Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Zusammenfassung

Primäre Zilien beeinflussen verschiedene Signalwege. Die Cochlea von Säugetieren ist ideal für die Untersuchung der Signalübertragung der planaren Zellpolarität (PCP). Die Dysfunktion der Zilien beeinflusst das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterung und die Ausrichtung der Haarzellen, die Messwerte des PCP. Unser Ziel ist es, die PCP-Signalübertragung in der Cochlea der Maus mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren haben sich primäre Zilien durch die Beeinflussung zahlreicher Signalwege zu Schlüsselregulatoren in Entwicklung und Krankheit entwickelt. Einer der frühesten Signalwege, der mit der Ziliarfunktion in Verbindung gebracht wurde, war der nicht-kanonische Wnt-Signalweg, der auch als planare Zellpolarität (PCP) bezeichnet wird. Einer der besten Orte, um die Auswirkungen der planaren Zellpolarität (PCP) während der Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen, ist die Cochlea von Säugetieren. Die Störung des PCP-Signalwegs in der Cochlea der Maus stört das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterbildung und die Orientierung der Haarzellen, die alle von einer Dysfunktion der Zilien betroffen sind. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Analyse der PCP-Signalübertragung in der sich entwickelnden Cochlea von Säugetieren mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu beschreiben. Defekte in der Konvergenz und Ausdehnung manifestieren sich in einer Verkürzung des Cochlea-Gangs und/oder Veränderungen in der zellulären Musterbildung, die nach der Sektion von sich entwickelnden Mausmutanten quantifiziert werden können. Änderungen der Orientierung des stereoziliären Bündels und der Länge oder Positionierung der Kinozilien können entweder mit Immunfluoreszenz oder Rasterelektronenmikroskopie (REM) beobachtet und quantifiziert werden. Ein tieferer Einblick in die Rolle von Ziliarproteinen in zellulären Signalwegen und anderen biologischen Phänomenen ist entscheidend für unser Verständnis der Zell- und Entwicklungsbiologie sowie für die Entwicklung gezielter Behandlungsstrategien.

Einleitung

Primäre Zilien sind lang Mikrotubuli-basierte Fortsätze, die von der Oberfläche der meisten Säugerzellen erstrecken. Primäre Zilien sind oft mit motile Zilien, von denen verwechselt gibt es immer mehrere pro Zelle, und deren Zweck es ist Fluids über Membranoberflächen zu bewegen. Primäre Zilien, dagegen annehmen sensorischen Rollen und sind somit auch als Sinneshärchen bezeichnet. Nachdem lange vergessen hat diese Organellen vor kurzem als Ergebnis seiner Verbindung mit einer Vielzahl von menschlichen genetischen Erkrankungen ^ein "wiederentdeckt" worden. Idealerweise als Signalorganelle angeordnet ist, hat der primäre cilium wurden zahlreiche Signalwege gezeigt zu regeln, von denen viele nicht nur wichtig in Gewebshomöostase und Krankheit, sondern auch während der Entwicklung ^2.

Einer der ersten Signalwege gezeigt mit Zilien Dysfunktion assoziiert zu sein war der nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, auch bekannt als die planare Zellpolarität (PCP) Weg > 3. Diese Signalkaskade zunächst in Drosophila identifiziert, ist entscheidend für die Embryogenese; insbesondere zur Konvergenz und Ausdehnung Prozesse und für die korrekte Ausrichtung der Zellen in der Ebene der Epithelien ^4. Die sequentielle Signalisierung einer Kernsatz von regulatorischen Proteinen übersetzt Richtungshinweise, die letztlich zu Zytoskelett-Umlagerungen führen und ⁵ in die koordinierte Polarisation von Epithelzellen in einer Ebene zur Folge haben. Der Prozess der Annäherung und Erweiterung ist absolut für den Schneckengang erforderlich zu verlängern und für die korrekte zelluläre Muster ^6. Da dies über die Aktivierung des PCP Wegs reguliert wird, eines der markantesten Phänotypen der Mutanten Cochlea PCP ist eine verkürzte Schneckengang mit desorganisiert Sinnesepithelien ^7. Ebenso Mausmutanten, die Wimpern fehlen, zeigen auch eine solche Konvergenz und Erweiterung Phänotyp ^8,9, obwohl genau, wie dies geregelt ist noch nicht geklärt werden.

