Methodenartikel

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

DOI:

10.3791/53529

⸱

6. Januar 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phosphoinositiden (PtdInsPs) sind essentielle Signallipide, die für die Rekrutierung spezifischer Effektoren und die Verleihung von Organellen mit molekularer Identität und Funktion verantwortlich sind. Jedes der sieben PtdInsPs variiert in seiner Verteilung und Häufigkeit, die durch spezifische Kinasen und Phosphatasen streng reguliert werden. Die Häufigkeit von PtdInsPs kann sich als Reaktion auf verschiedene Signalereignisse oder Störungen der Regulationsmaschinerie abrupt ändern. Um zu verstehen, wie diese Ereignisse zu Veränderungen in der Menge von PtdInsPs und den daraus resultierenden Auswirkungen führen, ist es wichtig, die PtdInsP-Spiegel vor und nach einem Signalereignis oder zwischen Kontrolle und abnormalen Bedingungen zu quantifizieren. Aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und Ähnlichkeit kann es jedoch schwierig sein, die relativen Mengen der einzelnen PtdInsP zu quantifizieren. In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung des PtdInsP-Spiegels beschrieben, indem Zellen metabolisch mit 3H-Myo-Inositol markiert werden, das in PtdInsPs eingebaut wird. Anschließend werden die Phospholipide ausgefällt und deacyliert. Die dabei entstehenden löslichen3-H-Glycero-Inositide werden weiter extrahiert, mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) abgetrennt und durch Fließszintillation detektiert. Die Markierung und Verarbeitung von Hefeproben wird ausführlich beschrieben, ebenso wie der instrumentelle Aufbau für die HPLC und den Durchflussszintillator. Trotz des Verlusts struktureller Informationen über den Gehalt an Acylketten ist diese Methode sensitiv und kann so optimiert werden, dass alle sieben PtdInsPs in Zellen gleichzeitig quantifiziert werden können.

Einleitung

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Phosphoinositiden (PtdInsPs) sind wichtige Signal-Phospholipide, die helfen, eine Vielzahl von zellulären Funktionen zu regulieren, einschließlich Signaltransduktion, Membrantransport und Genexpression, die dann Zellverhalten höherer Ordnung wie Zellteilung, Organellenidentität und Stoffwechselaktivität modulieren1-3. Es gibt sieben Arten von PtdInsPs, die aus der Phosphorylierung der 3-, 4- und/oder 5-Positionen der Inositol-Kopfgruppe von Phosphatidylinositol (PtdIns), dem Ausgangsphospholipid, abgeleitet sind. Wichtig ist, dass die sieben PtdInsPs ungleich verteilt sind und die lokale Konzentration jeder PtdInsP-Spezies an spezifischen subzellulären Stellen, an denen sie an einen bestimmten Satz von Proteineffektoren binden, zu- oder abnehmen kann, was es jedem PtdInsP zusammen ermöglicht, die Identität und Funktion seiner Wirtsmembran zu kontrollieren3,4. Darüber hinaus müssen die Pegel jedes PtdInsP streng kontrolliert werden, da dies die von einem PtdInsP erzeugte Signalintensität erheblich beeinflussen kann. Die Lokalisation und die Spiegel jedes PtdInsP hängen vom Targeting und der Aktivität zahlreicher Lipidkinasen, Phosphatasen und Phospholipasen ab, die die Synthese und den Umsatz jedes PtdInsP vermitteln3,4. Daher kann eine Fehlregulation der PtdInsP-Regulationsmaschinerie die Zellfunktion stören, was zu Krankheiten wie Krebs und degenerativen Erkrankungen führenkann 2,5,6. Um die Rollen und Funktionen von PtdInsPs und ihre Regulationsmechanismen vollständig zu verstehen, wurden sowohl mikroskopiebasierte als auch biochemische Techniken entwickelt, um PtdInsPs zu verfolgen und zu quantifizieren.

