Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex (RSC) der Maus unter Verwendung von in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Mauslinie Thy1-GFP ermöglicht. Dieser Ansatz schafft die Möglichkeit, den Zusammenhang von Verhaltensmanipulationen mit Veränderungen in der neuronalen Morphologie in vivo zu untersuchen.

Das Verfahren zur Implantation von Schädelfenstern wurde als nur auf die leicht zugänglichen Kortexregionen wie das Fassfeld beschränkt. Unser Ansatz ermöglicht die Visualisierung von Neuronen im stark vaskularisierten RSC. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirnschaltkreises, das für das räumliche Gedächtnis verantwortlich ist und bisher als problematisch für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung galt.

Die Schädelfensterimplantation über dem RSC wird mit einer Injektion des mCherry-exprimierenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV^mCherry) in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Die exprimierte mCherry breitet sich auf axonale Projektionen vom Hippocampus bis zum RSC aus und ermöglicht so die Visualisierung von Veränderungen sowohl in präsynaptischen axonalen Boutons als auch in postsynaptischen dendritischen Dornen im Kortex.

Diese Technik ermöglicht die Langzeitüberwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Einleitung

Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo ^1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen - Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftlichen Welt als neuer Standard für die Umsetzung in vivo Bildgebung des Gehirns.

Der Standardansatz beinhaltet die Implantation des Schädelfenster (ein rundes Loch in den Schädel mit einem Deckglas bedeckt) über den Lauf oder visuellen Kortex des Gehirns von Mäusen ^3. Als nächstes wird in Abhängigkeit von der Versuchsprotokoll, das mouse durchläuft eine Reihe von Visualisierung und Verhaltenstrainingseinheiten, so dass die Veränderungen in der Hirnaktivität und die neuronale Morphologie über ^4,5 Zeit zu überwachen. In beiden Fällen wirkt sich die Kraniotomie nur den Scheitelbein, ohne die Nähte kreuzen. Es wird weitgehend angenommen, dass der Hauptnachteil der Technik leicht zugänglich Cortex wie der Lauf oder Sehrinde seine begrenzte Anwendung. Implantieren des kranialen Fenster über anderen Regionen stellt eine Menge Schwierigkeiten, aufgrund einer übermäßigen Blutungen und / oder räumliche Hinderung.

In dieser Arbeit schlagen wir vor der Implantation des kranialen Fenster über dem retrosplenialen cortex (RSC) als weitere mögliche interessierende Region für die Zwei-Photonen - Mikroskopie in vivo ^6. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirns Schaltung verantwortlich für die räumliche Gedächtnisbildung. Anatomisch ist RSC ein Teil eines neuronalen Netzes verbindet cortical, hippocampalen und thalamischen Regionen ^7. Es istin einer Reihe von Verhaltensweisen, wie räumliches Lernen und Extinktion sowie räumliche Navigation ⁶ stark beteiligt.

Um die morphologischen Veränderungen der Neuronen zu visualisieren verwenden wir eine transgene Mauslinie, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der THY1 Promotor. Bei diesen Mäusen GFP wird in etwa 10% der Neuronen im Gehirn ermöglicht eine klare Visualisierung der kortikalen Axonen und Dendriten mit Zwei-Photonen - Mikroskopie ⁸ ausgedrückt. Eine weitere Neuerung , die wir vorschlagen , ist die Injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus - Serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) Codieren eines rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter einer neuron-spezifischen Promotor CaMKII ⁹ in die tieferen Strukturen des Gehirns RSC Projizieren wie dem Hippocampus. Die Expression von rAAV2 / 1 ^mCherry im Hippocampus von Thy1-GFP - Maus ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von prä- und postsynaptischen Elemente der Hippocampo-cortical Synapsen ^10. Die rAAV-gesteuerte Expression von mCherry erfordert zwei bis drei Wochen für das Protein ausreichendes Niveau in den axonalen Terminals zu erreichen. Diese Frist ist mit der üblichen Zeitaufwand für die Wiederherstellung von Craniotomie konsistent.

Protokoll

Alle nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von lokalen Ethikkommission am Nencki Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften genehmigt.

Hinweis: Einige der Szenen in dem zugehörigen Video beschleunigt werden. Drehzahlfaktor wird in diesen Szenen angezeigt.