ve_content "> Da Prozesse Konvergenz und Erweiterung entscheidend sind für das Auswachsen der Schneckengang und Mobil Strukturierung der Sinnesepithelien im Schneckengang, die Entwicklung von Cochlea ist eine ideale Organ, in dem PCP-Signalisierung während der Wirbeltierentwicklung zu untersuchen. Die Orgel von Corti, der Begriff der Fach Sinnesepithel gegeben, die Linien der Schneckengang, der nicht-Sinnesstützzellen und mechanosensorischen Haarzellen besteht, die einheitlich für die Schnecke ausgerichtet sein ^{muss 10} zu funktionieren. die mechanosensorischen Haarzellen sind so, weil die angerufene stereociliary Bündel, die von der Kutikula Platte (Spitzenfläche) jedes ^{Haarsinneszelle 11.} Diese dienen als Primärwandler Mechanosensation und trotz ihrer Nomenklatur als Stereozilien verlängern, sind tatsächlich von modifizierten Aktin-Filament-basierte Mikrovilli umfasste. Innerhalb jeder winkelförmige Haar Bündel, drei Reihen von Stereozilien sind in einem hoch geordneten und regelmäßigen pa organisiertttern in einem Treppenhaus artig. Echt Mikrotubuli-basierte Zilien, bezeichnet Kinozilien, werden für die Entwicklung und die Ausrichtung der stereociliary Bündel ¹² erforderlich. Bei jeder Haarzelle wird eine Einzel Kinozilium physisch an den Stereozilien Bündel befestigt, befindet sich auf dem höchsten Reihe von Stereozilien zentral nebeneinander. Die genaue Funktion des Kinozilium ist unklar, und eine Hypothese ist, dass die Kinozilium die Stereozilien in Form "zieht", wie sie von Mikrovilli ¹² reifen. Bei Wirbeltieren sind Kinozilien in der Cochlea vorhanden nur vorübergehend und von den Haarzellen in Mäusen zurückzuziehen vor dem Einsetzen ^11,13,14 hören.

Vollständiger Verlust von Zilien in den Entwicklungs Cochlea führt zu stark verkürzt Cochlea Kanäle, mis geformt und mis orientierten stereociliary Bündel sowie Fehl positioniert Basalkörpern ^8,9. Eine funktionelle Cilium ist nicht nur der Ciliar- Axonem umfasste. Viele Proteine ​​mit Zilien verbundenFunktion kommen in Komplexen lokalisiert Zilien bezogene Sub-Domains wie beispielsweise die Basaltemperatur, Übergangszone oder Ciliar- Axonem ^15. Der Grundkörper, von der Mutter centriole der Zentrosom abgeleitet, ist auch ein Mikrotubuli-Organisationszentrum für Mikrotubuli aus dem Flimmer in dem Zellkörper weg erstreckt und intrazellulären Transport sowie Ciliar- Handel regulieren. Die Ciliar- Übergangszone ist ein weiterer Bereich, in dem Ziliarfunktion in Bezug auf ¹⁶ der Organisation von Import und Export von Ciliar- Verbindungen reguliert wird.

Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen Wimpern und nicht-kanonische Wnt (PCP-Signalisierung) identifiziert, obwohl der genaue Mechanismus ¹⁷ ist unklar. Redundanz von Ciliar- und PCP-Gene und die Empfindlichkeit der Zellpolarität zu verallgemeinern Zellanomalien, machen es schwierig, direkt eine Mutation an PCP spezifische Defizite zu verknüpfen. Einer der Lese outs von PCP-Signalisierung ist die Positionierung der Basaltemperatur und primary Flimmer, damit die primären von den sekundären Defekte Trennung ist eine Herausforderung. Einige Studien im Zebrafisch und Maus-Mutanten haben keinen Zusammenhang zwischen Wimpern und Wnt-Signal ^18-20 vorgeschlagen. Abweichungen in den Daten zurückgelegt werden Spezies, Gewebe oder zeitliche abhängige Unterschiede in Ciliar- Beiträge an Wnt-Signal. Darüber hinaus könnten normale Wnt Reaktionsfähigkeit beibehalten werden, wenn Basalkörpern funktionsfähig bleiben. Ein tiefer Einblick in die Rolle von Ciliar- Proteinen in zellulären Signalwegen und andere biologische Phänomene ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der zellulären und Entwicklungsbiologie, sowie für die Entwicklung von zielgerichteten Behandlungsstrategien.

Protokoll

Verwenden und einschläfern alle Tiere in Einklang mit den institutionellen und staatlichen Richtlinien und Vorschriften, am häufigsten über _{CO 2} Inhalation und Genickbruch.

1. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: Vor Beginn, bereiten alle Reagenzien Analysequalität Chemikalien. Make-Lösungen unter Verwendung von molekularen Grad destilliert und VE-Wasser, sofern nicht anders angegeben.