In vielen Fällen binden PtdInsPs über eine spezifische Proteindomäne7-9 an ihre Proteineffektoren. Diese Proteinmodule behalten oft ihre richtigen Faltungs- und Lipiderkennungseigenschaften bei, wenn sie getrennt vom gesamten Protein exprimiert werden. Dies führte zur Entwicklung von PtdInsP-Sonden durch Fusion einer spezifischen PtdInsP-bindenden Proteindomäne mit einem fluoreszierenden Protein (FP) wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) für den subzellulären Nachweis von PtdInsPs durch Mikroskopie. In der Tat haben viele Studien FP-fusionierte PtdInsP-bindende Proteinmodule verwendet, um die Lokalisation und Dynamik spezifischer PtdInsP-Spezies durch Lebendzellbildgebung zu identifizieren1,10. Zum Beispiel erkennt die Pleckstrin Homologie (PH)-Domäne der mit GFP fusionierten Phospholipase C δ1 (PLCδ1) spezifisch das Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat [PtdIns(4,5)P2] auf der Plasmamembran, während Tandemkopien der FYVE-Domäne des frühen Endosomenantigens 1 (EEA1) verwendet wurden, um Phosphatidylinositol-3-phosphat (PtdIns3P) auf den Endosomen10-13 zu verfolgen. Insgesamt eignen sich mikroskopiebasierte Techniken hervorragend, um die Lokalisierung und Dynamik von PtdInsP zu visualisieren, aber es gibt einige Vorbehalte, darunter dass PtdInsP-Bindungsdomänen auch mit anderen Faktoren als der Ziel-PtdInsP-Spezies interagieren können und dass sie keine Veränderungen unterhalb der zytosolischen Fluoreszenz der FP-Sonden nachweisen können.

Biochemische Techniken einschließlich Dünnschichtchromatographie, Massenspektrometrie und Radioisotopenmarkierung können ebenfalls verwendet werden, um die Spiegel jedes PtdInsP14-16 zu charakterisieren und zu quantifizieren. Diese Methoden erfordern die Isolierung von Lipiden für den Nachweis der zellulären PtdInsPs-Spiegel. Die Massenspektrometrie kann zur Charakterisierung von Phospholipiden aus Lipidextrakten verwendet werden und ist von unschätzbarem Wert für die Bestimmung der Acylkettenzusammensetzung von PtdInsPs14,17. Die Massenspektrometrie ist jedoch meist semi-quantitativ und es ist nach wie vor schwierig, PtdInsP-Spezies mit gleichem Molekulargewicht aufzulösen und gleichzeitig zu quantifizieren14,17. Im Vergleich dazu ist die Radioisotopenmarkierung von PtdInsPs mit anschließender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-gekoppelter Strömungsszintillation für die Trennung und gleichzeitige Quantifizierung aller sieben Spezies von PtdInsPsnützlich 18. Die Verwendung der HPLC mit einer Säule mit starkem Anionenaustausch (SAX) erreicht eine Trennung auf der Grundlage von Molekulargewicht, Ladung und Form, wodurch deacylierte PtdInsPs (Gro-InsPs) auch bei gleichem Molekulargewicht und gleicher Ladung fraktioniert werden. Durch die Kopplung des HPLC-Eluenten an einen Strömungsszintillator werden dann radioaktive Signalpeaks für jede Gro-InsPs-Spezies relativ zum ursprünglichen Elternteil Glycerin-Inositol (Gro-Ins) erzeugt18. Dies entspricht letztlich den relativen Konzentrationen von PtdInsPs in den Zellen.

