Um neue Mutationen zu identifizieren, die die Mechanoempfindung beeinflussen, haben wir einen Assay entwickelt, der die Verhaltensreaktion auf taktile Stimulation von Fliegenborsten in mutierten Klonen misst, die mit der MARCM-Methode erzeugt wurden. Die Kombination der Techniken ermöglicht die Identifizierung mechanosensitiver Mutationen, die sonst tödlich wären.
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Methodenartikel
Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aufgrund der strukturellen und funktionellen Homologie zu den Haarzellen des Innenohrs Säuger, die Neuronen, die Drosophila externen Sinnesorgane innervieren einen hervorragenden Modellsystem für das Studium der Mechanosensation. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Berührung Verhalten in Fruchtfliegen, die verwendet werden, um Mutationen, die mit Mechanosensation stören zu identifizieren. Die taktile Stimulation eines macrochaete Borsten auf den Brustkorb von Fliegen löst eine grooming Reflex entweder aus der ersten oder dritten Bein. Mutationen, die mit mechanotransduction (wie NOMPC) eingreifen, oder in Verbindung mit anderen Aspekten der Reflexbogen kann die Optimierungs Reaktion hemmen. Eine traditionelle Bildschirm des Erwachsenen Verhaltensweisen würden Mutanten, die eine essentielle Rolle während der Entwicklung haben verpasst. Stattdessen Dieses Protokoll verbindet die Touch-Screen mit Mosaik-Analyse mit einem repressible Zellmarker (MARCM), die für nur eine begrenzte Regionen homozygot mutierten Zellen zu ermöglichen, erzeugt und durch den expr markiert werdenession des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Durch Testen MARCM Klone für anormalen Verhaltens-Reaktionen ist es möglich, eine Sammlung von letalen p-Element-Mutationen zu screenen, um neue Gene, die durch die herkömmlichen Methoden entgangen wären in Mechanosensation beteiligt suchen.
Einleitung
Menschen verlassen sich auf die Fähigkeit, mechanische Reize aus ihrer Umgebung, wie Berührung, Druck, Vibration oder Schallwellen, in sensorische Informationen umzuwandeln, die vom Nervensystem verarbeitet werden können, in einem Prozess, der als Mechanotransduktion bezeichnet wird. Viele der mechanistischen Merkmale der Mechanotransduktion zwischen Menschen und Wirbellosen sind die gleichen1, was Drosophila zu einem nützlichen Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Mechanotransduktion macht. Drosophila melanogaster enthält zwei Gruppen von spezialisierten Sinnesorganen (Typ I und II), die in der Lage sind, mechanische Reize in Aktionspotentiale umzuwandeln. Typ-I-Mechanorezeptoren bestehen aus einem Neuron mit einem einzigen Dendriten oder sensorischen Fortsatz, der von drei Stützzellen umgebenist 2. Zu den Typ-I-Mechanorezeptoren gehören Borsten-Mechanorezeptoren, hörempfindliche chordotonale Organe (das Johnston-Organ) und campaniforme Sensillen, die Informationen über Flügelschläge vermitteln3. Die Borsten, die die Rückenseite der Fliege bedecken, sind die am häufigsten vorkommenden und am leichtesten zugänglichen Organe des Typs I. Ähnlich wie die extrazelluläre Umgebung von Haarzellen, die bei Wirbeltieren mit dem Hören und dem Gleichgewicht verbunden sind, sezernieren die Stützzellen, die mechanosensitive Neuronen der Fliege umgeben, eine hohe Kalium-Endolymphe, die einen ungewöhnlichen Konzentrationsgradienten für Kalium1 erzeugt. Mechanosensitive Neuronen sowohl des Säugetier- als auch des Fliegensystems nutzen dieses hohe extrazelluläre Kalium, um die Zelle zu depolarisieren. Als Reaktion auf die mechanische Stimulation der Makrochaetenborsten in Richtung der Körperwand reagieren die sensorischen Neuronen mit einem Ausbruch von Aktionspotentialen, die durch diese Kaliumdepolarisation der Zellmembran angetrieben werden4. Die sensorischen Neuronen von Drosophila, die die Borsten innervieren, ähneln in Struktur und Funktion den mechanosensitiven Zellen anderer Organismen, einschließlich Haarzellen von Wirbeltieren,1,5. Die Zugänglichkeit der äußeren Sinnesorgane von Drosophila für experimentelle Manipulationen und die Fülle an genetischen Techniken, die den Forschern zur Verfügung stehen, machen Drosophila zu einem hervorragenden Modellsystem, um die molekularen Grundlagen der Mechanoempfindung zu untersuchen.