1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS): Stellen 1 l 1x PBS durch 8g NaCl aufzulösen, 0,2 g KCl, 1,44 g Na _{2 HPO 4 und} 0,24 g KH _{2 PO 4} in 1 l H ₂ O. Den pH-Wert auf 7,4 mit HCl. PBS muss nicht steril sein und kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Beachten Sie, dass dieser Puffer ohne CaCl _{2 oder} MgCl ₂ besteht.
2. Paraformaldehyd (4% PFA): Bereiten Sie eine 4% ige Lösung von PFA in 1x PBS in einem belüfteten Abzugshaube. In 40 g Paraformaldehyd Pulver zu 1 l 1x PBS. Zu lösen, umrühren und Hitze auf etwa 60 ° C,und langsam fügen NaOH weise fallen den pH-Wert zu erhöhen. Sobald das Pulver aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit HCl. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter und gefrier Aliquots. Tauen Sie ein frisches Aliquot für jedes Experiment.
3. Triton-Puffer: Vorbereiten eines 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100-Lösung durch Lösen von 8,77 g NaCl in 1 l 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). 1 ml Triton X-100. Rühren Sie zu lösen. Store Triton-Puffer bei RT.
4. Triton Block: Vorbereiten 10% Ziegenserum in Triton-Puffer durch Zugabe von 1 ml Ziegenserum zu 9 ml Triton-Puffer. Lagerung bei 4 ° C. Bei Verwendung von primären in Maus Antikörpern, fügen Ziege-anti-Maus-IgG Fab bei einer Verdünnung von 1 in 200 in die Triton-Satz auf den Blockierungsschritt Fragmenten.
   HINWEIS: Bei der Planung Proben für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zu bedienen, bereiten zusätzliche Reagenzien wie unten aufgeführt.
5. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) mit Calcium und Magnesium: Machen Sie eine 1x Lösung HBSS durch aus einer Stammlösung verdünntin sterilem destilliertem H ₂ O. Wie HBSS-Puffer ist kompliziert zu Beteiligten machen und es gibt Risiken, ist es ratsam, einen vorgefertigten 10x Stammlösung zu bestellen. Die Endkonzentration von HBBS routinemäßig verwendeten Puffer ist der folgende: 1,26 mM CaCl _2, 0,49 mM MgCl ₂ -6H2O, 0,41 mM MgSO ₄ -7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH _{2 PO 4,} 4,17 mM NaHCO _3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na _{2 HPO 4,} 5,56 mM Dextrose.
6. Hepes-Puffer: Bereiten Sie eine 0,1 M Hepes-Lösung in 1x HBSS, die durch Lösen von 23,8 g HEPES in 1 l 1x HBSS-Puffer.
7. Rasterelektronenmikroskopie Fixierungsmittel (SEM Fix): Vorbereiten Fixiermittel für SEM durch Verdünnen Elektronenmikroskopie Grad Glutaraldehyd (2,5%) und Paraformaldehyd (4%) in Hepes-Puffer. Hinzufügen CaCl ₂ auf eine Endkonzentration von 10 mM.
8. 1% Osmiumtetroxid (OsO ₄₎ in Hepes-Puffer; 1% Osmiumtetroxid in Wasser: Verdünnen einer Stammlösung von Osmiumtetroxid in Hepes-Puffer, und separately in sterilem destilliertem H _{2 O,} bis zu einer Endkonzentration von 1%. Osmiumtetroxid ist hochgiftig und wird am häufigsten als eine 4% ige Lösung verkauft.
9. 1% (w / v) Gerbsäure: Man löst 0,5 g Gerbsäure in 50 ml sterilem destilliertem H ₂ O. Filter sterilisieren durch Filtrieren durch einen 0,45 Porengröße Filter.
10. Abgestuften Ethanollösung Serie: Verdünnen 200 Proof Ethanol mit sterilem destilliertem _{H 2 O} bis 30 machen, 50, 70, 90 und 95% Ethanollösungen. Für die endgültige Ethanolspülungen, 100% Ethanol 200 Nachweis ist erforderlich. Verwenden Sie ein frisch geöffneten Flasche 200 Proof Ethanol für die abschließenden Spülungen.

2. Wahl des Tissue

1. Im Idealfall untersuchen Embryonen oder junge Welpen im Alter zwischen embryonalen Tag 16,5 (E16.5) und postnatalen Tag 3 (P3).
   HINWEIS: Die Verknöcherung des knöchernen Labyrinth und Schläfenbeine macht Dissektion zunehmend schwieriger, da Mäuse reifen. Auch Kinozilien, die einzig wahre Mikrotubuli-basierte Cilium gefunden auf Haarzellen der Cochlea,während der Entwicklung zurückzieht und nicht mehr vorhanden in erwachsenen Mäusen.
2. Nach der Fixierung entkalken erwachsenen Cochlea. Verlagsort seziert knöchernen Labyrinthe, in 2 ml EDTA (4,13% in PBS), pH 7,3, in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 3 (siehe Abschnitt 3) - 4 Tage mit Rotation. Tanken täglich EDTA. Nachdem das Gewebe aufgeweicht haben gründlich in 1,5 ml oder mehr PBS 3 mal für 5 Minuten auf einem Kolbenpendel mit erhöhter Erregung.

