Methodenartikel

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

DOI:

10.3791/53566

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4. Februar 2016

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1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Zusammenfassung

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Genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVIs) haben sich bis zu dem Punkt verbessert, an dem sie beginnen, für In-vivo-Aufzeichnungen nützlich zu sein. Während das ultimative Ziel darin besteht, die neuronale Aktivität in vivo abzubilden, muss man in der Lage sein, die Aktivität einer einzelnen Zelle abzubilden, um eine erfolgreiche In-vivo-Vorbereitung zu gewährleisten. In diesem Verfahren wird beschrieben, wie das Membranpotenzial in einer einzelnen Zelle abgebildet werden kann, um eine Grundlage für die spätere Abbildung in vivo zu schaffen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren zur Bildgebung von GEVIs, die aus einer spannungsmessenden Domäne bestehen, die entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) oder zwei fluoreszierenden Proteinen fusioniert ist, die in vitro zum Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) fähig sind. Die Verwendung eines Bildsplitters ermöglicht die gleichzeitige Projektion von Bildern, die mit zwei verschiedenen Wellenlängen erzeugt wurden, auf dieselbe CCD-Kamera (Charge-Coupled Device). Der Bildsplitter positioniert einen zweiten Filterwürfel im Strahlengang. Dieser zweite Filterwürfel besteht aus einem dichroitischen und zwei Emissionsfiltern zur Trennung der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzwellenlängen in Abhängigkeit von den FPs des GEVI. Dieser Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung des Akzeptor- und des Donor-Fluoreszenzpartners, während das Membranpotential über die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration manipuliert wird. Bei Verwendung eines GEVI, das aus einem einzigen FP besteht, kann der zweite Filterwürfel entfernt werden, so dass die Spiegel im Bildsplitter ein einzelnes Bild auf die CCD-Kamera projizieren können.

Einleitung

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Der Schwerpunkt dieses Aufsatzes ist das optische Abbildungsveränderungsmembranpotentiale in vitro zu zeigen, unter Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen. Imaging Änderungen des Membranpotentials bietet die aufregende Möglichkeit, die Aktivität von neuronalen studieren. Wenn Änderungen des Membranpotentials führen zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität, wird jedes Pixel der Kamera ein Surrogat Elektrode eingriffsfreien Messung der neuronalen Aktivität ermöglicht. Seit über vierzig Jahren, organische spannungsabhängigen Farbstoffen wurden zur Beobachtung der Veränderungen des Membranpotentials 4.1 nützlich. Jedoch fe....

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Protokoll

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Ethik-Erklärung: Die Tierversuch Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee bei KIST Tier Protokoll 2014-001 genehmigt wurde.

1. Geräte-Setup

  1. Imaging-Setup
    1. Zeigen eines invertierten Fluoreszenzmikroskop auf einer Vibrationsisolation Tisch. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung (60X Ölimmersionsobjektiv mit 1,35 numerischer Apertur) Objektivlinse und eine Filterwürfel mit einem dichroitischen Spiegel und Filter für die Fluoreszenzproteine ​​für die Spannung Bildgebung verwendet.
      Anmerkung: Dieser Aufbau verwendet einen inversen Mikroskop zu verwenden, um Ziele mit höherer NA, aber auch aufrec....

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Ergebnisse

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Transient transfizierten Zellen können signifikante Veränderung in der Fluoreszenzintensität zeigen und den Grad der Plasmamembranexpression. Auch auf dem gleichen Deckglas haben einige Zellen Ebenen der inneren Fluoreszenz variiert. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Menge an Transfektionsmittel von der Zelle absorbiert. Gelegentlich zuviel Ausdruck der Zelle bewirkt, dass die entfaltete Protein-Reaktion, was zu Apoptose 27 zu erfahren (helle, runde Zellen mit hohen intern.......

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Diskussion

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Das Nervensystem verwendet Spannung auf mehrere verschiedene Arten, Hemmung verursacht eine leichte Hyperpolarisation, synaptischen Eingangs bewirkt eine leichte Depolarisation und ein Aktionspotential führt zu einer relativ großen Spannungsänderung. Die Fähigkeit von GeViS Änderungen des Membranpotentials zu messen bietet das vielversprechende Potential von gleichzeitig mehreren Komponenten neuronaler Schaltkreise analysieren. In diesem Bericht zeigen wir eine grundlegende Methode zur Bildgebung Änderungen des Membranp.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das World Class Institute (WCI) Programm der National Research Foundation of Korea, finanziert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie von Korea Grant WCI 2009-003 und das Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee wurde durch das Global Ph.D. Fellowship-Programm (NRF-2013H1A2A1033344) der National Research Foundation (NRF) beim Bildungsministerium (MOE, Korea) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Inverses MikroskopOlympusIX71
60X Objektiv (numerische Apertur = 1,35)OlympusUPLSAPO 60XO
AnregungsfilterSemrock  FF02-472/30Für die Spannungsabbildung von Super-Ekliptik pHluorin im dichroitischen Spiegel von Bongwoori
SemrockFF495-Di03-25x36
EmissionsfilterSemrockFF01-497/LP
75W Xenon-BogenlampeCAIRNOptoSource IlluminatorLEDs und Laser sind ebenfalls effektive Lichtquellen
CCD-Kamera mit langsamer GeschwindigkeitHitachiKP-D20BU
Dual-Port-KameraadapterOlympusU-DPCAD
Hochgeschwindigkeits-CCD-KameraRedShirtImaging, LLCNeuroCCD-SM
BildsplitterCAIRNOptosplit 2
AnregungsfilterSemrockFF01-475/23-25Für die Spannungsabbildung von FRET-Paar-basierten GEVI bestehend aus Clover und mRuby2)
Dichroitischer SpiegelSemrockFF495-Di03-25x36
EmissionsfilterChromaET520/40
Dichroitischer SpiegelSemrockFF560-FDi01-25X36
EmissionsfilterChromaET645/75
SchwingungsisolationssystemKinetic systems250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching-KammerWarner InstrumentsRC-26G, 64-0235
#0 Mikro-Deckglas (22 x 40 mm)Elektronenmikroskopie Sciences72198-20
TemperaturreglerWarner InstrumentsTC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - Glasdeckglas mit 10 mm DurchmesserTed Pella260366
LipofektionsmittelLife Technologies11668-027
Calciumphosphat-ReagenzClontech - Takara631312
Patch-Clamp-VerstärkerHEKAEPC 10 USB-Verstärker
Mehrkanal-DatenerfassungssoftwareHEKAPatchmaster
Bilderfassungs- und -analysesoftwareRedShirtImagingNeuroplex
Spreadsheet-AnwendungssoftwareMicrosoftMicrosoft Excel 2010
Datenanalyse-SoftwareOriginLabOriginPro 8.6.0
LupeQioptiq LINOSOptem Standard Kamerakoppler 0,38x SC38 J Klemme
Konfokales MikroskopNikonNikon A1R Konfokales Mikroskop
Anti-Fade-ReagenzLife TechnologiesP36930

Referenzen

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  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during act....

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Schlagwörter

Genetisch kodierte SpannungssensorenFRET basierte GEVIeinzelnes fluoreszierendes ProteinImage SplitterWhole Cell Patch ClampHEK293 ZellenImaging des MembranpotenzialsAnalyse der Fluoreszenz nderungCCD Kamera Akquisition

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