Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Summary

Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Abstract

Genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVIs) haben sich bis zu dem Punkt verbessert, an dem sie beginnen, für In-vivo-Aufzeichnungen nützlich zu sein. Während das ultimative Ziel darin besteht, die neuronale Aktivität in vivo abzubilden, muss man in der Lage sein, die Aktivität einer einzelnen Zelle abzubilden, um eine erfolgreiche In-vivo-Vorbereitung zu gewährleisten. In diesem Verfahren wird beschrieben, wie das Membranpotenzial in einer einzelnen Zelle abgebildet werden kann, um eine Grundlage für die spätere Abbildung in vivo zu schaffen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren zur Bildgebung von GEVIs, die aus einer spannungsmessenden Domäne bestehen, die entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) oder zwei fluoreszierenden Proteinen fusioniert ist, die in vitro zum Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) fähig sind. Die Verwendung eines Bildsplitters ermöglicht die gleichzeitige Projektion von Bildern, die mit zwei verschiedenen Wellenlängen erzeugt wurden, auf dieselbe CCD-Kamera (Charge-Coupled Device). Der Bildsplitter positioniert einen zweiten Filterwürfel im Strahlengang. Dieser zweite Filterwürfel besteht aus einem dichroitischen und zwei Emissionsfiltern zur Trennung der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzwellenlängen in Abhängigkeit von den FPs des GEVI. Dieser Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung des Akzeptor- und des Donor-Fluoreszenzpartners, während das Membranpotential über die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration manipuliert wird. Bei Verwendung eines GEVI, das aus einem einzigen FP besteht, kann der zweite Filterwürfel entfernt werden, so dass die Spiegel im Bildsplitter ein einzelnes Bild auf die CCD-Kamera projizieren können.

Introduction

Der Schwerpunkt dieses Aufsatzes ist das optische Abbildungsveränderungsmembranpotentiale in vitro zu zeigen, unter Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen. Imaging Änderungen des Membranpotentials bietet die aufregende Möglichkeit, die Aktivität von neuronalen studieren. Wenn Änderungen des Membranpotentials führen zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität, wird jedes Pixel der Kamera ein Surrogat Elektrode eingriffsfreien Messung der neuronalen Aktivität ermöglicht. Seit über vierzig Jahren, organische spannungsabhängigen Farbstoffen wurden zur Beobachtung der Veränderungen des Membranpotentials ^4.1 nützlich. Jedoch fehlt diesen Farbstoffen zelluläre Spezifität. Darüber hinaus sind einige Zelltypen schwierig zu färben. Genetisch kodierte Spannungsanzeigen (GeViS) überwinden diese Einschränkungen durch die Zellen spezifisch ausdrücken die fluoreszierende spannungsempfindliche Sonde untersucht werden müssen.

Es gibt drei Klassen von GeViS. Die erste Klasse von GEVI verwendet die vorsorgungs--Sensing-Domain von der Spannungsfühl Phosphatase entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) ^5-9 oder ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Paar ^10-12. Die zweite Klasse von Sensoren verwendet mikrobiellen Rhodopsin als Fluoreszenzindikator direkt ^13-15 oder über elektrochromen FRET ^16,17. Die dritte Klasse verwendet zwei Komponenten, die genetische Komponente eine Membran verankert FP und eine zweite Komponente, die eine membrangebundene Abschrecken Farbstoff ist ^18-20 ist. Während die zweiten und dritten Klassen, die für in vitro und Scheibe Experimente sind ^19,20, nur die erste Klasse von Sensoren liegen noch nützlich für die in vivo ⁶ analysiert.

In diesem Bericht werden wir die Darstellung von Membranpotential unter Verwendung der ersten Klasse von GeViS (Abbildung 1) in vitro zeigen. Diese erste Klasse von Spannungssensoren ist am einfachsten zu in-vivo-Bildgebung übergeht. Seit GeViS utilizing eine Spannung fühlenden Domain auf einen FP verschmolzen sind etwa 50-fach heller als das Rhodopsin Klasse von Sensoren, können sie eher als einen extrem leistungsfähigen Laser erfordern mit Bogenlampe Beleuchtung abgebildet werden. Eine weitere Folge der Unterschiede in der Helligkeit ist, dass die erste Klasse von GeViS leicht die Autofluoreszenz des Gehirns übersteigen kann. Die Rhodopsin-basierte Sonden kann es nicht. Die dritte Klasse von Sensor ist ebenso hell wie die erste Klasse erfordert aber die Zugabe eines chemischen Quencher, die schwierig in vivo zu verabreichen.