3. Cochlea Dissection

1. Beitrag Euthanasie durch Genickbruch oder _{CO 2} Inhalation (100% _{CO 2),} entfernen Sie den Kopf. Verwenden Sie ein Skalpell oder kleine Schere, abhängig von der Größe des Tieres, den Kopf entlang der sagittalen Mittellinie an der Nase beginnt zu zerlegen und sich kaudal. Entfernen Sie das Gehirn aus jeder Hälfte des Schädels mit einer Pinzette. Identifizieren Sie die Schläfenbeine, die die Entwicklung von knöchernen Labyrinthe des Innenohrs enthalten (siehe Pfeil in 1A).
2. Verwenden Sie ein Paar fürSteinpilze, die knöchernen Labyrinthe aus dem Schädel (Os temporale) sorgfältig zu isolieren. Tun Sie dies unter einem Binokular. Ausrasten und Knochengewebe aus dem Schädel entfernt von der Pinzette vorsichtig unter den knöchernen Labyrinthe laufen. Bei Tieren P4 bis zur knöchernen Labyrinthe sind noch knorpeligen und kann leicht, ohne zu brechen entfernt werden.
3. Nach Präparation mit der Spitze der Pinzette die ovale und runde Fenster zu löschen und ein kleines Loch in der Spitze des Cochlea-Spirale machen. Befestigen Sie die knöchernen Labyrinthe vor der weiteren Zerlegung des Schneckengang. Damit für die einfache Entfernung des Deckmembran (siehe 3.7), fixieren die knöchernen Labyrinthe in 1,5 ml 4% PFA für 5 Minuten auf Eis.
   HINWEIS: Wenn die Entfernung der Deckmembran nicht erforderlich ist, wird länger Fixierung empfohlen (siehe 4,1-4,3). Kurze Fixierung der Schläfenbeine vor der Präparation der Schneckengang unterstützt die Dissektion Prozess und das Entfernen der Deckmembran. Beitrag Präparation und Freilegung des Corti-Organ, furtihre Fixierung erforderlich ist.
4. sezieren weiter die knöchernen Labyrinthe des Cochlea Sinnesepithel freizulegen, wie folgt. Legen Sie die knöchernen Labyrinthe in einem schwarzen Silikon-Elastomer beschichtet Sezieren Gericht PBS, die Präparation zu erleichtern. Verwenden minutien Stifte um das Gewebe zu immobilisieren, wenn erforderlich. Um minutien Stifte verwenden, legen Sie sie durch die vestibulären Teil der knöchernen Labyrinthe mit dem ventralen Aspekt der Cochlea-Spirale nach oben.
   HINWEIS: Die schwarze Silikon-Elastomer-Schale: Silikon-Elastomer-Basiskomponente mit Kohlenpulver mischen eine undurchsichtige schwarze Farbe zu erhalten. Fügen Sie den Härter vermischen und in eine oder mehrere Petrischalen (Glas oder Kunststoff). Trockene unter Vakuum eingefangene Luftblasen zu entfernen. Trockengerichte vollständig vor der Verwendung.
5. Verwenden feinen Pinzette (# 5) die äußere Knorpel zu entfernen Sie den Schneckengang auszusetzen. Beginnen Sie an das ovale Fenster; Legen Sie die untere Spitze der Zange in das ovale Fenster und hebeln vorsichtig den Knorpel zu öffnen, langsam nach oben in Richtung der sich bewegendenApex.
6. Nach der Belichtung der Schneckengang, entfernen Sie die Bauchseite, der Membran Reissner. Einen feinen Pinzette die Reissner-Membran an der Basis der Schneckengang zu kneifen und ziehen es in einer Aufwärtsbewegung ab. Visualisieren Sie die dorsalen Aspekt der Schneckengang, einschließlich der Sinnesepithel.
7. Entfernen Sie die Deckmembran, wie unten (optional) beschrieben. Für SEM oder Immunhistochemie des Kinozilium oder stereociliary Bündel entfernen Sie die Deckmembran.
8. Verwenden Sie einen sehr feinen Pinzette (# 55 oder feiner) die Deckmembran an der Basis der Cochlea zu klemmen und nach oben in Richtung der Spitze schälen.
   HINWEIS: Die Deckmembran ist optisch klar was es schwierig macht zu identifizieren. Nicht selten kommt die Membran in einem Stück aus, und obwohl es nicht leicht sichtbar ist, kann man den Widerstand spüren, wie sie von der freiliegenden Corti-Organ abgezogen wird.
9. Nach Aussetzen des Corti-Organ, fix weiter das Gewebe wie dunter escribed. Bewahren Sie die vestibulären Region weitere Vorbereitung der Gewebe zu unterstützen.