Die radioaktive Markierung von PtdInsPs und HPLC-gekoppelter Flussszintillation ist ein nützliches Werkzeug, um die Regulation und Funktion von Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphat [PtdIns(3,5)P2] zu untersuchen, einem PtdInsP, das nur ~0,1-0,3% der PtdInsausmacht 16,19,20. Die Synthese von PtdIns(3,5)P2 erfolgt durch die PtdIns3P 5-Kinase Fab1 in Hefe und PIKfyve in Säugetieren21. Dieser Reaktion wird durch eine PtdIns(3,5)P2 5-Phosphatase namens Fig4 bei Hefe oder mFig4/Sac3 bei Säugetieren22-24 entgegengewirkt. Interessanterweise existieren sowohl PIKfyve/Fab1 als auch mFig4/Fig4/Sac3 in einem einzigen Komplex und werden durch das Gerüstadapterprotein Vac14 in Hefe oder mVac14/ArPIKfyve in Säugetieren reguliert25,26. In VAC14-deletierten Hefezellen funktioniert Fab1 nicht effizient, was zu einer 90%igen Abnahme der PtdIns(3,5)P2-Spiegel führt27,28. Auf der anderen Seite ist Atg18 ein PtdIns(3,5)P 2-Effektorprotein, das die vakuoläre Spaltung kontrollieren kann 29. Atg18 ist auch ein negativer Regulator von PtdIns(3,5)P2, da die Deletion seines Gens ATG18 zu einem 10- bis 20-fachen Anstieg der PtdIns(3,5)P2-Spiegel führt29,30. Insgesamt wirken sich Veränderungen der PtdIns(3,5)P2-Spiegel stark auf die Funktion der Hefevakuole und der Lysosomen von Säugetieren aus und beeinflussen folglich Prozesse wie den Membrantransport, die Phagosomenreifung, die Autophagie und den Ionentransport 6,19,21,31.

Dieser Artikel beschreibt den Prozess der Radioisotopenmarkierung von PtdInsPs mit 3H-Myo-Inositol in Hefe, um die relativen Konzentrationen von PtdIns(3,5)P2 in Wildtyp-, vac14Δ- und atg18Δ-Hefestämmen zu ermitteln. Am Beispiel dieses Beispiels wird die Auflösungsfähigkeit der HPLC für die Trennung einzelner PtdInsPs sowie die Sensitivität der Strömungsszintillation für den Nachweis von Spuren von 3H-Myo-Inositol gezeigt. Wir erarbeiten auch, wie man die Methodik zur Markierung und Trennung von 3H-markierten PtdInsPs aus Säugetierzellen optimieren könnte, deren Proben tendenziell komplexer sind, da diese Zellen alle sieben PtdInsP-Spezies besitzen.

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Protokoll

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Hinweis: Der Text beschreibt ausführlich ein Verfahren zur PtdInsPs in Hefe zu messen. Es stellt die experimentellen Einzelheiten für die Kennzeichnung Hefezellen mit 3 H- myo-Inositol, Extrahieren und Deacylieren Lipiden und einer HPLC-Elution Protokoll zu fraktionieren und zu quantifizieren deacylierten PtdInsPs. Bitte beachten Sie, dass Kennzeichnung, Deacylierung, Auflösung und Quantifizierung von PtdInsPs in Säugerzellen erfordern Optimierung und mehr HPLC-Elutionsprofile. Diese Details können an anderer Stelle gefunden werden kann, obwohl wir einige Aspekte in der Diskussion zu diskutieren. Insgesamt ist die Methodik, um Lipide zu deacylieren extrahieren und Extrahieren der wasserlöslichen Gro-InsPs aus Hefe gegeben und ist in Figur 1 dargestellt ist.