Wir werden daher zeigen die Übernahme einer Sonde mit einem einzigen FP (Bongwoori) ^{8 und} eine Sonde, bestehend aus einem FRET-Paar (Nabi ^{2) 12.} Die FRET-Konstrukte in diesem Bericht sind Schmetterling Versionen VSFP-CR (spannungssensitiven Fluoreszenzproteine ​​- Klee-mRuby2) ^11, bestehend aus einem grün fluoreszierenden Spender, Klee, und ein rot fluoreszierendes Akzeptor, mRuby2 namens Nabi 2.242 und 2.244 Nabi

Abbildung 1. Zwei Arten von genetisch kodierte Spannungsanzeiger (GeViS) abgebildet in diesem Bericht (A) ein FP Mono basierend GEVI ein Transmembranspannung-Sensing-Domäne und ein fluoreszierendes Protein mit. (B) Ein FRET basierten GEVI bestehend aus einem Transmembranspannung-Sensing-Domäne, einer FRET-Donor und Akzeptor. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

Ethik-Erklärung: Die Tierversuch Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee bei KIST Tier Protokoll 2014-001 genehmigt wurde.

1. Geräte-Setup

1. Imaging-Setup
   1. Zeigen eines invertierten Fluoreszenzmikroskop auf einer Vibrationsisolation Tisch. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung (60X Ölimmersionsobjektiv mit 1,35 numerischer Apertur) Objektivlinse und eine Filterwürfel mit einem dichroitischen Spiegel und Filter für die Fluoreszenzproteine ​​für die Spannung Bildgebung verwendet.
      Anmerkung: Dieser Aufbau verwendet einen inversen Mikroskop zu verwenden, um Ziele mit höherer NA, aber auch aufrechte Mikroskope verwendet werden kann. Tatsächlich ist das invertierte Mikroskop nur für Sonde Entwicklung da höhere numerische Apertur (NA) Objektivlinse mehr Licht als die mit einer niedrigen NA sammelt dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR verbessern; kann als die Spitzen optischen Signals beschrieben werden, indem die geteilte Standardabweichung von der BasislinieFluoreszenz) der Aufnahme. Für Nicht-Entwickler, würden wir eine aufrechte Mikroskop für Anwendungen wie Scheibe oder in vivo-Aufnahmen empfehlen.
   2. Bereiten Sie eine Lichtquelle, z. B. Xenon-Bogenlampe, ausgestattet mit einem mechanischen Verschluss für eine effiziente Epifluoreszenz Weitfeld-Bildgebung. Lenken das Licht an das Mikroskop über einen Lichtleiter montieren. Das Licht wird durch den Anregungsfilter passieren und wird durch den ersten dichroitischen Spiegel in dem Filterwürfel reflektiert. Richten des Lichts der Probe gleichmäßig mit maximierter Lichtintensität über das Sichtfeld ²¹ zu beleuchten.
      Hinweis: Traditionell wurde eine 75-Watt-Lichtbogenlampe verwendet, da mit höherer Wattzahl Glühbirnen schaffen größer, aber nicht heller Beleuchtung Felder. Laser können verwendet werden, aber mit einer einzelnen Wellenlänge beschränkt. LEDs werden immer heller und in der Tat die Lichtquelle der Wahl bietet mehrere Wellenlängen und nicht ein mechanischer Verschluss erforderlich sein kann.
   3. Montieren Sie die zwei CCD-Kameras an den fluoreszierrenz Mikroskop wie in 2D gezeigt.
