Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung

Matthias Suhr; Johannes Raff; Katrin Pollmann

doi:10.3791/53572

Methodenartikel

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung

DOI:

10.3791/53572

⸱

19. Januar 2016

Matthias Suhr¹ , Johannes Raff¹^,² , Katrin Pollmann¹

¹Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, ²Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Um grundlegende Informationen über die Sorption und das Recycling von Gold aus wässrigen Systemen zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von Au(III)- und Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schicht-Proteinen untersucht. Die Sorption von Proteinpolymeren wurde mittels ICP-MS und die von proteinhaltigen Monolayern mit QCM-D untersucht. Ein anschließendes AFM ermöglicht die Abbildung der Nanostrukturen.

Zusammenfassung

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In dieser Veröffentlichung wird das Goldsorptionsverhalten von Oberflächenschichtproteinen (Slp1) von Lysinibacillus sphaericus JG-B53 beschrieben. Diese Biomoleküle ordnen sich in parakristallinen zweidimensionalen Anordnungen auf Oberflächen an, binden Metalle und sind somit für verschiedene biotechnische Anwendungen interessant, wie z.B. biosorptive Materialien zur Entfernung oder Rückgewinnung verschiedener Elemente aus der Umwelt und industrielle Prozesse. Die Abscheidung von Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schichten, entweder durch S-Schicht-gerichtete Synthese ¹ oder Adsorption von Nanopartikeln, eröffnet neue Möglichkeiten für vielfältige sensorische Anwendungen. Obwohl zahlreiche Studien die biosorptiven Eigenschaften der ^{S-Schichten 2-5} beschrieben haben, bleibt ein tieferes Verständnis der Protein-Protein- und Protein-Metall-Wechselwirkung immer noch eine Herausforderung. In der folgenden Studie wurde die induktiv gekoppelte Massenspektrometrie (ICP-MS) zur Detektion der Metallsorption durch suspendierte S-Schichten eingesetzt. Dies wurde mit Messungen der Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) korreliert, die den Online-Nachweis der Bildung und Metallabscheidung von proteinhaltigen Monolagen und damit ein detaillierteres Verständnis der Metallbindung ermöglicht.

Die ICP-MS-Ergebnisse zeigten, dass die Bindung von Au(III) an die suspendierten S-Schicht-Polymere pH-abhängig ist. Die maximale Bindung von Au(III) wurde bei pH 4,0 erreicht. Die QCM-D-Untersuchungen ermöglichten den Nachweis der Au(III)-Sorption sowie die Abscheidung von Au(0)-NPs in Echtzeit während der in situ Experimente. Darüber hinaus konnte mit dieser Methode der Einfluss der Metallbindung auf die Proteingitterstabilität von Slp1 untersucht werden. Die strukturellen Eigenschaften und die Stabilität der Proteinschicht konnten direkt nach dem QCM-D-Experiment mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) sichtbar gemacht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination dieser verschiedenen Methoden ein tieferes Verständnis der Metallbindung durch bakterielle S-Schicht-Proteine in Suspension oder als Monoschichten auf Bakterienzellen oder rekristallisierten Oberflächen ermöglicht.

Einleitung

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Aufgrund der zunehmenden Verwendung von Gold für verschiedene Anwendungen wie Elektronik, Katalysatoren, Biosensoren oder medizinische Instrumente hat sich die Nachfrage des Edelmetalls in den letzten Jahren ^6-9 gewachsen. Gold sowie viele andere wertvolle und Schwermetalle in die Umwelt über industrielle Abwässer in verdünnten Konzentrationen durch Bergbauaktivitäten freigesetzt, und Entsorgungs ^7,8,10, obwohl die meisten Umweltkontamination durch schwere oder Edelmetalle ist ein fortlaufender Prozess vor allem durch technologische Aktivitäten verursacht. Dies führt zu einer erheblichen Störung der natürlichen Ökosysteme und könnte möglicherwei....