1. Protokoll zur Markierung und Analyse PtdInsPs in Hefe

  1. Zellkultur und die Radiomarkierung
    1. Wachsen Sie eine 20 ml Flüssigkultur der Hefestamm SEY6210 bei 30 ° C unter ständigem Schütteln in komplette KunstMedium bis zur mittleren log-Phase oder einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von ca. 0,6-0,7.
      Hinweis: Verwenden Sie keine Medien YPD da dies 3 H- myo-Inositol Einbau beeinflussen. Diese Kultur Größe sollte ausreichend Material für 2-3 HPLC Läufe bereitzustellen.
    2. Pelle insgesamt 10-14 OD der Hefezellen (beachte, dass 1 ml Kultur mit einer OD600 = 1 enthält ~ 1x10 7 Zellen) für 5 min in einem 12 ml-Rundrohr durch Zentrifugation bei 800 xg. Resuspendieren mit 2 ml Inosit freien Medien (IFM) (siehe Tabelle 1 für die IFM-Zusammensetzung).
    3. Wiederholen der Zentrifugation und saugen Sie den Medien. Das Pellet mit 440 & mgr; l der IFM und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
    4. Mit 60 & mgr; l 3 H- myo-Inositol (1 ul = 1 & mgr; Ci) zu jeder Probe und inkubiere bei der Wachstumstemperatur von 30 ° C für 1 bis 3 h unter ständigem Schütteln.
      Achtung: 3 H- myo-Inositol ist ein radioaktives Kollegenrial, die nach entsprechender Schulung behandelt werden sollte. Darüber hinaus sollten alle Verbrauchsmaterialien, die Kontakt mit 3 H-haltige Material zu machen und entsprechend entsorgt werden als radioaktiver Abfall bezeichnet.
      Anmerkung: Die Wachstumstemperatur kann geändert werden, wie gewünscht, solange alle Stämme, verglichen bei der gleichen Temperatur gehalten werden.
    5. Übertragen der Zellsuspension (500 ul) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 ul 9% iger Perchlorsäure und 200 & mgr; l säuregewaschene Glasperlen. Mischen durch Umdrehen und inkubiert auf Eis für 5 min.
    6. Vortex die Probe bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min und den Transfer der Lysate in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gel-Ladespitze um die Glasperlen zu vermeiden.
    7. Pellet die Probe bei 12000 × g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
    8. Das Pellet von Bad Ultraschall in 1 ml eiskaltem 100 mM EDTA. Wieder Pellet wie zuvor.
  2. Deacylierung und Extraktion
    1. Frisch zubereiten 5,0 ml Deacylierung Reagenz indem 2,3 ml Methanol, 1,3 ml von 40% Methylamin, 0,55 ml 1-Butanol und 0,80 ml Wasser gegeben. Kehren Sie zu mischen.
    2. Saugen Sie das EDTA und beschallen das Pellet in 50 ul Wasser.
    3. Fügen Sie 500 ul der Deacylierung Reagenz und beschallen zu mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
    4. Wärme Lipide 50 min bei 53 ° C in einem Heizblock. Trocknen Sie die Proben vollständig durch Vakuumzentrifugation über 3 h oder O / N.
      1. Sicherzustellen, dass eine chemische Falle ist zwischen der Vakuumzentrifuge und der Vakuumpumpe, um Dämpfe in die Luft zu verhindern, eingebaut.
    5. Das Pellet mit 300 ul Wasser von Bad Beschallung und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Trockne die Proben durch Vakuumzentrifugation 3 h oder O / N. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    6. Beschallen das Pellet mit 450 ul Wasser. Dies ist die wässrige Phase während der Extraktion.
    7. Frisch Herstellung von 10 ml der Extraction Reagenz durch Zugabe von 8,0 ml 1-Butanol, 1,6 ml Ethylether und 0,40 ml Ethylformiat. Kehren Sie zu mischen.