      Hinweis: Die erste CCD-Kamera mit hoher räumlicher Auflösung und wird zur Identifikation einer Zelle die Expression des GEVI in der Plasmamembran verwendet, um zu prüfen. Für die Bildgebung Änderungen des Membranpotentials, sicherzustellen, dass die zweite CCD-Kamera eine hohe Bildrate wie 1000 Bildern pro Sekunde (fps) hat. Verwenden Sie einen Dual-Port-Kamera-Adapter (Abbildung 2D- (3)), um die bildgebenden Weg zwischen den zwei CCD-Kameras zu wechseln. In dieser Konfiguration wird ein demagnifier verwendet, um das Bild von der Objektivlinse auf den CCD-Chip in der zweiten CCD-Kamera zu passen.
   4. Installieren Sie einen Bildteiler zwischen dem ersten (langsam) und zweiten (schnell) CCD-Kameras für die Bildgebung von FRET basierten GEVI. Legen Sie eine Filterwürfel einen dichroitischen Spiegel aufweist (560 nm) und zwei Emissionsfiltern (520 nm / 40 & 645 nm / 75) in der Bild-Splitter. Dies wird in zwei Sichtfelder führen, eine für die Donor-Fluoreszenz und der andere Vertreter der Akzeptor-Fluoreszenz. Entfernen dieser second Filterwürfel bei der Abbildung eines GEVI mit einem einzigen FP.
      Hinweis: Die einzigen FP basierend GEVI in diesem Verfahren getestet Bongwoori ist, die die FP verwendet, super Ekliptik pHluorin A227D (SE A227D). Die Anregungsfilter (472 nm / 30), Emissionsfilter (497 nm / long pass) und der dichroitische Spiegel (495 nm) wurden auf der Grundlage ihrer Anregungs- und Emissionsspektren ^{5 ausgewählt.} Im allgemeinen sollten die Anregungs- und Emissionsfilter haben die größte Überdeckung mit jedem Spektrum des Fluorophors ein helles Bild, während die dichroitischen Spiegel blockiert jede Anregungslicht übertragen durch den Emissionsfilter zu erwerben. Die Auswahl von Filtern und dichroitischen Spiegeln für die FRET-Paar ^{11 basierend} GEVI Aufzeichnung nach dem gleichen Prinzip, außer daß sie eine zweite Filterwürfel in dem Bildteiler erfordert für die gleichzeitige Beobachtung der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz. Die erste Filterwürfel in dem Mikroskop Filterkasten platziert braucht ein Anregungsfilter (475 nm / 23) für Clover zu haben. Dann wird die emittierte fluorescence von beiden FPs wird zur zweiten Filterwürfel durch den ersten dichroitischen Spiegel (495 nm) übertragen werden. Die zweite Filterwürfel hat einen dichroitischen Spiegel (560 nm) und zwei Emissionsfilter (520 nm / 40 Clover und 645 nm / 75 für mRuby2) für jede FP somit die Fluoreszenz von zwei verschiedenen FPs trennt.

		Einzel FP basierend GEVI (Bongwoori)	FRET-Paar basierend GEVI (Nabi 2,42 & Nabi 2,44)
Erste Filterwürfel in das Mikroskop gelegt	Anregungsfilter	472 nm / 30	475 nm / 23
	dichroitischer Spiegel	495 nm	495 nm
	Emissionsfilter	497 nm / langen Pass	-
Zweite Filterwürfel in dem Strahlteiler plaziert	dichroitischer Spiegel	-
	Emissionsfilter ein	-	520 nm / 40
	Emissionsfilter 2	-	645 nm / 75

Tabelle 1. Zwei verschiedene Filter Sets Wird für eine Einzel FP Basierend GEVI und FRET-Based GEVI Recordings

