die Transformation von cDNA Bibliothek