4. Fixation

1. Für die regelmäßige Immunhistochemie fixieren die seziert knöchernen Labyrinthe in 1,5 ml 4% PFA bei 4 ° C auf einem Kolbenpendel für 2 Std.
   Hinweis: Wegen der Empfindlichkeit von Antikörpern und Antigenen, Abweichungen in der Länge und Zusammensetzung der unterschiedlichen Fixierung erforderlich sein und sollte für jeden Antikörper optimiert werden.
2. Nach der Fixierung, waschen Sie die Proben durch in 1,5 ml oder mehr PBS 3 mal für 5 Minuten auf einem Kolbenpendel mit erhöhter Erregung spülen. Proben können in PBS bei 4 ° C über mehrere Wochen vor der Verarbeitung gelagert werden.
3. Wenn Proben für die REM-Vorbereitung, Fix Schläfenbeine in SEM-Fix (siehe 1.7) für 2 h bei RT seziert. Waschen von in 1,5 ml oder mehr Hepes-Puffer 3 mal für 5 Minuten auf einem Kolbenpendel mit erhöhter Erregung spülen. Speicher in Hepes-Puffer bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Lagerung für länger als ein paar Wochens wird nicht empfohlen.

5. Immunhistochemie

1. Führen Sie die Immunhistochemie auf seziert Proben in eine Vertiefung einer Flachboden-96-Well-Platte. Alternativ können Sie eine PCR oder Mikrozentrifugenröhrchen verwenden. Es ist ratsam, die vestibulären Teil des knöchernen Labyrinth zu behalten die Verarbeitung zu erleichtern.
2. Permeabilisieren das Gewebe durch eine Kolbenpendel unter leichtem Schütteln in 1,5 ml Triton-Puffer für 1 Stunde bei RT inkubiert.
3. Blockieren die Gewebe für mindestens 1 h bei RT in 0,5 ml Triton Block inkubiert. Wenn primären Antikörpern in der Maus angehoben, fügen anti-Maus-IgG-Fab-Fragmente auf den Block in einer Verdünnung von 1: 200 (siehe Abschnitt 1.4). Dies verringert stark unspezifische Bindung von Anti-Maus-IgG an Maus-Gewebe.
4. Inkubieren des Gewebes mit primären Antikörpern, verdünnt in Triton Block O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. Antikörper Verdünnung hängt von Antikörpern verwendet wird (siehe Abschnitt 6.1). inkubieren Alternativ Primär antibodies für 2 h bei RT. Im Idealfall ein Mindestvolumen von 0,5 ml primärer Antikörper Verdünnung verwenden. Wenn Antikörper beschränkt ist, verwenden Sie das kleinste Volumen von Antikörperverdünnung, die vollständig in das Gewebe umhüllt.
5. Waschen Sie das Gewebe in 1,5 ml oder mehr Triton-Puffer gespült, mindestens 3 mal für 15 min, auf einer Kolbenpendel mit erhöhter Agitation.
6. das Gewebe mit fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern inkubieren an den Hersteller empfohlene Konzentration verdünnt (typischerweise 1: 200-1: 1000) in Triton Block für 1 h bei RT auf einem Kolbenpendel. Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 0,5 ml sekundären Antikörperverdünnung.
   1. Zentrifugieren des verdünnten sekundären Antikörpers bei 13.000 × g für 3 min vor der Verwendung nicht-spezifische Bindung des sekundären Antikörperaggregaten zu minimieren. Schirmen Sie das Gewebe von Licht, das von diesem Schritt vorwärts zu vermeiden, dass die Fluoreszenzfarbstoffe Photobleaching.
7. Wie in Schritt 5.5, waschen das Gewebe durch in 1,5 ml oder mehr Triton-Puffer gespült, mindestens 3 mal für 15 min, auf eineNutator mit erhöhter Erregung. Lagern Sie die Proben in PBS bei 4 ° C bis zur einbaufertig.

6. Antikörperselektion

HINWEIS: Die Quelle der empfohlenen Antikörper und deren Verdünnungen sind in der Tabelle der spezifischen Materialien und Geräte aufgeführt. Führen Antikörperinkubationen, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

1. Zur Visualisierung der Mikrotubuli-basierte Kinozilium, verwenden Sie ein Ciliar- Axonem Marker wie Anti-Arl13b (1: 1000) oder anti-acetylierten-α-Tubulin (1: 800). Visualisieren Sie die Basaltemperatur einen Antikörper gegen γ-Tubulin (1: 200) oder jede andere zentrosomalen Marker.
2. Um die Aktin-Filament-reiche stereociliary Bündel visualisieren, fügen Phalloidin (1: 300 - 1000), konjugiert an eine von mehreren verschiedenen Fluorophore an den sekundären Antikörper Inkubation. Phalloidin Etiketten auch andere filamentöse Aktin Strukturen einschließlich der kortikalen Aktinfilamente dem Umfang jeder epithelialen Haarzelle umgibt. Dies ist hilfreich bei der Bestimmungder Umriß eines jeden Haarzelle. Verwenden eine alternative Membranmarker wie anti-ZO-1 (1: 500), falls erforderlich.
3. Beschriften Haarzellen der Cochlea Antikörper gegen Myosin VI (1: 1000) mit oder Myosin VIIa (1: 1000). Diese können, wenn die Beurteilung Cochlea Länge verwendet werden.

HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten sekundären auf die Mikroskop Anforderungen optimierte Antikörper.

7. Montage und Imaging

1. Die Probe wird in einem schwarzen Silikon-Elastomer-Schale mit PBS. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die vestibulären Bereich von der Cochlea-Spirale.
2. Sehr sorgfältig die zugrunde liegende Knorpel und Mesenchym aus dem Cochlea-Spirale entfernen. Die restlichen Cochlea-Spirale enthält den inneren Sulcus, Corti-Organ und Außen Sulcus.
3. Übertragen der Cochlea-Spirale in einem Tropfen PBS auf einem Objektträger platziert. Falls gewünscht, trennen die Cochlea-Spirale in Stücke entspricht eine Umdrehung. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig und kann zu führen lOSS des Gewebes. Der apikalen Oberfläche (Stereozilien Seite) der Cochlea-Haarzellen sollten nach oben in Richtung der Deck weisen.
4. Wick die PBS mit einem Adsorptionsmittel Gewebe oder ein Stück Filterpapier entfernt und vorsichtig auf die Cochlea Spiral positionieren, wenn die Epithelien und Überlappungen auf sich selbst verschoben hat.
5. Fügen Sie einen Tropfen Eindeckmittel der Cochlea Probe direkt auf und legen Sie vorsichtig mit einem Deckglas auf, darauf zu achten, um Luftblasen zu vermeiden. Keine Abstandshalter sind erforderlich; Stellen Sie das Deckglas direkt auf die Probe. Ein wasserlösliches, nicht-fluoreszierende, semi-permanenten Montage Medium, das nicht zusätzliche Schritte erfordert das Deckglas in Position zu halten wird empfohlen. Eindeckmedium und Deckglas Dicke von Spezifikationen bestimmt Mikroskop abgestimmt werden.
6. Verwenden Sie ein epifluoreszenten oder Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit hoher Vergrößerung ausgestattet (63 - 100X), hoher numerischer Apertur (1,2 bis 1,4) Ziele Bilder der Spitzenfläche des Cochlea Haarzellen zu erfassen. Verwenden loWer Ziele (5 - 20-fach) zu nehmen Bilder des Cochlea-Spirale überlappen die Länge des Schneckengang zu quantifizieren. Spiel Anregungslaser und Emissionsfiltern zu Fluorophore für Sekundärantikörper verwendet.

8. Rasterelektronenmikroskopie

1. Fahren Sie mit dem Abschnitt 4.3. SEM fixierten Proben in Hepes-Puffer Nach dem Waschen, führen Sie die folgenden Schritte unter Belüftung. Das folgende Protokoll funktioniert gut für Cochlea Gewebe und vermeidet die Verwendung von Sputter-Beschichtung mit einem leitfähigen Metall.
2. Post-fix in 1% OsO _{4 in} Hepes-Puffer für 1 h, gefolgt von 3 Waschungen mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten. Das kleinste Volumen von OsO _4, die vollständig um das Gewebe umhüllt sollte giftige Abfälle zu minimieren. Kein Rühren erforderlich.
3. Inkubieren Proben bei RT in jeder der folgenden Lösungen 1 h lang mit 3 Waschschritten mit 1 ml destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten in zwischen den Schritten: 1% Gerbsäure frisch hergestellt in Wasser und filtered vor der Verwendung; 1% OsO _{4 in Wasser,} 1% Gerbsäure in Wasser, 1% OsO _{4 in Wasser.}
4. Dehydratisierung Proben durch eine abgestufte Ethanolreihe durch Inkubation für 10 min in jedem der folgenden Verdünnungen: 30, 50, 70, 90 und 95%. Kein Rühren erforderlich.
5. Transfer Proben durch drei Änderungen, jeweils 5 Minuten, 100% Ethanol (aus einer frisch geöffneten Flasche 200 proof Ethanol).
6. Führen Sie die Proben allerdings einen kritischen Punkt trockener folgenden Anweisungen des Herstellers.
7. Montieren Sie die Proben unter Verwendung von leitfähigem Kohlenstoff Klebstoff auf der Oberseite eines SEM Stummel vor auf einem Elektronenmikroskop auf Bildgebung. Unter einem Stereomikroskop, mit einem Paar von feinen Pinzette und einem Pinsel vorsichtig auf die Probe zu positionieren mit den Cochlea-Epithel nach oben zeigt. Verwenden Sie die vestibulären Teil der Probe zu "Anker" das Gewebe an den Stummel. Lagern Sie die Proben in einem Exsikkator bis Bildgebung. Führen REM-Aufnahmen wie in Jones (2012) ²¹ beschrieben.