2. Schwingungsisolierung
   1. Verwenden Sie keine Geräteträger mit Komponenten auf der Schwingungsisolierung Tabelle bewegen. Stellen Sie sicher, dass die Kabel, die an nicht-isolierte Geräte gebunden sind lose Schwingung der Probe zu vermeiden.
3. Patch-Clamp-Kammer
   1. Verschließen Sie den Boden der Patch-Clamp-Kammer mit einer dünnen # 0 Deckglas, da der Arbeitsabstand des Objektivs relativ klein ist. Dies ist ein Nachteil der invertierten Mikroskopaufbau.
      Hinweis: Da ein Kompromiss einen hohen NA Objektiv zu haben, verringert sich der Arbeitsabstand. Um die Specim zu platzierenen innerhalb der sehr kurzen Arbeitsabstand, das Deckglas und das Deckglas (Schritt 2) müssen so dünn wie möglich zu sein.
4. Temperaturkontrolle
   1. Stellen Sie sicher, dass das Bad Lösung einen Temperaturregler fließt durch die gepatchte-Zellen zu erhalten rund 33 ^{° C} während des Experiments.
5. Geräteanschlüsse
   1. Verbinden Sie die Patch-Clamp-Verstärker und die mechanische Verschluss der Lichtquelle zu dem Bajonett Neill-Concelman (BNC) Befehlsfeld des Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera. Dadurch wird die Bildbearbeitungssoftware zur Steuerung des Verstärkers, die Kamera und die Lichtquelle gleichzeitig ermöglichen.
      Anmerkung: Die elektrische und Abbildungskomponenten müssen, um synchronisiert zur gleichzeitigen elektrischen und optischen Aufnahmen der elektrischen Aktivität zu ermöglichen.

Abbildung 2. Anlegenment Setup for Voltage Imaging mit GeViS Der Arbeitsablauf nach dem Lichtweg, (A) 75 W Xenon-Bogenlampe, (B) wird das Anregungslicht von der Bogenlampe von der Anregungsfilter gefiltert und dann durch den ersten dichroitischen Spiegel reflektiert, bevor es reicht bis der Probentisch, ein Einsatz in der oberen rechten Ecke zeigt die gesamte Zellenkonfiguration, (C) die langsame Geschwindigkeit CCD-Kamera verwendet wird sowohl Wahl einer Zelle und Patch-Clamp zu unterstützen, (D), um die Bildaufnahmeteil; (1) die Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera, (2) die Bildteiler für beide FRET-Paar und Mono FP GeViS, (3) die demagnifier das Bild auf dem CCD-Chip in dem Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera zu passen, (4) die Dual-Port Kameraadapter des Abbildungsweges und (5) die langsame Geschwindigkeit CCD-Kamera mit hoher räumlicher Auflösung zur Identifizierung der Zelle Patch, (E & F) die Bildaufnahme mit einer einzigen-FP basierend GEVI (E) und einem FRET-basierten GEVI zu wechseln(F). Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Expression von GeViS