In der Fliege führt die Stimulation eines einzelnen sensorischen Neurons, das eine Borste innerviert, zu einer beobachtbaren Verhaltensreaktion. Die Stimulation verschiedener Borsten ruft spezifische, reproduzierbare Verhaltensreaktionen hervor, abhängig von der Borste, die stimuliert wird. Bei taktiler Stimulation zeigen enthauptete Wildtyp-Fliegen einen komplexen Fellpflegereflex, bei dem sie den Bereich in der Nähe der stimulierten Borsten mit einer gemusterten Reihe von Beinbewegungen5-7 reinigen. Wenn Fliegen homozygot für bekannte Einzelgenmutationen sind, die das Lernen7 oder die Koordination und die Bewegungsaktivitätbeeinträchtigen 5, reagieren sie abnormal auf mechanische Stimulation. Dieser Grooming-Reflex ist daher ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen von Einzelgenmutationen auf ein spezifisches, replizierbares Verhalten zu untersuchen.
Die robuste Verhaltensreaktion auf die Stimulation einer einzelnen Makrochaetenborste hat das Potenzial, bei der Identifizierung neuer Gene zu helfen, die an der Mechanotransduktion beteiligt sind. Dieses Protokoll wird verwendet, um eine Ansammlung mutierter Fliegen auf das Fehlen einer Verhaltensreaktion zu testen, was darauf hindeutet, dass die Mutation die Mechanoempfindung stört. In der für das Screening ausgewählten Mutantensammlung verursachen die Mutationen eine Letalität vor dem Erwachsenenalter und wären daher mit herkömmlichen Verhaltensscreenings bei Erwachsenen nicht zu testen. Ursprünglich wurde diese Sammlung letaler p-Elemente mit FRT-Rekombinationsstellen kombiniert, um Zellwachstumsdefekte in Klonen zu testen. Die Klone wurden speziell im Auge hergestellt, da erwachsene Fliegen im Labor ohne funktionelles Sehen überleben können8. Die Entfernung aller Mechanoempfindungen kann jedoch dazu führen, dass Erwachsene stark unkoordiniert sind oder vor der Eklosion5 sterben. Dieses Protokoll verwendet einen Mosaik-Ansatz, um die Letalität der Mutationen zu umgehen und Tests im Erwachsenenstadium zu ermöglichen. Eine genetische Technik namens Mosaikanalyse mit einem repressiblen Zellmarker (MARCM)9 wird verwendet, um homozygote mutierte Zellen in einer begrenzten Anzahl von sensorischen Organen adulter Fliegen zu erzeugen, während der Rest des Organismus heterozygot bleibt. Diese MARCM-Fliegen überleben problemlos bis zum Erwachsenenalter, doch die Borsten sind homozygot für die tödlichen Gene von Interesse.