1. Eine Operation Vorbereitung

1. Sterilisieren alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Verwenden entbehrlich Handschuhe. Reinigen Sie den OP-Tisch, die Stereotaxierahmen und die ganze Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile OP-Pad einen sterilen Raum für alle sterilisierten Ausrüstung zu schaffen. Schneiden Sie Gelfoam in kleine Stücke und genießen sie in steriler Kochsalzlösung.
   Hinweis: Nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Ethanol ist weder ein Sterilisierungsmittel noch ein High-Level-Desinfektionsmittel. Es sollte nur als Reinigungs- / Entfettungsmittel auf zuvor sterilisierten Oberflächen verwendet werden.
2. Legen Sie das Tier in the Induktionskammer und stellen Sie die Isofluran-Ebene auf 5% und Sauerstoffstrom auf 2 l / min. Dieses Verfahren sollte ca. 3 Minuten dauern.
3. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer. Verwenden Schwanz oder Zehen kneift, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert.
4. Mit Hilfe eines präzisen Trimmer das Haar von der Rückseite des Kopfes (zwischen den Ohren) bis zu den Augen rasieren.
5. Legen Sie das Tier in der Stereotaxierahmen und stabilisieren den Kopf mit Ohr-Bars.
6. Set Anästhesie Ebenen 1,5-2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff.
7. Tragen Sie die Augensalbe.
8. Injizieren das Tier subkutan mit Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) und Baytril (5 mg / kg) Entzündung, Schmerz und Infektion zu verhindern, respectively.
9. Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason (0,2 mg / kg) Schwellung des Gehirns zu verhindern.
   Hinweis: Es ist möglich , Dexamethason subkutan zu injizieren oder intraperitoneal Muskelschäden zu verhindern.
10. Reinigen Sie die Haut mit sterile Wattestäbchen mit Betadine um 70% Ethanol.
11. Ändern Sie die Handschuhe und sprühen sie mit 70% Ethanol.
    Hinweis: Während der Einmalhandschuhe verwenden nicht das sterile Feld berühren. Berühren Sie das Tier nur mit den Spitzen der sterilen chirurgischen Instrumenten und sterilen Tupfer.

2. Cranial Fenster Chirurgie

1. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und mit Mikro Schere, um die Haut horizontal entlang der Basis des Kopfes einzuschneiden und dann schräg nach vorne Punkt zwischen den Augen. Entfernen Sie die Hautlappen.
2. Bewerben Lidocain Salbe mit einem sterilen Tupfer auf die Knochenhaut übermäßigen Blutungen und Schmerzen zu verhindern.
3. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen oder einem Skalpell das Periost zu entfernen. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Tupfer.
4. Mit Anwendung einer sterilen Nadel dicht Sekundenkleber auf die Hautränder sie zu immobilisieren und aus dem Kontakt mit Zahnzement zu verhindern. Warten Sie auf den Leim trocknen.
5. Legen Sie eine sterile 3 mm Deckglas über ter Schädel nach vorn auf die Lambdanaht. Zentrieren Sie das Deckglas an RSC-Koordinaten: AP, Bregma -2,8; ML, Bregma 0. Markieren Sie die Deck Kanten durch die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel zu kratzen. Legen Sie das Deckglas wieder in den sterilen Behälter mit 70% Ethanol.
6. Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit kleinem Durchmesser Grat mit einem 3 mm Durchmesser-Kreis zu skizzieren. Reinigen Sie die Bohrstelle aus dem Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung getaucht Tupfer. Verwenden Sie die Gelfoam und Tupfer die gelegentliche Blutungen zu stoppen und den Knochen zu reinigen.
7. Dazwischen Bohrungen überprüfen Sie die Knochendicke mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Knochen Kreis berühren und seine Beweglichkeit zu prüfen. Denken Sie daran, dass der Knochen auf der Naht der Bereich dicker ist. Stoppen Sie die Bohrung, wenn der Knochen Kreis ist mobil und nur eine gleichmäßige, wird dünne Schicht von Knochen auf dem Umfang links. Reinigen Sie das Operationsfeld aller verbleibenden Knochenstaub mit Kochsalzlösung getaucht Tupfer.
8. Löschen Sie die sterile Kochsalzlösung auf der Bohrstelle, für den gebohrten circle. den Knochen Kreis mit einer feinen Pinzette vorsichtig hebeln und dann vorsichtig, aber fest den Knochen entfernen, indem Sie ihn nach oben zu heben. Achten Sie darauf, nicht die Knochen Kreis zu neigen, während sie heben eine mögliche Beschädigung der Dura zu verhindern.
9. gelten vorsichtig die Gelfoam in steriler Kochsalzlösung auf die Dura getränkt, um die Blutung zu stoppen. Warten Sie, bis alle Blutung vollständig gestoppt wird. Entfernen Sie vorsichtig den Gelfoam nicht den Gerinnungsprozess zu stören.
   Hinweis: Die Nahtbereich gefäß ist, so dass die an dieser Stelle Blutungen könnte sich tiefgründig zu sein. Es ist wichtig, für die genügend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig zu stoppen. Es ist hilfreich, die Kochsalzlösung getränkten Gelfoam, indem sie auf Eis gestellt gekühlt zu halten.

