Methodenartikel

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

DOI:

10.3791/53547

⸱

18. Februar 2016

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Postembedding-Immunogold-Methode ist eine der effektivsten Methoden, um hochauflösende Analysen der subzellulären Lokalisation spezifischer Moleküle zu liefern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Analyse von Glutamatrezeptoren an retinalen Bandsynapsen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale Ganglienzellen (RGCs) erhalten exzitatorischen glutamatergen Input von bipolaren Zellen. Die synaptische Erregung von RGCs wird postsynaptisch durch NMDA-Rezeptoren (NMDARs) und AMPA-Rezeptoren (AMPARs) vermittelt. Physiologische Daten deuten darauf hin, dass Glutamatrezeptoren an RGCs nicht nur in postsynaptischen, sondern auch in perisynaptischen oder extrasynaptischen Membrankompartimenten exprimiert werden. Die genauen anatomischen Lokalisationen der Glutamatrezeptoren an den RGC-Synapsen wurden jedoch nicht bestimmt. Obwohl eine hochauflösende quantitative Analyse von Glutamatrezeptoren an zentralen Synapsen weit verbreitet ist, hatte dieser Ansatz in der Netzhaut bisher nur begrenzten Erfolg. Wir haben eine Postembedding-Immunogold-Methode zur Analyse von Membranrezeptoren entwickelt, die es ermöglicht, die Anzahl, Dichte und Variabilität dieser Rezeptoren an retinalen Bandsynapsen abzuschätzen. Hier beschreiben wir die Werkzeuge, Reagenzien und die praktischen Schritte, die benötigt werden für: 1) die erfolgreiche Vorbereitung der retinalen Fixierung, 2) die Gefriersubstitution, 3) die Immunzytochemie nach der Einbettung des Immungold-Elektronenmikroskops (EM) und 4) die quantitative Visualisierung von Glutamatrezeptoren an Bandsynapsen.

Einleitung

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Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter im Netzhaut 1. Retinalen Ganglienzellen (RGC), glutamatergen synaptischen Input von bipolaren Zellen 2 sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut erhalten, die visuelle Information an das Gehirn senden. Physiologische Untersuchungen zeigten, dass die synaptische Erregung von RGCs vermittelt wird postsynaptisch von NMDA-Rezeptoren (NMDARs) und AMPA-Rezeptoren (AMPARs) 3,4,5. Obwohl exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in RGCs durch AMPARs und NMDARs 3,5,6,7,8, zeigen spontane Miniatur EPSCs (mEPSCs) auf RGCs vermittelt werden nur eine AMPARs vermittelte Komponente 4,5,9. Allerdings ergab Glutamataufnahme Reduktion eines NMDAR Komponente in spontanen EPSCs 5, was darauf hindeutet, dass NMDARs auf RGC Dendriten können außerhalb von Synapsen befinden. Membranassoziierten Guanylat-Kinasen (MAGUKs) wie PSD-95, dass Cluster Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich Glutamat-Rezeptoren und Ionenkanals bei synaptischen Websites, auch deutliche subsynaptischen Expressionsmuster 10,11,12,13,14 aufweisen.

In den letzten Jahrzehnten konfokalen Immunhistochemie und Pre-Einbettung Elektronenmikroskop (EM) Immunhistochemie wurden zu studieren Membran-Rezeptor-Expression eingesetzt. Obwohl konfokalen Immunfärbung breites Muster der Rezeptorexpression offenbart, macht seine geringere Auflösung unmöglich subzellulären Ort zu unterscheiden zu können. Pre-Einbettung EM-Studien in Säugernetzhaut zeigen, dass NMDAR Untereinheiten in postsynaptischen Elemente bei Konus Bipolarzelle Band Synapsen 15,16,17 vorhanden sind. Dies ist in der scheinbaren Gegensatz zu physiologischen Beweise. Jedoch Diffusion von Reaktionsprodukt ist ein bekannter Artefakt in der Pre-Einbettungs Immunperoxidase-Verfahren. Daher ist dieser Ansatz nicht in der Regel statistisch verlässliche Daten geben und Unterscheidung zwischen Lokalisierung zu synaptischen Membran gegen extrasynaptischen Membran 18,19,20,21 ausschließen. Aufdie andere Hand, physiologischen und anatomischen Daten sind mit einem synaptischen Lokalisation von AMPARs auf RGCs 3,5,7,9,22 konsistent. Somit Glutamatrezeptoren und MAGUKs bei Netzhautband Synapse nicht nur lokalisiert der postsynaptischen sondern auch auf die perisynaptic oder extrasynaptischen Membran Fächern. Jedoch ist ein hochauflösender quantitative Analyse dieser Membranproteine ​​in einer Netzhautband Synapse wird noch benötigt.