9.Quantifizierung

1. Nach Immunhistochemie Vorbereitung, Bilder aufzunehmen, eine epifluoreszenten oder Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. Nach der Vorbereitung für SEM, ein Rasterelektronenmikroskop zu Bild verwenden, um die Proben. Bild der Spitzenfläche des Corti-Organ mit den freiliegenden Haarzellen der Cochlea und eingelagerten Stützzellen.
2. Definieren spezifischen Positionen entlang der Schneckengang, wie beispielsweise 25, 50, und 75% von der Basis und verwenden diese Cochlea Bereichen zwischen Mutante und Kontrollproben zu vergleichen. Analysieren und Zilien Mutanten mit ihren Wurfgeschwister-Kontrollen vergleichen, da Unterschiede in der genetischen Hintergrund des Cochlea-Phänotyp modifizieren können.
   HINWEIS: Das Corti-Organ entwickelt sich in einer Steigung, die in Richtung der Mitte der Basis erstreckt sowohl der Spitze und der Basis. Bei der Maus ist die Entwicklung bis P14 nicht abgeschlossen ist, so ist es wichtig, Regionen in ähnlichen Entwicklungsstadien und Positionen zu vergleichen.
3. Nehmen Sie Bilder mit der Software das Mikroskop begleitet, die allow für die Quantifizierung der bestimmten Phänotyp wie erforderlich (siehe unten). Verwenden Bildanalyse-Software wie beispielsweise Bild J oder Software das Mikroskop begleitenden Längen zu messen, zählen Zellen und Proteinlokalisierung bestimmen, wie unten beschrieben. Graph diese Daten als Balkendiagramm, Punktdiagramm, Box-Blot oder Histogramm, mutierte vs. Kontrolle zu vergleichen.
4. Gesamtlänge des Schneckengang (3A):
   1. Mit Hilfe einer Haarzelle Marker oder Phalloidin, (die die stereociliary Bündel markiert), bestimmen und zu messen, wo die Sinnesepithel beginnt und endet. Die Länge des Schneckengang wird häufig in Cilien Mutanten verkürzt.
5. Stereociliary Bündel Anomalien (3B, D, E, G):
   1. Messen Bündel Konvexität (Höhe) als der kürzeste Abstand zwischen dem Scheitelpunkt des Bündels und der Strecke, wie durch die beiden Enden des Bündels "Arme" in Figur 3G dargestellt erstreckt, links. Alternativ quantifizieren den Bereichvon den Armen der äußeren Haarzellen stereociliary Bündel umfasst, wie in Abbildung 3G gezeigt, richtig. Wenn Haarzellen mit kreisförmigen stereociliary Bündel identifiziert werden können diese als Prozentsatz der gesamten Haarzellen zählen.
      HINWEIS: In vielen Ciliar- Mutanten Bündel Anomalien unabhängig von Bündelorientierung beobachtet werden. Es ist schwierig, genau stereociliary Bündel Anomalien quantifizieren.
6. Orientierung der stereociliary Bündel (3B, C, G):
   1. Beurteilung der Ausrichtung jedes einzelnen Bündels relativ zu einer Linie senkrecht zu der Reihe von Säulen Zellen erstreckt, die die inneren und äußeren Haarzellen trennt. Zellen mit einer normalen Ausrichtung entlang dieser senkrechten Achse ausgerichtet sind und so eine Drehung von 0 ° aufweisen. Bestimmen Drehwinkel entweder eine 360 ​​° Notation oder als absoluten Abweichungen von 0 ° verwendet wird.
7. Kinozilien Positionierung oder stereociliary Bündel Positionierung (Abbildung3B, F, H):
   1. Graf den Prozentsatz der Zellen, in denen Kinozilien fehlen. Messen Sie den Abstand von der Kinozilium dem "Scheitel" oder Mitte des Bündels. Die "Vertex" des Bündels kann nicht einfach sein, zu definieren, wenn Pakete sind abnormal, so dass die Mitte des Bündels kann stattdessen verwendet werden.
8. Quantifizierung der Position Kinozilien und stereociliary Bündel auf der apikalen Haarzelloberfläche, durch eine Positions Gitter auf jeder Haarzelle überlagert und die Kennzeichnung die Position von entweder der Basis des Kinozilium oder dem Scheitelpunkt / Mittelpunkt der stereociliary Bündel. Anzeigen der Daten als Prozentsatz jeder Kategorie, die in einer bestimmten Region des Gitters liegt, und durch Überlagerung der Positionen der einzelnen Markierung auf einer Positionsraster.
   HINWEIS: In Kontrollgeweben, Kinozilien werden immer an der Spitze des stereociliary Bündel angebracht. In Zilien Mutanten fehlen Kinozilien oft, mislocalized dennoch angebracht, oder sogar vollständig von den s abgelösttereociliary Bündel.
9. Kinozilien Länge (Abbildung 3I):
   1. Messen Sie die Länge des Kinozilium indem sie mit einem Ciliar- Axonem Marker Beschriftung. Nur Kinozilien messen, die innerhalb eines 1,5 um Konfokalebene flach liegen. Bestätigen Sie, dass Zilien flach liegen durch eine Querschnittsansicht des gescannten Gewebe zu beobachten. Vergleichen Alter abgestimmte Proben aus dem gleichen Bereich der Cochlea, da die Kinozilium während der Entwicklung zurückzieht.
10. Fehllokalisation von Polarität Proteinen:
    1. Im Anschluss an die Immunhistochemie Antikörper gegen Polarität Proteine ​​wie Vangl2 und Gαi3, bestimmen die Lokalisierung via Bildgebung.