1. In humanen embryonalen Nieren 293-Zellen
   1. Kultur Menschliche embryonale Nieren 293 (HEK 293) -Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum ^{bei 37 °} C in _{einem CO 2 -Inkubator} (5% _{CO 2).} Verwenden Sie eine Gewebekulturschale mit 100 mm Durchmesser und 20 mm Höhe. Starten Sie die Kultur mit 2 x ^{03 bis 06 Oktober} x ^{10 3 Zellen} / cm ² und inkubieren, bis sie 80-90% Konfluenz für die anschließende Transfektion erreichen.
   2. Am Tag der Transfektion, die Zellmedien absaugen und vorsichtig waschen einmal mit Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Zerstreuen die HEK 293-Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 1-2 Minuten, die Lösung absaugen und sanft auf die Seite der Schale tippen Sie auf das c zu lösenEllen. In frischem DMEM (10% FBS) und distanzieren die verklumpten Zellen durch Pipettieren. Bestimmen Sie die Zellkonzentration durch eine Zählkammer.
   3. Zeigen 0,08 bis 0,13 mm dick, 10 mm Durchmesser Deckgläser vorbeschichtet mit Poly-L-Lysin in einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Saatgut die HEK 293-Zellen auf Deckgläsern bei 1 x ^{10 5 Zellen} / cm ² Zelldichte.
      Hinweis: Da HEK 293-Zellen zur Bildung von Gap Junctions miteinander fähig sind, die Anzahl der Samen isolierten Zellen zu erhalten muss.
   4. Transfektion der Zellen transient mit einem geeigneten Gen-Konstrukt kodierend ein GEVI durch eine Lipofektion Reagens gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Die Genkonstrukte für diesen Schritt verwendet pcDNA3.1 verwendet (Bongwoori) und pUB2.1 (Nabi 2,242) als Rückgrat Vektoren. Die Menge der DNA verwendet wurde, war 100 ng pro Deckglas; jedoch müssen Transfektionsbedingungen empirisch ermittelt werden für jede GEVI getestet werden.
2. In dissoziierten Maus Hüftepocampal primären Neuronen
   1. Sezieren Hippocampus aus embryonalen Tag 17 C57BL6 / N Mäuse und distanzieren dann die Hippocampus-Neuronen als zuvor ^22,23 beschrieben.
   2. Platte die distanzierte Neuronen auf Poly-D-Lysin beschichteten 0,08-0,13 mm dick, 10 mm Durchmesser Deckgläser mit 1 x ^{10 5 Zellen} / ml Zelldichte. Inkubieren der Zellen bei ^{37 °} C in CO _{2 -Inkubator} (5% _{CO 2).}
   3. Transfizieren die dissoziierten Neuronen transient bei 6 - 7 Tagen in vitro (DIV) mit einem Gen-Konstrukt einen GEVI Codierung durch eine Calciumphosphat-Transfektion Reagenz wie zuvor beschrieben ^24.
      Hinweis: Die Genkonstrukte für diesen Schritt verwendet pcDNA3.1 verwendet (Bongwoori) und pUB2.1 (Nabi 2,244) als Rückgrat Vektoren. Die Menge an DNA betrug 1 & mgr; g pro Deckglas. Auch hier müssen Transfektionsbedingungen für jede GEVI getestet empirisch bestimmt werden.
3. Schauen Sie sich die Expressionsniveau vor ima auf SpannungsGing
   1. Nehmen Sie die Gewebekulturplatte aus dem _{CO 2} Inkubator und beobachten die Fluoreszenz von den transfizierten Zellen unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop.
   2. Nach der Bestätigung, 3 die Fluoreszenz von der Membran, übertragen das Deckglas zum Patchen Kammer für die Spannung Bildgebung im Schnitt.
      Hinweis: Die Spannung Bildgebung durchgeführt wird, von 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion. Jedoch, wie verschiedene fluoreszierende Proteine ​​unterschiedliche Reifezeiten haben, müssen einige GeViS mehr Zeit bei der Nachbearbeitung der Transfektion. Beispielsweise zum Ausdruck bringen kann länger dauern, die FRET-Paare mRuby2 in diesem Protokoll enthalten, da die Reifung von mRuby2 dauert wesentlich länger als Clover ^11. Die Fluoreszenz von Spender und Akzeptor sollten überprüft werden.