MARCM ermöglicht die Erzeugung und Markierung von Regionen homozygoter mutierter Zellen durch die Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP), während der Rest des Organismus an diesem speziellen Locus heterozygot und unmarkiertbleibt 9. MARCM kombiniert einzelne p-Element-Mutationen mit fünf gemeinsamen genetischen Elementen: GFP unter der Kontrolle einer stromaufwärts aktivierenden Sequenz (UAS-GFP), Gal80-Repressorprotein unter Kontrolle eines allgemeinen Promotors (tub-Gal80), Gal4-Transkriptionsfaktor unter Kontrolle eines allgemeinen Promotors (tub-Gal4), das FRT-Rekombinase-Enzym, das durch einen Hitzeschock-kontrollierten Promotor exprimiert wird, und eine FRT-Rekombinationsstelle10. Durch das Vorantreiben der mitotischen Rekombination durch eine durch Hitzeschock aktivierte Rekombinase wird eine begrenzte Anzahl von Zellen homozygot für die Mutation gemacht und mit GFP markiert. Die GFP-Expression wird in heterozygoten Zellen durch das Vorhandensein von Gal80 auf der Wildtyp-Kopie des Chromosoms unterdrückt.
Ein Hitzeschockprotokoll für MARCM wurde optimiert, um eine Rekombination in den äußeren Sinnesorganen der Fliegenborste zu induzieren, während ein Großteil des Organismus heterozygot und daher nicht mit GFP markiert bleibt. Mosaikfliegen, die mit diesem Protokoll erzeugt wurden, enthielten homozygote Mutationen, am häufigsten in den postalaren oder dorsalen Mittelborsten auf der Oberfläche des Notums.
Wir haben die Nützlichkeit dieser Kombination aus MARCM und dem Grooming-Behavior-Screen mit einer bekannten mechanosensitiven Mutante, NOMPC, getestet. Der Ionenkanal, kein Mechanorezeptorpotential C (NOMPC), ist ein wesentlicher Bestandteil des Mechanotransduktionswegs in Drosophila5,11-13. NOMPC gehört zur TRP-Superfamilie der Kationenkanäle5 und erfüllt alle Kriterien, um sich als mechanosensitiver Kanal in Drosophilazu qualifizieren 14,15: 1) NOMPC wird in den Ciliatenspitzen von sensorischen Neuronen vom Typ 1 von Drosophila exprimiert 13,16-18, 2) NOMPC-Nulllarven haben keine elektrische Reaktion auf taktile Stimulation13, 3) Die ektopische Expression von NOMPC in berührungsunempfindlichen Zellen kann eine Empfindlichkeit gegenüber mechanischer Stimulation induzieren13, 4) die heterologe Expression von NOMPC in Schneider-2-Zellen ergibt einen mechanosensitiven Kanal13, und 5) adulte NOMPC-Mutanten zeigen Defekte in ihrer Reaktion auf mechanische Stimulation5. Angesichts dieser Evidenz sagten wir voraus, dass NOMPC-mutierte Klone als Reaktion auf mechanische Stimulation der Borsten eine veränderte oder gehemmte Pflegereaktion zeigen würden.
Ein MARCM-Stamm, der die NOMPC-Mutation enthält, wurde für die Verwendung in einem Proof-of-Principle-Experiment des Grooming-Assays entwickelt. Mosaikfliegen wurden an Makrochaetenborsten stimuliert, die homozygote NOMPC-mutierte Zellen enthielten. Wir erwarteten eine Hemmung der Fellpflege nach Stimulation der Makrochaetenborste. Wir fanden heraus, dass nur 2 von 14 getesteten mutierten Borstenfliegen eine einzige Reaktion auf wiederholte Stimulation zeigten; Die meisten reagierten nicht auf die Stimulation der homozygoten mutierten Borste. Nachdem bestätigt wurde, dass dieser MARCM-basierte Verhaltensassay einen abnormalen Pflegereflex in einer bekannten mechanosensitiven Mosaikmutante erzeugt, kann diese Technik in einem Screening auf zusätzliche mechanosensitive Mutationen verwendet werden.