HINWEIS: In einigen Zilien Mutanten, Lokalisierung von Polarität Proteinen gestört wird. Dazu gehören Vangl2 und Gαi3, die gezeigt haben, in Ift20, BBS8 und Bbs6 Mutante Cochlea gestört zu werden.

HINWEIS: Weitere Beispiele dafür, wie Polarit zu quantifizieren und Zell Haar Anzeigey in den folgenden Veröffentlichungen gefunden werden. Curtin, et al. (2003) Current Biology ^22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature ^7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience ^23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology ^24, Mai-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology ^25, Yin et al (2012) PLoS ONE ^26.

Ergebnisse

Cochlea Dissection und Gewebepräparation

Nach der Entfernung des Gehirns, eine Anzeige Mittellinie sagittale Sektion eines P0 Mauskopf, der knöchernen Labyrinth, von hinten gesehen, kann sichtbar gemacht werden (Abbildung 1A, weißer Pfeil) und entfernt. 1B zeigt die isolierten knöchernen Labyrinthe mit dem Cochlea-Haar nach oben, Bauch, (links) und von hinten, Rücken (rechts)....

Diskussion

Bei Cochlea-Gewebe für die Analyse vorzubereiten, gibt es ein paar wichtige Punkte zu beachten. Zum einen Hintergrund in der genetischen Unterschiede können die Cochlea-Phänotyp zu ändern, ist es notwendig zu analysieren und zu vergleichen, nur littermate Kontrollen machen. Zweitens vollständige Entfernung des Deckmembran ist erforderlich, um die besten Bilder mit Immunhistochemie zu erhalten, und ist wesentlich für SEM. Die Deckmembran ist eine undurchsichtige Struktur und kann die Zellen der Sinnesepithel direkt darun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Werkzeuge/Ausrüstung
Silikonelastomer - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Siehe Anmerkung 2
Mikro-Präparierschere - gerade Klinge	Verschiedene
Feine Pinzetten (Nr. 5 und 55) und stumpfe Pinzetten	Verschiedene
Präpariermikroskope.	Diverse
Mikroskop-Objektträger aus unbeschichtetem Glas Diverse
Mikroskop-Deckgläser (22 mm & mal 40 mm & mal 0,15 mm)	Diverse
Transferpipetten	Diverse
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
REM-Probenhalter	tousimis	8762
Rasterelektronenmikroskopie-Bolzen	TED PELLA	16111
PELCO Tabs: Carbonkleber	TED PELLA	16084-3
Fluoreszenzmikroskop	Verschiedenes
Kritischpunkttrockner	Verschiedenes
Rasterelektronenmikroskop	Diverse
Objektträger aus Glas Diverse
Deckgläser	Diverse
Kimwipe Gewebe	Verschiedene
feine Pinselreagenzien
1&mal; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldehyd  (PFA) (EM-Klasse für EM erforderlich)	Verschiedenes		Bereiten Sie eine 4%ige Lösung in 1&mal; PBS jedes Mal frisch gemacht. EM-Klasse erforderlich für EM.
2,5% Glutaraldehyd Grade1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7,5)	Verschiedenes
NaCl	Verschiedenes
CaCl 2	Verschiedenes
Triton X-100	Verschiedenes
Normales Ziegenserum	Verschiedenes
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Maus IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Eindeckmedien	SouthernBiotech	0100-01
10 x mal; Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
Osmiumtetroxid (OsO4	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
Gerbsäure	Sigma-Aldrich	403040
Ethanol 200 proof	Verschiedene
Antikörper
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Empfohlene Konzentration 1:1.000
anti-acetyliertes Tubulin (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Empfohlene Konzentration 1:800
anti-gamma-Tubulin (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Empfohlene Konzentration 1:200
anti Zo_1	Invitrogen	40-2300	Empfohlene Konzentration 1:500
Myosin VI	Proteus Biosciences	25-6791	Empfohlene Konzentration 1:1000
Myosin VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Empfohlene Konzentration 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Empfohlene Konzentration 1:250
anti Gα i3	Sigma-Aldrich	G4040	Empfohlene Konzentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Empfohlene Konzentration 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Empfohlene Konzentration 1:300 - 1.000