    8. Werden 300 ul des Extraktionsreagens zu der wässrigen Phase. Vortex die Mischung bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min und trenne die Schichten durch Zentrifugieren bei Höchstgeschwindigkeit (18.000 xg) für 2 min.
    9. Sammeln die untere wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Vermeidung der obere organische Schicht, die Schnittstelle und das Pellet. Wiederholen Extraktion der wässrigen Phase noch zweimal mit frischem Extraktionsreagens.
    10. Vollständig trocknen die gesammelte wässrige Schicht durch Vakuumzentrifugation. Dispergieren des Pellet in 50 ul Wasser durch Behandlung in einem Ultraschallbad.
    11. Add 2 ul jeder Probe zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit in einem 6 ml-Polyethylen Szintillationsfläschchen. Bestimmung der Anzahl der Zählungen (in CPM) in jeder Probe durch Flüssigszintillationszählung unter Verwendung eines offenen Fensters.
    12. Bewahren Sie die Proben bei -20 ° C, bis sie für HPLC.
  3. Trennung von3 H-glycero-inositides durch HPLC
    1. Bereiten Puffer A durch Filterung 1 l Reinstwasser mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
    2. Bereiten Puffer B, indem eine 1 L Lösung von 1 M Ammoniumhydrogenphosphat (APS, MW 132,06) in Wasser und stellen Sie mit Phosphorsäure den pH-Wert auf 3,8. Filtern Sie die Ammoniumphosphat mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
    3. Montieren Sie den Durchstechflaschen von Ausbau ein 2 ml mit einer federbelasteten 250 ul kleines Volumen Einsatz Fläschchen. Laden 10 Millionen CPM und fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 55 ul. Bereiten Sie eine leere Flasche mit 55 ul Wasser.
    4. Verschließen Sie die Fläschchen mit Schraubverschluss mit einer PTFE / Silikon-Septum ausgestattet (rote Seite mit Blick auf das Innere der Flasche). Legen Sie jedes Fläschchen in der Auto-Sampling Fach des HPLC, beginnend mit der leeren Durchstechflasche.
    5. Verwenden Sie ein HPLC und zugehörige Software, Pufferfluss steuert, entgast Puffer und Kontrollen Probe INJEKTIERTam. Verwendung eines Online-Strömungs Szintillator und der zugehörigen Software, um den Szintillator Flußrate zu regulieren und die 3 H-Abfallsignal zu überwachen.
      1. Verwenden Sie einen SAX Flüssigkeitschromatographiesäule mit Abmessungen von 250 mm x 4,6 mm und mit 5 & mgr; m Silika-Harz in der HPLC. Statten Sie die Spalte mit einer Spalte Wache Injektion von Verunreinigungen zu verhindern.
      2. Installieren Sie eine 3 H-kompatiblen 500 ul Flusszelle in der Strömung Szintillator.
        HINWEIS: Die Fraktionierung kann mit einem Agilent 1200 Infinity-Serie-HPLC-System von ChemStation-Software oder mit anderen handelsüblichen HPLC-Systeme gesteuert erfolgen. Flow Scintillation der HPLC-Eluent kann mit einem β-RAM Strömungs Szintillator vom Laura Software oder anderen kommerziell erhältlichen Strömungs Szintillator oder kompatible Software gesteuert erfolgen.
    6. Initialisieren der quaternären Pumpe bei einer Fließrate von 1,0 ml / min mit 100% Puffer A.
    7. Einrichtung eines Ausgleichsprofil auf der HPLC1% Puffer B für 5 min, 1-100% B für 5 min, 100% B für 5 Minuten, 100-1% B 5: um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung") steuern min, 1% B für 20 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 30 Minuten Laufzeit.