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Protokoll
1. Kreuze zu MARCM Flies generieren
- Aufrechtzuerhalten Fliegen auf Maismehl Melasse-Medien (6,5 g / l Agar; 23,5 g / l Hefe, 60 g / L Maismehl, 60 ml / l Melasse, 4 ml / l Säuremischung; 0,13% Tegosept) oder Standard Drosophila Medium bei 22 Grad Celsius in einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus.
Hinweis: eine niedrigere als Standardtemperatur wird verwendet, um MARCM-Aktien gesund zu halten. Dadurch verlängert sich die Entwicklungszeit zwischen Ei und Erwachsenenalter bis 14 Tagen. - Verwenden jungfräulichen Weibchen (ca. 1-8 Tage alt) aus einem MARCM-ready Lager, die die notwendigen genetischen Elemente (GFP unter der Kontrolle von einem vorgeschalteten-Aktivierungssequenz (UAS-GFP), der Gal80 Repressor-Protein, das Gal4-Transkriptionsfaktor, ein Hitzeschock angetrieben Rekombinase und eine FRT-Rekombinationsstelle).
Hinweis: Unsere MARCM ready-Aktien die folgenden Genotypen enthalten: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / Cyo; tubGal4 / TM3Sb.
Anmerkung: Die spezifische FRT-Stelle ist am Ort der Mutation abhängtim Genom. So wird beispielsweise verwendet werden, um Mutationen FRT40A am linken Arm von Chromosom 2, wie zum Beispiel NOMPC (siehe 10 für weitere Details über MARCM Protokolle) zu testen. - Quer MARCM-ready jungfräulichen Weibchen zu Männchen, die eine Mutation von Interesse und seine entsprechende FRT-Stelle enthalten (beispielsweise w-; NOMPC3, FRT40A / Cyo; + / +). Für eine wirksame MARCM Induktions steuern, stellen eine zweite Quer mit männlichen Fliegen denselben FRT-Stelle enthielt, aber ohne Mutation. Verwenden Sie einen ungefähren Verhältnis von 5 Frauen: 1 Männchen im Kreuze.
2. Timed Eiablage
- Nachdem man fliegt, für mindestens eine Nacht paaren, bewegen Erwachsenen in neue Flaschen mit frischem Medium. Lassen Sie entfernt, um Eier in einer dunklen Umgebung für ca. 4 Stunden vor dem erneuten Übertragen der Kreuze in neue Gefäße zu legen. Beachten Sie die Start- und Endzeit der Eiablage Periode.
Anmerkung: Kürzere Intervalle akzeptabel sind, wenn es angezeigt wird, um eine hohe Anzahl von Eiern auf dem Medium vor dem Ende der 4-stündigen Interval.- Halten Sie Durchstechflaschen mit einer ausreichenden Anzahl von Eiern (ungefähr größer als 20) und an einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus bei 22 Grad Celsius zu sein Wärme später schockiert.
Anmerkung: Ampullen mit einer geringen Anzahl von Eiern auf dem Medium (weniger als etwa 20), sind wahrscheinlich nicht ausreichende Zahl Ausbeute von erwachsenen Fliegen für Verhaltenstests und im Interesse der Effizienz ist es empfehlenswert, sie nicht für weitere Tests erhalten werden.
Hinweis: Unsere Fliegen sind mit den Lichtern auf 08.00 bis 20.00 angehoben. 08.00 Uhr und 08.00 Uhr bis Mitternacht - Wir haben die Zeit des Abends Punkte führen zu höheren Eierdichten, also in der Regel führen zeitgesteuerten Kreuzungen zwischen 4 gefunden. Die Fliegen legen ihre Eier bei RT in einem dunklen Schrank und dann am folgenden Tag in den Inkubator gegeben, um nicht das normale Licht-Dunkel-Zyklus in den Inkubator zu stören.
- Halten Sie Durchstechflaschen mit einer ausreichenden Anzahl von Eiern (ungefähr größer als 20) und an einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus bei 22 Grad Celsius zu sein Wärme später schockiert.
