Method Article

Functional Cloning Mit ein Xenopus Eizellen Expression System

DOI:

10.3791/53518

⸱

January 30th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Shepherd University, 2Department of Biology, University of Virginia

In This Article

Summary

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Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Abstract

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Die Identifizierung von Genen, die für die embryonale Induktion verantwortlich sind, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar; um nur einige zu nennen: Sekretierte Moleküle von Interesse können in der Häufigkeit gering sein, nicht sezerniert werden, sondern an die Signalzelle(n) gebunden sein, oder das Vorhandensein von Bindungspartnern oder vorgeschalteten regulatorischen Molekülen erfordern. Auf der Suche nach Genprodukten, die in der Lage sind, eine frühe linseninduktive Reaktion in kompetenten Ektodermen hervorzurufen, verwendeten wir daher ein Expressionsklonierungssystem, das die Identifizierung von parakrinen oder juxtacrinen Faktoren sowie transkriptionellen oder anderen regulatorischen Proteinen ermöglicht. mRNA-Pools wurden in Xenopus-Eizellen injiziert und das reagierende Gewebe direkt auf die Eizellen aufgesetzt und co-kultiviert. Nach der funktionellen Klonierung von ldb1 aus einer cDNA-Bibliothek im Neuralplattenstadium basierend auf seiner Fähigkeit, die Expression des frühen Linsenplacode-Markers foxe3 in linsenkompetenten tierischen Kapektodermen hervorzurufen, charakterisierten wir das mRNA-Expressionsmuster und untersuchten die Entwicklungsprogression nach Überexpression oder Knockdown von ldb1. Dieses System eignet sich für eine Vielzahl von Kontexten, in denen die Identifizierung eines Induktors oder seiner vorgeschalteten regulatorischen Moleküle anhand einer funktionellen Reaktion in kompetentem Gewebe angestrebt wird.

Introduction

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Vorausschauende genetische Ansätze zur Identifizierung von Genen von Interesse durch ihre Funktion oder ihren Funktionsverlust1,2 sind ein integraler Bestandteil des Verständnisses komplexer Musterereignisse in der Entwicklung. In Verbindung mit leistungsstarken reversen genetischen Techniken, die einem immer breiteren Spektrum von Systemen und Forschern zur Verfügung stehen3-5, ist es nun möglich, Gene mit einer wichtigen funktionellen Rolle in einem Signalweg zu identifizieren und diese Funktion dann auf zellulärer Ebene und in Interaktion mit anderen Genprodukten aufzuklären. Ein Ansatz zur funktionellen Identifizierung von Genen von Interes....

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Protocol

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Alle experimentellen Verfahren wurden von der University of Virginia Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die experimentellen Verfahren.

1. Herstellung von Oozyten

  1. Pre-prime X. laevis Weibchen mit 150 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) etwa eine Woche im Voraus über Eizelle Isolation. Injizieren Sie 1 ml 150 U / ml PMSG in Rücken Lymphsack mit 1 cc sterile Spritze mit 29 G-Nadel.
  2. Bereiten Sie Lösungen für Oocyteninjektion und Oozyten-Tierkappe A....

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Results

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Als Reaktion auf die Expression von mRNA in Oozyten injiziert und reagiert animal cap-Gewebe wurde für die Expression von OTX2 durch in situ-Hybridisierung (Figur 2 und Tabelle 1) untersucht; OTX2 wird in der mutmaßlichen Linsen Ektoderm (PLE) aus Neuralrohrschlusses durch Linsenplakode exprimiert Verdickung 19. Da jedoch OTX2 ist auch in der vorderen neuronalen Ektoderm sowie nichtneuralen Kopf Ektoderm außerhalb des PLE au.......

