Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex (RSC) der Maus unter Verwendung von in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Mauslinie Thy1-GFP ermöglicht. Dieser Ansatz schafft die Möglichkeit, den Zusammenhang von Verhaltensmanipulationen mit Veränderungen in der neuronalen Morphologie in vivo zu untersuchen.

Das Verfahren zur Implantation von Schädelfenstern wurde als nur auf die leicht zugänglichen Kortexregionen wie das Fassfeld beschränkt. Unser Ansatz ermöglicht die Visualisierung von Neuronen im stark vaskularisierten RSC. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirnschaltkreises, das für das räumliche Gedächtnis verantwortlich ist und bisher als problematisch für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung galt.

Die Schädelfensterimplantation über dem RSC wird mit einer Injektion des mCherry-exprimierenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV^mCherry) in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Die exprimierte mCherry breitet sich auf axonale Projektionen vom Hippocampus bis zum RSC aus und ermöglicht so die Visualisierung von Veränderungen sowohl in präsynaptischen axonalen Boutons als auch in postsynaptischen dendritischen Dornen im Kortex.

Diese Technik ermöglicht die Langzeitüberwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Einleitung

Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo ^1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen - Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftli....

Protokoll

Alle nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von lokalen Ethikkommission am Nencki Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften genehmigt.

Hinweis: Einige der Szenen in dem zugehörigen Video beschleunigt werden. Drehzahlfaktor wird in diesen Szenen angezeigt.

1. Eine Operation Vorbereitung

1. Sterilisieren alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Verwenden entbehrlich Handschuhe. Reinigen Sie den OP-Tisch, die Stereotaxierahmen und die ganze Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile OP-Pad einen sterilen....

Ergebnisse

Die Expression von GFP in einer Untergruppe von Neuronen im Thy1-GFP reporter Maus in vivo Abbildung der kortikalen Dendriten und lokale axonale Projektionen in RSC ermöglicht. 1A zeigt maximale Projektion eines Stapels von Bildern mit mehreren GFP-positive Dendriten erkennbar. Der Zellkörper wird durch eine Arterie verdeckt. 1B zeigt eine einzige Ebene vergrößerte Bild (Digitalzoom 3x) der dendritischen Verzweigung in 1A angegeben. Details von .......

Diskussion

In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen - in - vivo - Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt wird. Nachde.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Drug
Isofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% präoperativ
Isofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% während der Operation
Dexametason	Scan Vet	Dexason 2mg/ml	0,2 mg/kg intramuskulär
Baytril	Bayer	2,50	5 mg/kg subkutan
Tolfedin	, Vetoquinol	4%	4 mg/kg subkutan,
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subkutan,
Carprofen	KRKA-Polska,	Rycarfa 50mg/ml,	10 mg/kg subkutan,
Lidocain	Jelfa	Lignocainum	topisch
Lidocain	Jelfa	20 mg/g
Chirurgie
Gelfoam	Ethicon	Spongostan Dental; REF MS0005
Augensalbe	Dedra	Lubrithal	topisch
CA Kleber	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental Acryl	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaktischer Rahmen	Stoelting	51500D
Tool
Deckglas	Harvard Gerät	HSE-64-0720	mit 3 mm Durchmesser
	Sigmed	Keystone KVet
Fixierstange	Sonderanfertigungen	N/A M2	oder M3 Schraubenmuttern könnten verwendet werden
Pinzette	Renex	PN-7B-SA
Mikroschere	Falcon	BM.183.180
Dissektionsmikroskop	KOZO	XTL6445T
ImagingHolder-Rahmen
	Sonderanfertigung	N/A
Zwei-Photonen-Mikroskop	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Lasereinheit: Coherent Chameleon 690-1040nm mit optischem parametrischem Oszillator 1050-1300nm. Objektive: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 und LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detektion: Zeiss Bandpassfilter BP 500-550 (GFP) und BP 570-610 (mCherry) getrennt durch Strahlteiler bei 560nm und gekoppelt an zwei GaAsP Photodetektoren.
Reagenz
	exprimiert

%, Dentalbohrer Virus-Geschenk von K. Deisseroth Rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV), das das fluoreszierende Protein mCherry unter der Kontrolle des CaMK-Promotors