3. Führen Sie Heat Shock mitotische Rekombination induzieren
- Etwa 85 bis 100 Stunden nach Eiablage statt vrialien in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand erreicht, über die Höhe der Medien in den Fläschchen, aber nicht vollständig versenken die Fläschchen, um die Larven vor dem Ertrinken zu verhindern.
- Fläschchen entfernen Wasserbad und ermöglichen eine 1 Stunde Erholungszeit bei RT.
- Platz Fläschchen zurück in 37 Grad Celsius Wasserbad für 1 Stunde.
- Fläschchen aus Wasserbad und bewahren Sie im Inkubator auf 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zyklus bei 22 Grad Celsius bis zum Schlüpfen.
4. Vorbereitung für Behavioral Testing
- Nach dem Schlüpfen, betäuben Fliegen auf Eis. Wählen Fliegen mit Genotypen, die alle genetischen Elemente für MARCM enthalten und zeigen GFP-Expression markierte Klone wird wahrscheinlich auf der Grundlage der beobachtbaren Phänotyp-Marker in den Mutter Lagerbestände zu beobachten. Enthaupten Fliegen mit Iridektomie Schere.
Hinweis: Zum Beispiel für Fliegen wählten wir ohne die genetische Marker Cyo (geschweifte Flügel) und Sb (Stoppelborsten) zu identify Fliegen, die alle genetischen Elemente notwendig, Mosaik Regionen zu schaffen enthalten würde mit GFP markiert.
Hinweis: Enthauptung ist nötig, die Erwachsenen aus fliegen weg, wenn stimuliert verhindern. - Zeigen kopflose Fliegen in einem geschlossenen, feuchten Umgebung und lassen Sie ca. 10 - 20 Stunden der Erholung. Nur Verwendung fliegt dieses Recht selbst, wenn eine weitere Prüfung erforderlich gestört. Test fliegt innerhalb von 30 Stunden der Enthauptung.
5. Behavioral Testing
- Durch die Beobachtung enthauptet Fliegen unter dem Fluoreszenz Binokular, identifizieren homozygot Klone mit GFP an den Borsten äußeren Sinnesorgane markiert. Notieren Sie sich die Borsten Namen und linken oder rechten Seite. Um eine mögliche Voreingenommenheit zu beseitigen, sollte die Labor Mitglied Durchführung des Borsten Stimulation blind gegenüber dem Genotyp des Borsten, Wildtyp oder Mutante sein.
- Rufen eine grooming Reflex durch Ablenken des GFP markierte Borsten in Richtung der Flugkörper mit einem steifen Haaren oder feinen Pinzette und das Bein re beobachtenAntwort. Geben Sie einen Wert von eins bis Fliegen, die das Bein heben in Reaktion auf die Stimulation und eine Punktzahl von null auf Fliegen, die ihre Beine nicht bewegen Borsten.
Hinweis: Frühere Studien 6,7 haben die Bein Reaktion, die durch die Förderung eine besondere Borsten ausgelöst wird gekennzeichnet. Dies schließt die Schenkel, die an jeder Borste anspricht und den Anteil an Fliegen, die auf die Stimulation des jeweiligen Borsten reagieren. Wir erzielte nur für Bewegungen des Beins, die wir erwartet, basierend auf Vandervorst Klassifizierung 6 reagieren. - Führen Sie fünf Studien 2 Minuten Abstand voneinander.
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Ergebnisse
Der Erfolg dieses Protokoll hängt weitgehend von der Gesamtausbeute von testbaren Fliegen, die Wirksamkeit des Hitzeschock mitotische Rekombination und die Fähigkeit, einen robusten Verhaltensreaktion bei Fliegen in 2 min Intervallen stimuliert erhalten induzieren. Gegeben, dass schätzungsweise 12,5% der Embryonen enthalten alle notwendigen MARCM Elemente und eine geschätzte 16,67% der Erwachsenen, die das Potential für eine GFP-Expression schlüpfen, ist es wichtig, eine hohe Anzahl von ...