Hier entwickelten wir ein postembedding EM Immunogold Technik die subsynaptischen Lokalisierung von NMDAR-Untereinheiten, AMPAR Untereinheiten und PSD-95, gefolgt von der Schätzung der Anzahl, Dichte und die Variabilität dieser Proteine ​​an Synapsen auf Ratten RGCs untersucht markierten Choleratoxin-Untereinheit B mit (CTB) Rückverfolgung Methoden.

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Protokoll

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Pflege und Betreuung von Tieren waren nach NIH Animal Care und Use Committee Guidelines. 12-Stunden-Licht: postnatalen Tag (P) 15-21 Sprague-Dawley-Ratten injiziert mit 1-1,2% CTB bilateral durch den Colliculus superior, wurden auf einem 12 gehalten Dunkel-Zyklus.

1. Netzhautgewebe Fixation

  1. Setzen Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Zangen mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Plastikpipette und einem Objektträger.
  2. Anesthetize die Ratte in einer geschlossenen Kammer mit 2,0 ml Halothan (ein Inhalationsanästhesie). Bestimmen ausreichende Betäubung mit diesen Methoden: Mangel Zurücknahme der Hinterpfote nach Zeh Prise, oder das Fehlen von Blinkreflex. Dann enthaupten sofort mit einer Guillotine. Entfernen Sie die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Glasschale mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) bei pH 7,4.
  3. das Binokular Entfernen Sie mit den Maisea durch die Vorderseite des Augapfels abzuschneiden. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette.
  4. Ziehen Sie die Lederhaut mit den beiden Zangen, bis die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist.
  5. Schneiden Sie die Netzhaut sofort in 100 bis 200 & mgr; m-dicke Streifen mit einer Rasierklinge, und je nach pH-Shift-Fixierung.
  6. Fix Retina Streifen in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB bei pH 6,0 für 20 - 30 min und dann in 4% Paraformaldehyd und 0,01% Glutaraldehyd bei pH 10,5 für 10 - 20 min bei RT.
  7. Nach mehrmaligem Waschen in PB mit 0,15 mM CaCl 2 (pH 7,4 bei 4 ° C), cryoprotect die Netzhautstreifen mit Glycerin (60 min jeweils in 10%, 20%, 30%, dann O / N in 30%) in 0,1 M PB vor Substitution einzufrieren.

2. Gefriersubstitution

HINWEIS: Diese gefrierSubstitutionsMethode aus einer früheren veröffentlichten Protokoll 19,20 modifiziert wird. Auch ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Instrumente sehr kalt sind (Handschuhe); Otherwise, kann das Gewebe teilweise aufzutauen, als mit den Instrumenten berührt. Alle diese Schritte werden in der AFS Kammer und der sie durchgeführt werden niemals über den Rand der Kammer bewegen kann. In ähnlicher Weise eine ausreichende Kühlung aller im AFS verwendeten Chemikalien notwendig.

