Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.
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Methodenartikel
Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Phosphoinositiden (PtdInsPs) sind essentielle Signallipide, die für die Rekrutierung spezifischer Effektoren und die Verleihung von Organellen mit molekularer Identität und Funktion verantwortlich sind. Jedes der sieben PtdInsPs variiert in seiner Verteilung und Häufigkeit, die durch spezifische Kinasen und Phosphatasen streng reguliert werden. Die Häufigkeit von PtdInsPs kann sich als Reaktion auf verschiedene Signalereignisse oder Störungen der Regulationsmaschinerie abrupt ändern. Um zu verstehen, wie diese Ereignisse zu Veränderungen in der Menge von PtdInsPs und den daraus resultierenden Auswirkungen führen, ist es wichtig, die PtdInsP-Spiegel vor und nach einem Signalereignis oder zwischen Kontrolle und abnormalen Bedingungen zu quantifizieren. Aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und Ähnlichkeit kann es jedoch schwierig sein, die relativen Mengen der einzelnen PtdInsP zu quantifizieren. In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung des PtdInsP-Spiegels beschrieben, indem Zellen metabolisch mit 3H-Myo-Inositol markiert werden, das in PtdInsPs eingebaut wird. Anschließend werden die Phospholipide ausgefällt und deacyliert. Die dabei entstehenden löslichen3-H-Glycero-Inositide werden weiter extrahiert, mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) abgetrennt und durch Fließszintillation detektiert. Die Markierung und Verarbeitung von Hefeproben wird ausführlich beschrieben, ebenso wie der instrumentelle Aufbau für die HPLC und den Durchflussszintillator. Trotz des Verlusts struktureller Informationen über den Gehalt an Acylketten ist diese Methode sensitiv und kann so optimiert werden, dass alle sieben PtdInsPs in Zellen gleichzeitig quantifiziert werden können.
Einleitung
Phosphoinositiden (PtdInsPs) sind wichtige Signal-Phospholipide, die helfen, eine Vielzahl von zellulären Funktionen zu regulieren, einschließlich Signaltransduktion, Membrantransport und Genexpression, die dann Zellverhalten höherer Ordnung wie Zellteilung, Organellenidentität und Stoffwechselaktivität modulieren1-3. Es gibt sieben Arten von PtdInsPs, die aus der Phosphorylierung der 3-, 4- und/oder 5-Positionen der Inositol-Kopfgruppe von Phosphatidylinositol (PtdIns), dem Ausgangsphospholipid, abgeleitet sind. Wichtig ist, dass die sieben PtdInsPs ungleich verteilt sind und die lokale Konzentration jeder PtdInsP-Spezies an spezifischen subzellulären Stel....
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Protokoll
Hinweis: Der Text beschreibt ausführlich ein Verfahren zur PtdInsPs in Hefe zu messen. Es stellt die experimentellen Einzelheiten für die Kennzeichnung Hefezellen mit 3 H- myo-Inositol, Extrahieren und Deacylieren Lipiden und einer HPLC-Elution Protokoll zu fraktionieren und zu quantifizieren deacylierten PtdInsPs. Bitte beachten Sie, dass Kennzeichnung, Deacylierung, Auflösung und Quantifizierung von PtdInsPs in Säugerzellen erfordern Optimierung und mehr HPLC-Elutionsprofile. Diese Details können an anderer Stelle gefunden werden kann, obwohl wir einige Aspekte in der Diskussion zu diskutieren. Insgesamt ist die Methodik, um Lipide zu deacyliere....
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Ergebnisse
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Hefe PtdInsPs metabolisch mit 3 H-myo-Inositol-markiert. Nach der Markierung wurden die Phospholipide mit Perchlorsäure ausgefällt, gefolgt von Deacylierung Phospholipid und die Extraktion der wasserlöslichen Gro-InsPs (Abbildung 1). In dieser Phase ist es wichtig, die gesamte radioaktives Signal mit dem extrahierten Gro-InsPs durch Flüssigszintillationszählung zu quantifizieren, um eine ausreichende Signal-zu.......