3. Spannung Imaging Protocol

1. Wählen Sie eine gesunde Zelle mit guten Membranexpression
   1. Mit Mikroskopie, finden eine gesunde Zelle (4B), das zeigt, starkMembran lokalisierte Fluoreszenz im Vergleich zu internen Fluoreszenz. Versuchen Sie, nicht gerundeten Zellen zu patchen. Rundzellen sind entweder teilenden oder zu sterben und sind schwer zu patchen. Tragen Sie eine Testimpuls von 5,0 mV in der Amplitude und 5,0 ms Dauer nachfolgende Patch-Clamp-Experimente zu unterstützen.
2. Bereiten Sie die Zelle für Spannung Bildgebung
   1. um eine Zelle zu Patch, legen Sie die Patch-Clamp-Pipette über der Zelle nach der Wahl. Bringen Sie die Pipette nach unten, bis sie sanft die Zellmembran berührt. Bei diesem Schritt beobachten 1 M - 2 M & OHgr; Anstieg in Membranwiderstand auf der Patch-Clamp-Software ^25.
      HINWEIS: Gelegentlich eine gute GigaOhm Dichtung kann einfach erfolgen durch die Zellmembran zu berühren. Solange die Giga-Ohm-Dichtung ist stabil, sollte es in Ordnung sein.
   2. Stellen Sie eine Giga-Ohm-Siegel durch leichtes Unterdruck durch die Pipette Anwendung. Stellen Sie die Pipette Potenzial bei einer gewünschten Haltepotential.
   3. Unter Beibehaltung der Giga-Ohm-Dichtung, Bild the Zelle mit der Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera und in die Membranfläche konzentrieren.
   4. Bruch der Zellmembran durch Impulse von Sog durch den Mund Anwendung oder Spritze sanft eine ganze Zellenanordnung ²⁶ zu machen.
   5. Bild der Patch gespannt Zelle unter einer ganzen Zelle Klemme Konfiguration gemäß dem Versuchsaufbau durch eine Bildverarbeitungssoftware
      1. Starten Sie die Bildbearbeitungssoftware. Klicken Sie auf [abrufen] - [SciMeasure Kamera] Menü die "CCD ACQUIRE" Seite zu öffnen.
      2. Erstellen Sie eine neue Datendatei die Bilder zu speichern.
      3. Klicken Sie auf [ANALOG OUTPUT] und [Lesen Sie einen ASCII] einen Impuls Protokolldatei zu öffnen, um die Abbildung durch. Klicken Sie auf 'Durchschnitt der internen Wiederholungen ", wenn die Daten gemittelt werden muss. Schließen Sie dann die "ANALOG OUTPUT 'Seite.
         Anmerkung: Dieser Impuls Protokoll werden muss entwickelt und als ".txt" Datei je nach dem Zweck des jeweiligen Experiments vor diesem Schritt gespeichert.
      4. Legen Sie bestimmte Besitzstandition Parameter aus der "CCD ACQUIRE" Seite. Geben Sie die spezifischen Werte für "Anzahl der Bilder für den Erwerb" und "Anzahl der Versuche".
         Anmerkung: Die Anzahl der Bilder wird durch die Geschwindigkeit der Übernahme und der Zeitpunkt des Pulsprotokolls bestimmt. Zum Beispiel, wenn Bildgebung bei 1 kHz, 1,000 Frames gleich 1 sec Aufnahmezeit.
      5. Klicken Sie auf [TAKE DATA (Optik + BNC)], um die Aufnahme zu starten. Während die Spannung Bildgebung stattfindet, zu sehen aus dem Patch-Clamp-Software das Oszilloskop-Fenster stabile Ganzzell-Konfiguration in der gesamten Aufnahme zu gewährleisten.
         Hinweis: Um die GEVI des reaktionsSpannungsBereich zu testen, Signalgröße in AF / F-Wert oder zeitliche Auflösung im gesamten physiologischen Spannungsbereich, führen eine ganze Zelle Voltage-Clamp-Experiment mit einem Puls-Protokoll haben mV von -170 mV bis 130 reichende Spannungsimpulse verstärkt. Um festzustellen, evoziert die GEVI die Leistung bei der Lösung von Aktionspotentialen aus kultivierten primary Neuronen Bild der Zelle unter einer ganzen Zelle Stromzange Konfiguration.

4. Datenerfassung

1. Berechnung von AF / F
   1. Starten Sie die Bildbearbeitungssoftware. Klicken Sie auf [Datei] - [Read Data File] eine Datendatei zu öffnen, werden analysiert. Achten Sie auf die Zelle Bild in seiner Ruhelichtintensität (RLI) auf der rechten Seite
      Hinweis: Die Software mittelt die ersten 5 Bilder RLI der Aufnahme zu bestimmen.
   2. Klicken Sie 'BNCs', um die Strom- und Spannungswerte auf dem Bildschirm gemessen zu bringen.
   3. Ändern Sie den Page-Modus von "RLI Rahmen 'zu' Frame Subtraktion" den Rahmen Subtraktion Funktion nutzen zu können Pixel mit ansprechenden optischen Signale zu identifizieren. Das ist die wahre Macht der Bildgebung, da jeder Pixel kann für mögliche Veränderungen in der Fluoreszenz untersucht werden.
   4. Wählen Sie zwei Zeitpunkten (F _{0 und F 1)} für die Subtraktion. Identifizieren Sie, welche Fläche der Zelle istSignale, die auf Membranpotential Veränderung zeigt.
      Hinweis: Das SNR für die Rahmen Subtraktionsbilder durch Auswahl mehrerer Rahmen für jeden Zeitpunkt verbessert werden, um das Signal zeitlich mitteln. Die Software subtrahiert die durchschnittliche Lichtintensität von ausgewählten Rahmen genommen und berechnet die F ₁ -F ₀ Werte (AF). Normalerweise wählt man einen Zeitpunkt, an dem Haltepotential und ein anderer Zeitpunkt während der Stimulationsperiode genommen erworben.
   5. Bezeichnen die Pixel, die durch Ziehen oder durch Klicken auf jedes Pixel mit der Computermaus analysiert werden müssen. Beachten Sie die grafische Darstellung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität aus den ausgewählten Pixel auf der linken Seite des Software-Fensters. 4B und 5B zeigen repräsentative Bilder von dem Rahmen Subtraktion Analyse.
   6. Teilen Sie die abgezogen Pixel durch das RLI (F _{0) gewonnen.} Klicken Sie auf [Divide by RLIs] AF / F-Werte zu erwerben
2. Datenexport
   Berechnen AF / F-Werte für jede Spannung Schritt, um die Spannungsmesseigenschaften des GEVI analysieren. Verwenden Sie diese Werte Graphen wie AF / F zu ziehen gegen die Spannung für die anschließende Datenanalyse.
3. Entfernen Strom- und Spannungsdiagramme von unclicking 'Zeige BNCs' Menü. Zum [OUTPUT] - [Speichern Spuren wie angezeigt (ASCII)], um die Fluoreszenz Spur in eine ASCII-Datei-Format für Kurvenanpassung Analyse von Standard-Grafik-Software zu exportieren.