  1. Stech einfrieren die Netzhautstreifen in flüssigem Propan bei -184 ° C in einem EM Kryokonservierung Instrument (CPC). Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Proben auf kleine Stücke von doppelseitigem Klebeband auf die Metallstümpfe befestigt, die auf dem Ende der Eintauchstangen gehen (Docht aus zusätzlichen Puffer mit dem Pinsel).
  2. Tauchen Sie die Stangen in die flüssige Propan und halten es für ca. 5 sec, und dann übertragen auf die automatische gefrier Substitution Instrument (AFS) ein kleines Transportkammer verwenden, die mit flüssigem Stickstoff ( "LN 2 gekühlt Kryo Transferbehälter ') gefüllt ist.
  3. die gefrorene Probe und Instrumente (Zange und Skalpell) in den AFS, kühlen die Instrumente in der Kammer nach der Platzierung für seVeral Minuten, bevor Sie das Gewebe zu berühren, oder sie kühlen, indem die Spitzen der Instrumente für ein paar Sekunden in die kleine Transportkammer platzieren (gefüllt mit flüssigem Stickstoff ( "LN 2 gekühlt Kryo Transferbehälter ')).
  4. Einmal in der AFS, entfernen Sie die Probe und das Klebeband von der Stummel einer feinen Skalpell. Auch halten die Stickstoffgasflusssteuerung, TF (TF wird als "Regler-Steuerung für LN2 Verdampfer" bezeichnet) geöffnet während dieser Vorgänge.
  5. Vor dem gefrorenen Gewebe in die Flach Einbettung Halter zu platzieren (dh vor den AFS-Einrichtung), Schnitt einen dünnen Kreis aus einem klaren Kunststofffolie und legen Sie sie in den unteren Teil der Halterung, um den Boden jeder Vertiefung zu füllen. Auf diese Weise können relativ leichteres Entfernen der polymerisierten Blöcken Probe, wenn Sie fertig.
    HINWEIS: Früher haben wir genutzt, ein alternatives Verfahren zu den flachen Einbettung Halter und Doppel Reichert + Gelatinekapseln unter Verwendung (siehe Petralia und Wenthold, 1999) 20.
  6. Verwenden Sie die folgende automatische Sequenz in der AFS (unter Verwendung Instrument Terminologie): T1 = -90 ° C für 32 h, S1 = Zunahme Temperatur von 4 ° C / h (11,3 h), T2 = 45 ° C für 50 h, S2 = Temperaturanstieg von 5 ° C / h (9 hr), T3 = 0 ° C für 40 Stunden (gesamt = 142,3 h). 4 Stunden Proben in der AFS zu platzieren (bei -90 ° C), bevor die Zeitabfolge beginnen - Es kann 2 nehmen.
  7. Tauchen die Gefrierschnitte in 1,5% Uranylacetat in Methanol bei -90 ° C für> 32 Stunden in dem AFS. Legen Sie zwei Stücke von Gewebe (in der Regel) in jedem der sieben Brunnen im Flach Einbettung Aluminiumhalter (drei passen in die AFS).
    1. Platzieren der Gewebe + Band in das Uranylacetat / Methanol in den Vertiefungen und entfernen das Band später, unmittelbar vor dem Beginn Einbettungsmedium (zB Lowicryl HM20) Infiltration, wenn es zu schwierig ist, das Gewebe von dem Band zu entfernen.
  8. Dann wird die Temperatur schrittweise erhöhen bis -45 ° C (+ 4 ° C pro Stunde; in der automatischen Sequenz).
  9. Waschen Sie die Proben dreimal in vorgekühlte Methanol, um einen spitzen Plastikpipette mit der alten Lösung von jedem Flach Einbettung Halter, und dann mit einem anderen Standard-Kunststoff-Pipette zu entfernen Sie die vorgekühlt frischem Methanol hinzuzufügen.
  10. Dann mit der gleichen Methode, infiltrieren die Proben schrittweise mit niedriger Temperatur Einbettung Harze wie Einbettungsmedium (HM20 / Methanol im Verhältnis 1: 1 und 2: 1, jeweils für 2 Stunden, gefolgt von Reinharz für 2 Stunden und dann die Harze ändern und halten O / N).
  11. Ändern Sie den Harz am nächsten Tag wieder, das Niveau des Harzes Einstellung nur bis zur Oberkante der Brunnen zu erreichen.
  12. Polymerisation der Proben (-45 ° C bis 0 ° C in automatischer Folge; + 5 ° C pro h) mit UV-Licht für 40 Stunden.
  13. Dann entfernen Sie die Proben aus der AFS. Typischerweise zeigen Probenblöcke noch etwas rosa Haut und in Farbe. Legen Sie die Proben der Nähe des Leuchtstofflampe in der chemischen Abzugshaube, bei RT O / N oder mehr, bis sie AppOhr ganz klar.