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Discussion

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Die für die funktionale Klonierung von Genen in der Lage, eine Antwort in kompetente Ektoderm Induzieren hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Genprodukten zu identifizieren. Diese Methode baut auf früheren Arbeiten durch die Kombination von Gewebe-induzierende Assays mit Ausdruck Klonierungstechniken. Wir nutzen die Stoffwechselwege des Xenopus-Oozyten als Quelle der Erzeugung von induzierende Faktoren, die direkt oder indirekt folgende RNA-Injektion. Dies in Kombination mit d.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch ein Professional Development Grant an C.Z.P. von der Shepherd University Foundation unterstützt. Die Autoren danken Brett Zirkle und Malia Deshotel für die hilfreichen Diskussionen über die Protokolle und Dr. Carol Hurney für die großzügige Unterstützung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12/101Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank12/101Monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Muskelgewebe
20x SSC BufferSigmaS6639für ISH
EssigsäureanhydridSigmaA6404für ISH
Anti-Dig-APRoche11093274910für ISH
Aurum Plasmid Mini KitBio-Rad732-6400Aufreinigung von Plasmid-DNA
BlockierungsreagenzRoche11096176001für ISH
BM PurpleRoche11442074001für ISH
Boekel HybridisierungsofenFisher Scientific13-245-121für ISH
Bouin's SolutionSigmaHT10132für ISH
BSASigmaA9647für OCM
CHAPSSigmaC3023für ISH
Kollagenase ARoche10103578001Defollikulation von Eizellen
CysteinSigmaC121800Dejelly Embryonen
DEPC-H2OFisher ScientificBP5611für ISH
Dig-RNA Labeling MixRoche11277073910für ISH-Sonden
Dumont #5 PinzettenWorld Precision Instruments500233für Vitellline Envelope Entfernung
Ethyl-3-aminobenzoatSigmaA5040MS222 Anästhetikum
Ficoll PM 400SigmaF4375für Injektionsmedien
FormamidSigmaF9037für ISH
GentamicinsulfatSigmaG1914für OCM
GlaskapillarenWorld Precision Instruments48783,5" lang, I,D, 0,530 mm
Probenfläschchen aus GlasFisher Scientific06-408Bfür ISH
Hair LoopIn einer Pasteurpipette für die Gewebemanipulation befestigtes Haar
Heparin-NatriumsalzSigmaH4784für ISH
Injector Nanoliter 2010World Precision InstrumentsNanoliter 2010Mikroprozessorgesteuerter Mikroinjektor
Instant OceanCarolina972433Aquarium Salt for Frog
Recovery IRBG XGC Xenopus verifizierte Cam cDNA-Quelle in voller LängeBioscience989_IRBGcDNA-Bibliothek 
LB Agar Platten mit 100 & Mikro; g/ml AmpicillinTeknovaL5004150 mm vorgegossene LB-Amp Platten für die Geschwisterauswahl
LB LuriaBroth TeknovaL8650LB für die Entnahme von Kolonien in der Geschwisterauswahl aus Platten und Verdünnung von Kulturen
Magnetisches mRNA Isolation KitNew England BioLabsS1550Sfür die Isolierung von poly(A)-angereicherter RNA
MaleinsäureSigmaM0375für ISH
Manueller Microfil MikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3310RManueller Mikromanipulator
Nutating MixerFisher Scientific22-363-152Wippe für ISH
PermoplastNascoSB33495MTon für Injektions- und Sezierschalen
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigmaP5368für ISH
PMSGSigmaG4877zur Stimulierung der Eizellentwicklung
PolyvinylpyrrolidonSigmaPVP40für ISH
Programmable PullerWorld Precision InstrumentsPUL-1000Mikropipette Nadelabzieher
Proteinase KSigmaP6556für ISH
pTnT VektorPromegaL5610cDNA-Bibliotheksbau
Riboprobe Combination SystemPromegaP1450in vitro Transkription
Hochgestelltes cDNA-Bibliotheksbauset in voller LängeLife Technologies18248013-Kit für den Bau von cDNA-Bibliotheksnähten
, 3-0 SeideFisher Scientific19-037-516Nahtfaden und Nadel für die Entfernung nach der Eizelle
Torula RNASigmaR3629für ISH
TriethanolaminSigmaT1502für ISH
Tween 20SigmaP9416für ISH
Universal RiboClone cDNA SynthesesystemPromegaC4360alternatives Kit für den Aufbau von cDNA-Bibliotheken
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome CollaborationSource Bioscience5055_XenORFeomeORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent CellsAgilent Technologies200150Zellen für die Transformation von cDNA Bibliothek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R.

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Tags

Xenopus Oocyte Expression SystemAnimal Cap AssayFunctional CloningmRNA InjectionEmbryonic InductionLens Placode MarkerIn Situ HybridizationOocyte IsolationTissue RecombinationDevelopmental Biology

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