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Diskussion
Dieser Artikel beschreibt die experimentelle Protokoll erforderlich, um Zellebenen PtdnsPs durch HPLC-gekoppelten Strömungs Szintillations aus Hefe zu quantifizieren. Die Methodik ermöglicht die metabolische Markierung von PtdInsPs mit 3 H- myo-Inositol, gefolgt von Lipid Aufarbeitung und Extraktion von wasserlöslichen 3 H-Gro-InsPs, HPLC-Fraktionierung und Analyse. Mit dieser Methode können die relativen Mengen an PtdInsPs in Zellen unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden, wi.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
C.Y.H. wurde durch ein Ontario Graduate Scholarship der Regierung von Ontario unterstützt. Dieser Artikel wurde ermöglicht durch die Finanzierung von R.J.B. vom Natural Sciences and Engineering Research Council, dem Canada Research Chairs Program und der Ryerson University.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagenzqualität |
| Ammoniumphosphat dibasisch | Bioshop | APD001 | |
| Ammoniumsulfat | ACS-Qualität | Biobasic | Ultra Pure |
| Grade Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Borsäure | Biobasic | BB0044 | Calciumchlorid in molekularbiologischer Qualität |
| Biobasic | CT1330 | Wasserfreies, industrielles | |
| Calciumpantothenat | Sigma | C8731 | |
| Kupfer(II)-sulfat | Sigma | 451657 | wasserfrei |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | wasserfrei, Biotech-Qualität |
| Dulbecco-Modifikation von Eagle's Medium | Life | 11995-065 | Mit 4,5 g/L Glukose, 110 mg/L Pyruat, L-Glutamin |
| Dulbeccos Modifikation von Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | Mit 4,5 g/L Glukose, ohne L-Gluatmin, ohne Inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Säurefreier, ultrareiner |
| Ethylether | Caledon Labs | 1/10/4700 | Wasserfreies, reagenzisches |
| Ethylformiat | Sigma | 112682 | Reagenzqualität |
| Fötales Rinderserum | Wisent | 080-450 US-Herkunft | , Premium-Qualität, hitzeinaktiviertes |
| fötales Rinderserum, dialysiertes | Leben | 26400044 | USA Herkunft |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Szintillationsflüssigkeit für die Strömungsszintillation |
| Folsäure | Biobasisch | FB0466 | in USP-Qualität |
| Lebensdauer | 15630080 | 1 M Lösung | |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 Ethanol zu Wasser |
| Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin | Lebensdauer | 51500056 | 100x Lösung |
| Eisen(III)-chlorid | Sigma | 157740 | Reagenz |
| class Laura - Software zur Erfassung und Analyse von Chromatographie-Daten | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Software für Durchflussszintillatoren |
| L-Glutamin | Sigma | G7513 | 200 mM, Lösung, sterilfiltriert, BioXtra, geeignet für Zellkulturen |
| Magnesiumchlorid | Sigma | M8266 | Wasserfreies |
| Mangansulfat | Biobasic | MB0334 | Monohydrat, ACS-Qualität |
| Methanol | Caledon Labs | 6701-7-40 | HPLC-Qualität |
| Methylaminlösung | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monokaliumphosphat | Biobasic | PB0445 | Wasserfrei, Nikotinsäure in ACS-Qualität |
| Biobasic | NB0660 | in Reagenzqualität | |
| Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC-Software | |
| p-Aminobenzoesäure (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Freie Säure |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, flüssig, stabilisiert, sterilfiltriert, zellkulturgeprüft |
| Perchlorsäure | Sigma | 244252 | ACS Reagenz, 70% |
| PhenoSpher SAX Säule | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µ m, 80 Å, 250 x 4,6 mm |
| Phosphorsäure | Caledon Labs | 1/29/8425 | in Reagenzqualität |
| Biobasisch | PB0440 | Kaliumiodid in ACS-Qualität | |
| Biobasic | PB0443 | ACS-Qualität | |
| Sigma | P9755 | ||
| Quaternäre Pumpe | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity Serie |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | |
| USP Qualität Natriumchlorid | Biobasic | DB0483 | |
| Biotech Qualität Natriummolybdat | Sigma | 243655 | |
| thermostatisiertes Säulenfach | Agilent | G1316A | Agilent 1260 unendlich Serie |
| Thiaminhydrochlorid | Sigma | T4625 | Qualität der Reagenzien; Machen Sie eine Lösung von 0,02 % (w/v) und bildet eine Suspension. Mischen und Einfrieren von Aliquoten |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Szintillationscocktail für die Flüssigszintillationszählung |
| Zinksulfat | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrat, Reagenzqualität |
| β-RAM 4 | IN/US-Systeme | Modell 4 | Durchfluss-Szintillator - 500 & Mikro; l Durchflusszelle; alternativer radiomatischer Durchfluss-Szintillator-Analysator von Perkin Elmer |
Referenzen
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