3. Postembedding EM Immungold Immunzytochemie

HINWEIS: Postembedding Immunzytochemie wird wie beschrieben durchgeführt 23,24,25.

  1. Cut 1 & mgr; m Abschnitte mit Ultramikrotoms, Fleck Abschnitte mit 1% Toluidin-Blau, und untersuchen sie für Abschnitt Orientierung; Ausrichten der Gewebeblock, um die optimale Querebene Schnitt erreichen.
  2. Cut 70 nm dicke Ultradünnschnitten mit Ultramikrotoms und sammeln sie auf Formvar-Kohlenstoff beschichteten Nickel-Spiel Gitter.
  3. Wash Gitter einmal in destilliertem H 2 O durch eine Tris-gepufferte Kochsalzlösung, gefolgt dreimal (TBS, 0,05 M Tris-Puffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) waschen.
  4. Inkubieren Gitter in 20 ul Tropfen 5% BSA in TBS für 30 min und dann in 20 ul Tropfen einer Mischung Ziegen-Anti-CTB (1: 3000) enthält, und ein Antikörper gegen ein NMDAR-Untereinheit (anti-rabbit GluN2A 1.50 , GluN2B 1:30) oder ein Anti-Kaninchen GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) mit 2% BSA und 0,02 M NaN & sub3; O / N bei RT.
  5. Wash Gitter auf drei getrennte Tropfen (20 ul) von TBS (pH 7,6) für 10, 10 und 20 min, gefolgt von TBS (pH 8,2) für 5 min.
  6. Inkubieren Gitter für 2 h auf Tropfen (20 ul) einer Mischung Esel-anti-Kaninchen-IgG (1:20), der mit 10 nm Goldpartikel und Esel anti-Ziege IgG (1:20), der mit 18 nm Goldpartikel in TBST enthaltend (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN 3.
  7. Waschen Sie Netze in 20 ul Tropfen TBS (pH 7,6) für 5, 5 und 10 Minuten, dann in ultrareinem Wasser und trocknen Sie sie dann.
  8. Gegenfärbung Gitter mit 5% Uranylacetat und 0,3% Blei Citrat in destilliertem H 2 O 8 und 5 min bei schlechten Lichtverhältnissen auf.
  9. Für Dreifachmarkierungsexperimente, inkubieren Gitter O / N bei RT mit 20 ul Tropfen einer Mischung von Anti-Ziege-CTB (1: 3000), anti-Maus-PSD-95 (1: 100) und anti-Kaninchen GluN2A (1 : 50). Dann brüten Gitter für 2 Stunden auf 20 ul Tropfen einer Mischung von IgGs gekoppelt bis 18, 10 und 5 nm Goldpartikel in TBST (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN 3. Halten Sie die gleichen Verfahren wie Doppelmarkierung zum Waschen und Gegenfärbung zwischen und nach Antikörper-Inkubation.
  10. Die Kontrollen wurden in dem die sekundären Antikörpern durchgeführt wurden allein aufgebracht.
  11. Ansicht Gitter auf einem EM und digitalisieren Bilder. Prozess endgültigen Zahlen in Adobe Photoshop 6.0 ​​nur für Helligkeit und Kontrast, wenn es notwendig ist 24.

