Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Summary

Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Abstract

Genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVIs) haben sich bis zu dem Punkt verbessert, an dem sie beginnen, für In-vivo-Aufzeichnungen nützlich zu sein. Während das ultimative Ziel darin besteht, die neuronale Aktivität in vivo abzubilden, muss man in der Lage sein, die Aktivität einer einzelnen Zelle abzubilden, um eine erfolgreiche In-vivo-Vorbereitung zu gewährleisten. In diesem Verfahren wird beschrieben, wie das Membranpotenzial in einer einzelnen Zelle abgebildet werden kann, um eine Grundlage für die spätere Abbildung in vivo zu schaffen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren zur Bildgebung von GEVIs, die aus einer spannungsmessenden Domäne bestehen, die entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) oder zwei fluoreszierenden Proteinen fusioniert ist, die in vitro zum Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) fähig sind. Die Verwendung eines Bildsplitters ermöglicht die gleichzeitige Projektion von Bildern, die mit zwei verschiedenen Wellenlängen erzeugt wurden, auf dieselbe CCD-Kamera (Charge-Coupled Device). Der Bildsplitter positioniert einen zweiten Filterwürfel im Strahlengang. Dieser zweite Filterwürfel besteht aus einem dichroitischen und zwei Emissionsfiltern zur Trennung der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzwellenlängen in Abhängigkeit von den FPs des GEVI. Dieser Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung des Akzeptor- und des Donor-Fluoreszenzpartners, während das Membranpotential über die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration manipuliert wird. Bei Verwendung eines GEVI, das aus einem einzigen FP besteht, kann der zweite Filterwürfel entfernt werden, so dass die Spiegel im Bildsplitter ein einzelnes Bild auf die CCD-Kamera projizieren können.

Introduction

Der Schwerpunkt dieses Aufsatzes ist das optische Abbildungsveränderungsmembranpotentiale in vitro zu zeigen, unter Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen. Imaging Änderungen des Membranpotentials bietet die aufregende Möglichkeit, die Aktivität von neuronalen studieren. Wenn Änderungen des Membranpotentials führen zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität, wird jedes Pixel der Kamera ein Surrogat Elektrode eingriffsfreien Messung der neuronalen Aktivität ermöglicht. Seit über vierzig Jahren, organische spannungsabhängigen Farbstoffen wurden zur Beobachtung der Veränderungen des Membranpotentials ^4.1 nützlich. Jedoch fe....

Protocol

Ethik-Erklärung: Die Tierversuch Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee bei KIST Tier Protokoll 2014-001 genehmigt wurde.

1. Geräte-Setup

1. Imaging-Setup
   1. Zeigen eines invertierten Fluoreszenzmikroskop auf einer Vibrationsisolation Tisch. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung (60X Ölimmersionsobjektiv mit 1,35 numerischer Apertur) Objektivlinse und eine Filterwürfel mit einem dichroitischen Spiegel und Filter für die Fluoreszenzproteine ​​für die Spannung Bildgebung verwendet.
      Anmerkung: Dieser Aufbau verwendet einen inversen Mikroskop zu verwenden, um Ziele mit höherer NA, aber auch aufrec....

Results

Transient transfizierten Zellen können signifikante Veränderung in der Fluoreszenzintensität zeigen und den Grad der Plasmamembranexpression. Auch auf dem gleichen Deckglas haben einige Zellen Ebenen der inneren Fluoreszenz variiert. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Menge an Transfektionsmittel von der Zelle absorbiert. Gelegentlich zuviel Ausdruck der Zelle bewirkt, dass die entfaltete Protein-Reaktion, was zu Apoptose ²⁷ zu erfahren (helle, runde Zellen mit hohen intern.......

Discussion

Das Nervensystem verwendet Spannung auf mehrere verschiedene Arten, Hemmung verursacht eine leichte Hyperpolarisation, synaptischen Eingangs bewirkt eine leichte Depolarisation und ein Aktionspotential führt zu einer relativ großen Spannungsänderung. Die Fähigkeit von GeViS Änderungen des Membranpotentials zu messen bietet das vielversprechende Potential von gleichzeitig mehreren Komponenten neuronaler Schaltkreise analysieren. In diesem Bericht zeigen wir eine grundlegende Methode zur Bildgebung Änderungen des Membranp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverses Mikroskop	Olympus	IX71
60X Objektiv (numerische Apertur = 1,35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Anregungsfilter	Semrock	FF02-472/30	Für die Spannungsabbildung von Super-Ekliptik pHluorin im dichroitischen Spiegel von Bongwoori
	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emissionsfilter	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon-Bogenlampe	CAIRN	OptoSource Illuminator	LEDs und Laser sind ebenfalls effektive Lichtquellen
CCD-Kamera mit langsamer Geschwindigkeit	Hitachi	KP-D20BU
Dual-Port-Kameraadapter	Olympus	U-DPCAD
Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Bildsplitter	CAIRN	Optosplit 2
Anregungsfilter	Semrock	FF01-475/23-25	Für die Spannungsabbildung von FRET-Paar-basierten GEVI bestehend aus Clover und mRuby2)
Dichroitischer Spiegel	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emissionsfilter	Chroma	ET520/40
Dichroitischer Spiegel	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Emissionsfilter	Chroma	ET645/75
Schwingungsisolationssystem	Kinetic systems	250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching-Kammer	Warner Instruments	RC-26G, 64-0235
#0 Mikro-Deckglas (22 x 40 mm)	Elektronenmikroskopie Sciences	72198-20
Temperaturregler	Warner Instruments	TC-344B
#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - Glasdeckglas mit 10 mm Durchmesser	Ted Pella	260366
Lipofektionsmittel	Life Technologies	11668-027
Calciumphosphat-Reagenz	Clontech - Takara	631312
Patch-Clamp-Verstärker	HEKA	EPC 10 USB-Verstärker
Mehrkanal-Datenerfassungssoftware	HEKA	Patchmaster
Bilderfassungs- und -analysesoftware	RedShirtImaging	Neuroplex
Spreadsheet-Anwendungssoftware	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Datenanalyse-Software	OriginLab	OriginPro 8.6.0
Lupe	Qioptiq LINOS	Optem Standard Kamerakoppler 0,38x SC38 J Klemme
Konfokales Mikroskop	Nikon	Nikon A1R Konfokales Mikroskop
Anti-Fade-Reagenz	Life Technologies	P36930