5. Datenanalyse

1. Spannungserfassungs Eigenschaft des GEVI
   1. Zeichnen Sie die Fluoreszenzänderung als Funktion der Spannung Graphen (FV) durch die AF / F-Werte gegenüber der Spannung in einem Datenanalyseprogramm plant. Den Kurve zu einer Boltzmann-Funktion (Tabelle 2) den Spannungsbereich des optischen Signals zu bestimmen, indem Sie auf [Analysis] - [Montage] - [Sigmoidale fit] - [Öffnen-Dialog], und wählen Sie dann Boltzmann-Funktion.
      Hinweis: Montage auf eine Funktion macht es possiblE die Spannungsmessung Eigenschaften unterschiedlicher Spannungssonden zu charakterisieren oder ihre Leistungen in verschiedenen Zellen zu vergleichen. Die Boltzmann-Funktion kann für die in diesem Papier getestet Sonden verwendet werden, weil die FV-Kurven aus dieser Sonden S-förmigen Muster zeigen.
   2. Normalisieren jedes AF / F-Wert durch die Anfangs- und Endwerte mit _{(A 1 und A 2)} durch die Funktion berechnet.
      Anmerkung: In der Boltzmann-Gleichung beträgt die minimale _{A 1} und das Maximum _{A 2.} Für Normalisierung, mit einem Tabellenkalkulationsprogramm Software, um die AF / F-Werte durch die Definition von _{A 1} als Null und _{A 2} als ein einzustellen. Der Mittelwert der normalisierten AF / F-Werte und Berechnung der Standardfehler für die statistische Analyse.
   3. Replot der normierten AF / F-Werte gegenüber der Spannung beschrieben, wie zuvor in Abschnitt 5.1.1).
2. Die Geschwindigkeit der optischen Antwort
   1. Öffnen Sie die ASCII-Datei erworben von Schritt 4.2.2) mit einer DatenanalyseProgramm und die AF / F Spur über der Zeit darzustellen.
   2. Klicken Sie auf "Datenwähler" in der Datenanalyse-Software und wählen Sie eine Zeitpunkt an den Anfang eines Stufenspannungsimpuls entspricht, und einem zweiten Zeitpunkt, wenn das optische Signal, das den Gleichgewichtszustand erreicht hat. Bringen Sie dieses Angebot sowohl mit einem Einzel- und Doppelfunktion exponentiellen Abfall, indem Sie auf [Analysis] - [Montage] - [exponentielle Anpassung] - [Öffnen-Dialog], und wählen Sie einen exponentiellen Abfall Funktion. Melden Sie das bessere Passform.
      Hinweis: Durch den einfachen oder doppelten exponentiellen Abfall Funktionen passend, die quantifizierten Zeitkonstanten von τ dargestellt werden, können erworben werden. Diese vergleicht helfen Experimentatoren die Kinetik ihrer Messungen mit unterschiedlichen Spannungsanzeiger erfolgen. Die Fluoreszenz Spuren könnte zeigen, schnellen und langsamen Komponenten, die mit einem doppelten exponentiellen Abfall Funktion beschrieben werden kann. In diesem Fall wird die Berechnung in zwei Zeitkonstanten mit unterschiedlichen Amplituden führen.
   3. berechnen thE gewichtete τ Konstanten, die Kinetik von Sonden aufweist zwei zeitliche Komponenten Sonden mit einem einzigen Bauteil zu vergleichen.
      Hinweis: Eine gewichtete tau als Summe aus τ ₁ berechnet wird, indem die relative Amplitude multipliziert, _{A 1,} und τ ₂ durch die relative Amplitude _{multipliziert, A 2,} wie durch die folgende Formel definiert sind;