4. Quantifizierung

  1. Zur manuellen Einstellung der Bereiche der inneren plexiformen Schicht (IPL), ohne Löcher oder Risse an 8,000X Vergrößerung, dann Fotomontage zufällig die volle Tiefe von IPL in 25,000X Vergrößerung.
  2. Identifizieren RGC Dendriten an Konus bipolaren Dyaden, wenn sie a) enthalten die retrograd transportiert CTB Signal (große Goldpartikel), b) zeigen wohldefinierte Membranen, Spalten und postsynaptischen Dichte, c) mindestens zwei kleine Gold Teil enthaltenicles innerhalb des PSD, oder mehr als eine kleine Goldpartikel entlang der extrasynaptischen Plasmamembran.
  3. Sammeln Sie 45 - 55 RGC Dendriten, basierend auf obigen Kriterien, für die quantitative Analyse.
  4. Messen der Längen der PSD und dem extrasynaptischen Plasmamembran von einzelnen RGC Dendriten mit NIH ImageJ Software. Graf Goldpartikel innerhalb von 10 nm der Membran als Membran-assoziierte, basierend auf einer durchschnittlichen Dicke von 7-9 nm für die Plasmamembran 26.
  5. Berechnen Partikeldichte als die Anzahl von Goldpartikeln pro linearem Mikrometer (gold / um). Den Abstand zwischen der Mitte jedes Goldpartikel und der Mitte des PSD (für synaptische Ort) oder den Rand des PSD (für extrasynaptischen location).
  6. Führen Sie eine statistische Analyse von Software. Verwenden zweiseitigen t-Tests Mittel zu vergleichen. Folgern Bedeutung, wenn P <0,05. Wenn nicht anders angegeben, Bericht Werte als Mittelwert ± SEM 18.

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Ergebnisse

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Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen deutlich unterschiedliche subsynaptischen Lokalisierungsmuster GluA 2/3 und NMDARs auf RGC Dendriten in Rattennetzhaut, wie zuvor 24,25 beschrieben. 77% der GluA 2/3 Immunogold Partikel in RGC dendritischen Profile wurden in der PSD (1A) befindet, ähnlich wie die meisten zentralen Synapsen. Allerdings wurden NMDARs sich entweder synaptisch oder extrasynaptically. 83% der GluN2A Immunogold Teilchen wurden in dem PSD loka...

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Diskussion

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Wir haben vier beschriebenen Techniken für eine erfolgreiche quantitative Post-Einbettung Immun EM: 1) kurze und schwache Fixierung, 2) Gefriersubstitution, 3) nach dem Einbetten von Immunfärbung und 4) Quantifizierung.

EM Immunogold ermöglicht den Nachweis von spezifischen Proteinen in ultradünne Gewebeschnitten. Markierte Antikörper mit Goldpartikeln kann direkt unter Verwendung von EM visualisiert werden. Während mächtig in die subsynaptischen Lokalisierung eines Membranrezeptors zu erfas...

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Offenlegungen

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Die Autoren machen keine Angaben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch die Interne Programme des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute on Taubheit und andere Communication Disorders (NIDCD), von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Wir danken dem NINDS EM Anlage und die NIDCD Advanced Imaging-Kern (Code # ZIC DC 000081-03) um Hilfe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ParaformaldehydEMS15710
GlutaraldehydEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
GlycerinGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555PVerdünnung 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557PVerdünnung 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506Verdünnung 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1– 046Verdünnung 1/100
Esel Anti-Kaninchen IgG-10 nm GoldpartikelEMS25704Verdünnung 1/20
Esel Anti-Maus IgG-10 nm GoldpartikelEMS25814Verdünnung 1/20
Esel Anti-Maus IgG-5 nm GoldpartikelEMS25812Verdünnung 1/20
Esel Anti-Ziege IgG-18 nm GoldpartikelJackson ImmunoResearch705-215-147Verdünnung 1/20
Formvar-Carbon-beschichtete Nickel-Schlitzgitter.EMSFCF2010-Ni
UranylacetatEMS22400-1
MethanolEMS67-56-1
BleicitratLeica
EM AFSLeica
Leica EM CPCLeica
UltramikrotomLeica
JEOL 1200 EMJEOL
flüssiger Stickstoff Roberts Sauerstoff
PropanRoberts Sauerstoff
CTBListe Biologische Laboratorien1041 - 1,2
Anti-CTBListe Biologische Laboratorien703Verdünnung 1/4.000
%

Referenzen

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  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

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Schlagwörter

Immunogold Electron MicroscopyGlutamate ReceptorsFreeze SubstitutionUltra Thin SectioningPostembedding ImmunogoldQuantitative VisualizationMembrane Protein AnalysisRetinal Ganglion CellsNMDA Receptors

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