3. Virus Injection

1. Bringen Sie die Infusionspumpe mit dem stereotaktischen Turm und den Controller angeschlossen werden.
2. Legen Sie die 35G Nadel in die Spritze. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol um sie zu sterilisieren und 10 mal mit steriler Kochsalzlösung zu entfernen Spuren von ethanol. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze. Legen Sie die Spritze in die Pumpe.
   Hinweis: Stellen Sie sich andere Desinfektionsmittel verwenden.
3. Tauen Sie eine Einzeldosis von rAAV2 / 1 ^mCherry Vorbereitung (10 ¹² pfu wird empfohlen) und halten Sie sie auf Eis. Füllen Sie die Spritze mit der Virus-Lösung.
4. Zentrieren Sie die Nadel auf dem Bregma und dann sanft in den Hippocampus fügen Sie die folgenden Koordinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Diese Koordinaten werden in der Nähe der Kante der Kraniotomie befinden. Warten Sie 5 Minuten für das Gewebe zu stabilisieren.
5. Injizieren 0,7 ul der rAAV2 / 1 ^mCherry Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 nl / min. Warten Sie 10 min für das Virus vollständig zu adsorbieren. Sie vorsichtig die Nadel entfernen. Blot mit Gelfoam wenn die Blutung auftritt. Wiederholen Sie mit dem kontralateralen Seite.

4. Cranial Fenster Implantierung

1. Legen Sie das sterile, getrocknete Deckglas auf der Oberseite der Dura in dem gebohrten Kreis Rahmen. Halten Sie das Deckglas mit dem forceps die Dura zu sanft flach und bringen Abdeckglas 'Kanten an die Schädeloberfläche näher.
   Hinweis: Es ist möglich , dass das Deckglas das Gerinnsel stört und die Blutung wird fortgesetzt. Wenn das der Fall ist, heben Sie den Deckglas, legen Sie sie in Alkohol, trocken und Rückkehr 2.9 zu treten.
2. eine sterile Nadel gelten die dichte Sekundenkleber auf den Abdeckglas Kanten Mit ihnen auf den Schädel zu befestigen. Warten Sie auf den Leim trocknen.
3. Legen Sie eine Befestigungsstange (M2 Mutter oder eine Sonderanfertigung) im vorderen Teil des Schädels. Tragen Sie die Sekundenkleber über die Ränder des Balkens. Warten Sie auf den Leim trocknen.
   1. Legen Sie die Befestigungsleiste in einer Position, die horizontale Positionierung des Schädelfenster während der Bildgebungssitzung ermöglicht. Stellen Sie sie so weit entfernt wie möglich aus dem Fenster. Wenn es um das Fenster zu schließen platziert wird, die Bar und die Schraube mit dem maßgeschneiderten Halter verbinden könnte als ein Hindernis für das Ziel während des Abbildungsprozesses darstellen.
4. Bereiten Sie die Dentalacryl und wenden es auf der Schädeloberfläche um das Glas. Es ist hilfreich, um das Fenster eine kraterartige Form zu bilden. Es wird einen Hohlraum zum Wasser schaffen später für die Bildgebung mit dem Wasser Ziel angewandt.
5. Erstellen Sie eine Kappe mit dem Dentalacryl, für den Rest des operativen Bereich Hautränder, Fixierung Bar, den Krater um die Schädelfenster verstärken. Warten, bis der Zahnzement zu härten.
6. Nehmen Sie das Tier aus dem Stereotaxierahmen und steckte es in die Auffangkammer.
7. Warten, bis das Tier von der Operation erholen, während die physiologischen Funktionen zu beobachten.
8. Anwenden postoperative Analgesie (Carprofen, 10 mg / kg) und Antibiotika-Behandlung (Baytril, 5 mg / kg) für 48 Stunden.