Results

Transient transfizierten Zellen können signifikante Veränderung in der Fluoreszenzintensität zeigen und den Grad der Plasmamembranexpression. Auch auf dem gleichen Deckglas haben einige Zellen Ebenen der inneren Fluoreszenz variiert. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Menge an Transfektionsmittel von der Zelle absorbiert. Gelegentlich zuviel Ausdruck der Zelle bewirkt, dass die entfaltete Protein-Reaktion, was zu Apoptose ²⁷ zu erfahren (helle, runde Zellen mit hohen intern...

Discussion

Das Nervensystem verwendet Spannung auf mehrere verschiedene Arten, Hemmung verursacht eine leichte Hyperpolarisation, synaptischen Eingangs bewirkt eine leichte Depolarisation und ein Aktionspotential führt zu einer relativ großen Spannungsänderung. Die Fähigkeit von GeViS Änderungen des Membranpotentials zu messen bietet das vielversprechende Potential von gleichzeitig mehreren Komponenten neuronaler Schaltkreise analysieren. In diesem Bericht zeigen wir eine grundlegende Methode zur Bildgebung Änderungen des Membranp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverses Mikroskop	Olympus	IX71
60X Objektiv (numerische Apertur = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Anregungsfilter	Semrock	FF02-472/30	Für die Spannungsabbildung von Super-Ekliptik pHluorin im dichroitischen Spiegel von Bongwoori
	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emissionsfilter	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon-Bogenlampe	CAIRN	OptoSource Illuminator	LEDs und Laser sind ebenfalls effektive Lichtquellen
CCD-Kamera mit langsamer Geschwindigkeit	Hitachi	KP-D20BU
Dual-Port-Kameraadapter	Olympus	U-DPCAD
Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Bildsplitter	CAIRN	Optosplit 2
Anregungsfilter	Semrock	FF01-475/23-25	Für die Spannungsabbildung von FRET-Paar-basierten GEVI bestehend aus Clover und mRuby2)
Dichroitischer Spiegel	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emissionsfilter	Chroma	ET520/40
Dichroitischer Spiegel	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Emissionsfilter	Chroma	ET645/75
Schwingungsisolationssystem	Kinetic systems	250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching-Kammer	Warner Instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Mikro-Deckglas (22 x 40 mm)	Elektronenmikroskopie Sciences	72198-20
Temperaturregler	Warner Instruments	TC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - Glasdeckglas mit 10 mm Durchmesser	Ted Pella	260366
Lipofektionsmittel	Life Technologies	11668-027
Calciumphosphat-Reagenz	Clontech - Takara	631312
Patch-Clamp-Verstärker	HEKA	EPC 10 USB-Verstärker
Mehrkanal-Datenerfassungssoftware	HEKA	Patchmaster
Bilderfassungs- und -analysesoftware	RedShirtImaging	Neuroplex
Spreadsheet-Anwendungssoftware	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Datenanalyse-Software	OriginLab	OriginPro 8.6.0
Lupe	Qioptiq LINOS	Optem Standard Kamerakoppler 0,38x SC38 J Klemme
Konfokales Mikroskop	Nikon	Nikon A1R Konfokales Mikroskop
Anti-Fade-Reagenz	Life Technologies	P36930