    8. Richten Sie ein Elutionsprofil (Abbildung 2) auf der HPLC, um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll A") zu steuern: 1% B für 5 Minuten, 1-20% B für 40 min, 20-100% B für 10 min, 100% B für 5 min 100-1% B für 20 min, 1% B für 10 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 90 Minuten Laufzeit.
    9. Einrichten einer Erfassungsprotokoll auf die Strömung Szintillator (nennen das "Protokoll A detection"), die für 60 min laufen, mit einer Szintillationsflüssigkeit Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min und einer 8,57 sec Verweilzeit.
    10. Programmieren Sie eine automatisierte Einspritzfolge auf der HPLC mit dem Wasser leer in "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung" beginnen, gefolgt von each radioaktiv markierte Probe auf "Protokoll A". Initialisieren Sie die Reihenfolge, wenn Sie fertig.
    11. Während der Lauf noch auf dem Gleichgewichtsprotokoll, eine Batch auf die Strömung Szintillator, um alle Proben mit Maß "A Protocol Erkennung." Die Injektion von jedem neuen Abtastwert wird "Protokoll A" auf der HPLC zu initialisieren, während die Auslösung der Strömungs Szintillator zu beginnen "Protokoll einer Detektions."
    12. Bei Beendigung aller Läufe, spülen Sie die HPLC, die Säule und Durchfluss Szintillator mit 100% Puffer A für 30 min bei 1,0 ml / min Durchflussmenge.
  4. Datenanalyse
    1. Verwenden Laura Software oder andere Software, die den Chromatographie-Spektren zu quantifizieren kann. Die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte sind in Abbildung 3 dargestellt.
    2. Öffnen Sie die Dateien, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" und wählen Sie die Rohdatendatei für jede Probe.
    3. Im Register "Chromatogramme", zoom in jedem der kleineren Peaks (etwa 1000 Zählungen [y-Achse]) unter Beibehaltung der Zeitauflösung zu dehnen. Untersuche jeden einzelnen Peak, wenn nötig.
    4. Markieren Sie jede der Spitzen für die Analyse unter Verwendung des "Add ROI" Werkzeug. Identifizieren Spitzen durch die Elutionszeit: Parental Gro-Ins bei 10 min, Gro-Ins3P bei 18 min, Gro-Ins4P bei 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 bei 29 min und Gro-Ins (4,5 ) P 2 bei 32 min.
    5. Im Register "Bereiche Tabellen", notieren Sie die "Bereich (Counts)" jeder Spitze. Beachten Sie die "Start (mm: ss)" Zeit und "Ende (mm: ss)" Zeit jeder Spitze.
    6. Zum Abzug des Hintergrunds, markieren einen Bereich benachbart zu dem Peak überspannt dieselbe Menge an Zeit. Subtrahieren der Anzahl von Zählungen von dem entsprechenden Peak.
    7. Normalisieren die Fläche von jeder Spitze gegen elterliche Gro-Ins (wie "% of total PtdIns" ausgedrückt). Dann normalisiert jede der Spitzen in jeder Versuchsbedingung gegen den Steuerzustand (als "n ausgedrücktfache Steigerung im Vergleich zur Kontrolle ").
      HINWEIS: Die Normalisierung jeder Spitze kann auch gegen Gesamtzählungen durchgeführt werden, aber da die elterliche Gro-Ins ist viel häufiger als alle anderen PtdInsPs die Ergebnisse sind in der Regel ähnlich.
    8. Exportieren Sie die Daten für den Chromatographen, indem Sie auf "Datei", "Speichern unter ..." und wählen Sie die "CSV (Komma getrennt)" Dateiformat. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulation und zu präsentieren wie nötig.