5. Imaging

1. Starten Sie den Ti: Saphir-Laser, Macht das Mikroskop auf. Das System in diesem Experiment verwendet wird mit einem Zwei-Photonen-Laser, OPO System und Dual GaAsP PMT ausgestattet.
2. Legen Sie das Tier in der INDUCtion Kammer und Anästhesie zu induzieren.
3. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und in der Gasnarkosemaske unter dem Mikroskop. Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 l / min und die Isofluran-Konzentration auf 1,5 bis 2%.
4. Befestigen Sie das Tier auf dem benutzerdefinierten Mikroskop Rahmen mit einem M2 Schraube (oder einem anderen benutzerdefinierten System). Richten Sie die Schädelfenster.
   Hinweis: Es ist möglich , die Mikroskophersteller Kopf Fixationssystem zu verwenden, obwohl die spezifische benutzerdefinierte Rahmen zu besseren Ergebnissen führt (verbesserte Kopfstabilität, konstante Positionierung in mehreren Sitzungen während einer chronischen Experiment).
5. Mit Hilfe der Weitfeld-Mikroskop-Einstellungen und eine geringe Vergrößerung Ziel Zentrum der Blick auf eine der Seiten von retrosplenialen Kortex und fokussieren es auf der Deckfläche.
6. Tragen Sie einen Tropfen Wasser in die kraterartigen Acryl gut. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv lange Strecke. Bewegen Sie das Ziel in Richtung Schädelfenster, bis der Wassermeniskus conConnects der Probe und Ziel.
7. Wechseln Sie in den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Scannen der Probe von oben nach unten niedrigsten Zoom verwendet wird. Die Überquerung der Dura mater wird als Blendung von hohen unspezifischen Signal sichtbar sein.
8. Passen Sie die Mikroskop Erwerb Einstellungen in beiden Kanälen (GFP und mCherry) entsprechend der Signalstärke von fluoreszierenden Zellen, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken.
9. ein geeignetes Neuron (mit dendritischen Baum von anderen Zellen getrennt) führen einen ersten Scan nur mit der GFP filterset mit dem niedrigsten Zoom und z-Abstand von 5 Mikrometer Nach dem Auffinden.
10. Besorgen Sie sich einen maximalen Vorsprung des gescannten Stapel und drucken Sie es für Anmerkungen (invertierten Farben verwenden).
11. Stellen Sie Zoom auf einen Wert, der die gewünschten morphologischen Details Bild ermöglicht. Bild der gesamten dendritischen Baum in den GFP und mCherry Kanäle mit maximaler Projektion als Führer.

Ergebnisse

Die Expression von GFP in einer Untergruppe von Neuronen im Thy1-GFP reporter Maus in vivo Abbildung der kortikalen Dendriten und lokale axonale Projektionen in RSC ermöglicht. 1A zeigt maximale Projektion eines Stapels von Bildern mit mehreren GFP-positive Dendriten erkennbar. Der Zellkörper wird durch eine Arterie verdeckt. 1B zeigt eine einzige Ebene vergrößerte Bild (Digitalzoom 3x) der dendritischen Verzweigung in 1A angegeben. Details von ...

Diskussion

In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen - in - vivo - Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt wird. Nachde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Drug
Isofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% präoperativ
Isofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	1,5-2% während der Operation
Dexametason	Scan Vet	Dexason 2mg/ml	0,2 mg/kg intramuskulär
Baytril	Bayer	2,50	5 mg/kg subkutan
Tolfedin	, Vetoquinol	4%	4 mg/kg subkutan,
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subkutan,
Carprofen	KRKA-Polska,	Rycarfa 50mg/ml,	10 mg/kg subkutan,
Lidocain	Jelfa	Lignocainum	topisch
Lidocain	Jelfa	20 mg/g
Chirurgie
Gelfoam	Ethicon	Spongostan Dental; REF MS0005
Augensalbe	Dedra	Lubrithal	topisch
CA Kleber	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental Acryl	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaktischer Rahmen	Stoelting	51500D
Tool
Deckglas	Harvard Gerät	HSE-64-0720	mit 3 mm Durchmesser
	Sigmed	Keystone KVet
Fixierstange	Sonderanfertigungen	N/A M2	oder M3 Schraubenmuttern könnten verwendet werden
Pinzette	Renex	PN-7B-SA
Mikroschere	Falcon	BM.183.180
Dissektionsmikroskop	KOZO	XTL6445T
ImagingHolder-Rahmen
	Sonderanfertigung	N/A
Zwei-Photonen-Mikroskop	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Lasereinheit: Coherent Chameleon 690-1040nm mit optischem parametrischem Oszillator 1050-1300nm. Objektive: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 und LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detektion: Zeiss Bandpassfilter BP 500-550 (GFP) und BP 570-610 (mCherry) getrennt durch Strahlteiler bei 560nm und gekoppelt an zwei GaAsP Photodetektoren.
Reagenz
	exprimiert

%, Dentalbohrer Virus-Geschenk von K. Deisseroth Rekombinantes Adeno-assoziiertes Virus (rAAV), das das fluoreszierende Protein mCherry unter der Kontrolle des CaMK-Promotors