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Diskussion
Dieses Protokoll verwendet eine erwachsene Verhaltenstest für Mutationen, Mechanosensation in Drosophila beeinflussen screenen. Da die Sammlung von Mutanten enthält letale p-Element Mutationen, Screening ausschließen würden als Erwachsene Dieses Protokoll verwendet eine komplexe genetische Technik zuerst durch Lee und Luo beschrieben , (1999) und detaillierter als Protokoll von Wu und Luo, (2006) bis zur Erwachsenen Letalität zu umgehen. MARCM induziert mitotische Rekombination zwischen homologen Chrom...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren danken danken der Bloomington Stock Center, Liqun Luo, Charles Zuker und Lily und Yuh Nung Jan für die großzügige Aufteilung der Fliege Aktien und den folgenden für die Finanzierung: SOMAS-URM (JD und SW), Bachelor Ford Fakultät Sommer Fellowship (bis SW), BD Corporation, Sommer-Forschungsstipendium (CL und DL), der Renee und Anthony M. Marlon, MD '63 Summer Research Fellowship (DL) James C. '75 und Jane Colihan Sommer-Forschungsstipendium (TO) durch die Alumni / Eltern Sommerforschungsfonds der Universität vom Heiligen Kreuz und der Stransky Foundation Sommer-Forschungsstipendium (TO). Besonderer Dank gebührt dem Institut für Biologie und das Dekanat bei College des Heiligen Kreuzes für die Unterstützung von all der Arbeit im Labor.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bierhefe (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fliegenfutter |
| Mais (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fliegenfutter |
| Agar (1 Pfund) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fliegenfutter |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fliegenfutter |
| Melasse (1 Gallone) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fliegenfutter |
| Propionsäure | Fisher | A258-500 | Fliegenfutter |
| Phosphorsäure | Fisher | A260-500 | Fliegenfutter |
| Drosophila Fläschchen, schmal (PS) | Genesee | 32-109 | Fliegenkulturen |
| 6oz Flasche mit quadratischem Boden (PP) | Genesee | 32-130 | Fliegenkulturen |
| Flugs - Fliegenflaschen | aus Kunststoff Genesee | 49-100 | Fliegenkulturen |
| Rayon Balls, groß | Genesee | 51-100 | Fliegenkulturen |
| Droso-Füller, schmal | Genesee | 59-168 | Fliegenfutter Zubereitung |
| Droso-Füller, Flaschen | Genesee | 59-170 | Fliegenfutter Zubereitung |
| 8A-C / zahnradgetriebener Laborrührer mit C-Klemmhalterung 1/15 PS, 700 U/min variable Drehzahl, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mischer | 8A-C | Fly Food Zubereitung |
| Wassermantel Wasserkocher | Fly Food Zubereitung | ||
| Tagestemperatur | Forma Scientific | Temperatur- und Licht-/Dunkelzyklus | |
| gesteuert Wasserbad | VWR | Für Wärme | |
| Mikroschere für Schock | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 15000-08 | Zum Entfernen von Köpfen |
| Fluroszenz Präpariermikroskop | Zeiss | SteREO Discovery V8 | Mit GFP-Würfel (KSC295-814D) Bandpassfilter |
| Zeiss | X-Cite 120 | Lichtleiter-Lichtquelle | Glasfaser macht dies einfach zu konfigurieren |
| Kamera für Zielfernrohr | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Bilderfassungssoftware | Zeiss | ||
| Eiskübel | für Kaltanästhesie | ||
| Hausgemachtes Kaltanästhesietablett | für die Enthauptung von Kaltanästhesie | ||
| Plastikboxen | zur Bergung von entkoffeinierten Fliegen in feuchter Umgebung |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