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Ergebnisse

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Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Hefe PtdInsPs metabolisch mit 3 H-myo-Inositol-markiert. Nach der Markierung wurden die Phospholipide mit Perchlorsäure ausgefällt, gefolgt von Deacylierung Phospholipid und die Extraktion der wasserlöslichen Gro-InsPs (Abbildung 1). In dieser Phase ist es wichtig, die gesamte radioaktives Signal mit dem extrahierten Gro-InsPs durch Flüssigszintillationszählung zu quantifizieren, um eine ausreichende Signal-zu...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt die experimentelle Protokoll erforderlich, um Zellebenen PtdnsPs durch HPLC-gekoppelten Strömungs Szintillations aus Hefe zu quantifizieren. Die Methodik ermöglicht die metabolische Markierung von PtdInsPs mit 3 H- myo-Inositol, gefolgt von Lipid Aufarbeitung und Extraktion von wasserlöslichen 3 H-Gro-InsPs, HPLC-Fraktionierung und Analyse. Mit dieser Methode können die relativen Mengen an PtdInsPs in Zellen unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden, wi...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H. wurde durch ein Ontario Graduate Scholarship der Regierung von Ontario unterstützt. Dieser Artikel wurde ermöglicht durch die Finanzierung von R.J.B. vom Natural Sciences and Engineering Research Council, dem Canada Research Chairs Program und der Ryerson University.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-ButanolBiobasicBC1800Reagenzqualität
Ammoniumphosphat dibasischBioshopAPD001
AmmoniumsulfatACS-QualitätBiobasicUltra Pure
Grade AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
BorsäureBiobasicBB0044Calciumchlorid in molekularbiologischer Qualität
BiobasicCT1330Wasserfreies, industrielles
CalciumpantothenatSigmaC8731
Kupfer(II)-sulfatSigma451657wasserfrei
D-GlucoseBiobasicGB0219wasserfrei, Biotech-Qualität
Dulbecco-Modifikation von Eagle's MediumLife11995-065Mit 4,5 g/L Glukose, 110 mg/L Pyruat, L-Glutamin
Dulbeccos Modifikation von Eagle's MediumMP biomedicals0916429 Mit 4,5 g/L Glukose, ohne L-Gluatmin, ohne Inositol
EDTABiobasicEB0107Säurefreier, ultrareiner
EthyletherCaledon Labs1/10/4700Wasserfreies, reagenzisches
EthylformiatSigma112682Reagenzqualität
Fötales RinderserumWisent080-450 US-Herkunft, Premium-Qualität, hitzeinaktiviertes
fötales Rinderserum, dialysiertesLeben26400044USA Herkunft
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Szintillationsflüssigkeit für die Strömungsszintillation
FolsäureBiobasischFB0466in USP-Qualität
Lebensdauer156300801 M Lösung
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 Ethanol zu Wasser
Insulin-Transferrin-Selen-EthanolaminLebensdauer51500056100x Lösung
Eisen(III)-chloridSigma157740Reagenz
class Laura - Software zur Erfassung und Analyse von Chromatographie-DatenLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Software für Durchflussszintillatoren
L-GlutaminSigmaG7513200  mM, Lösung, sterilfiltriert, BioXtra, geeignet für Zellkulturen
MagnesiumchloridSigmaM8266Wasserfreies
MangansulfatBiobasicMB0334Monohydrat, ACS-Qualität
MethanolCaledon Labs6701-7-40HPLC-Qualität
MethylaminlösungSigma42646640% (v/v)
MonokaliumphosphatBiobasicPB0445Wasserfrei, Nikotinsäure in ACS-Qualität
BiobasicNB0660in Reagenzqualität
 AgilentRev. C.01.03 HPLC-Software
p-Aminobenzoesäure (PABA)BioshopPAB001.100Freie Säure
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, flüssig, stabilisiert, sterilfiltriert, zellkulturgeprüft
PerchlorsäureSigma244252ACS Reagenz, 70%
PhenoSpher SAX SäulePhenomenex00G-315-E05 µ m, 80 Å, 250 x 4,6 mm
PhosphorsäureCaledon Labs1/29/8425in Reagenzqualität
BiobasischPB0440Kaliumiodid in ACS-Qualität
BiobasicPB0443ACS-Qualität
SigmaP9755
Quaternäre PumpeAgilentG1311CAgilent 1260 infinity Serie
RiboflavinBioshopRIB333.100
USP Qualität NatriumchloridBiobasicDB0483
Biotech Qualität NatriummolybdatSigma243655
thermostatisiertes SäulenfachAgilentG1316AAgilent 1260 unendlich Serie
ThiaminhydrochloridSigmaT4625Qualität der Reagenzien; Machen Sie eine Lösung von 0,02 % (w/v) und bildet eine Suspension. Mischen und Einfrieren von Aliquoten
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Szintillationscocktail für die Flüssigszintillationszählung
ZinksulfatBiobasicZB2906Heptahydrat, Reagenzqualität
β-RAM 4IN/US-SystemeModell 4Durchfluss-Szintillator - 500 & Mikro; l Durchflusszelle; alternativer radiomatischer Durchfluss-Szintillator-Analysator von Perkin Elmer
ADB0060 HEPES-Pufferlösung OpenLAB CSD ChemStation Kaliumchlorid Pyridoxinhydrochlorid in

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
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