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Protokoll

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1. Mikroorganismus und Anzuchtbedingungen

Anmerkung:. Alle Experimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt L. sphaericus JG-B53 wurde von einem kryokonserviert Kultur ^29,30 erhalten.

Transfer kryokonserviert Kultur (1,5 ml) unter der Sterilbank auf 300 ml sterile Nährbrühe (NB) Medien (3 g / l Fleischextrakt, 5 g / l Pepton, 10 g / l NaCl). Danach rühren Sie die Lösung für mindestens 6 h bei 30 ° C, um die Vorkultur für den Anbau zu erhalten.
Kultivieren der Bakterien unter aeroben Bedingungen in NB Medien bei pH 7,0, 30 ° C in einem 70 L skaliert Dampf-in-place-Bioreaktor. Deshalb füllen ....

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Ergebnisse

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Kultivierung von Mikroorganismen und SLP1 Charakterisierung

Die aufgezeichneten Daten des Bakterienwachstums zeigt das Ende der exponentiellen Wachstumsphase bei etwa 5 Stunden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass SLP1 können von diesem Zeitpunkt der Ernte (4,36 g / L nasser Biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) mit einer maximalen Ausbeute ¹⁹ isoliert werden. Dennoch Optimierung der Kultivierung mit.......

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Diskussion

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In dieser Arbeit untersuchten die Bindung von Au auf S-Layer-Proteine wurde unter Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Methoden untersucht. Insbesondere die Bindung von Au ist sehr attraktiv, nicht nur für die Wiedergewinnung von Au aus dem Bergbau, Wasser oder Prozesslösungen, sondern auch für die Konstruktion von Materialien, zB sensorischen Oberflächen. Für Studien der Wechselwirkung Au (Au (III) und Au (0) -NPs) mit suspendierten und umkristallisiert Monoschicht von SLP1, das Protei.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die vorliegende Arbeit wurde teilweise durch die IGF-Projekt "S-Sieve" (490 ZBG / 1) durch das BMWi und des BMBF-Projektes "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A) finanziert finanziert. Besonderen Dank an Tobias J. Günther für seine wertvolle Hilfe bei der AFM-Studien und um Erik V. Johnstone zum Lesen des Manuskripts als englischer Muttersprachler. Ferner würde der Autor dieses Papieres gerne Aline Ritter und Sabrina Gurlit (vom Institut für Ressourcenökologie zur Unterstützung bei der ICP-MS-Messungen) zu danken, Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava und die Gruppe Biotechnologie des Helmholtz-Institut Freiberg für Ressourcentechnologie.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Equipment und Software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilotanlage	Applikon Biotechnology, Niederlande	Z6X	Inklusive dO₂, pH-Sensoren von Applikon Biotechnology und BioXpert Software V2
Nichtinvasiver Biomassemonitor BugEye 2100	BugLab, Concord (CA), USA	Z9X	---
Spektrometer Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, Großbritannien	80-2109-10	Unternehmen jetzt GE Healthcare Life Sciences
MiniStar Mikrozentrifuge	VWR, Deutschland	521-2844	Zur Zentrifugation von Kultivierungsproben
Forschungssystemmikroskop BX-61	Olympus Germany LLC, Deutschland	037006	Mikroskop in Kombination mit der Bildgebungssoftware
Cell^P (Version 3.1)	Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Deutschland	---	zusammen mit Mikroskop
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S	Carr Centritech, Florida, USA	9010PLT	Für die Biomasseernte
T18 basic Ultra Turrax	IKA Labortechnik, Deutschland	431-2601	Für die Geißelentfernung und Probenhomogenisierung
Sorvall Evolution RC Superspeed Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	728411	Wird bei der Proteinisolierung
verwendet Mobiler High-Shear-Fluid-Prozessor, M-110EH-30 Pilot	Microfluidics, Massachusetts, USA	M110EH30K	Wird für die Zellruptur
verwendet Alpha 1-4 LSC Gefriertrockner	Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Deutschland	102041	---
UV-VIS Spektrophotometrie (NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, USA	91-ND-2000C-L	Zur Bestimmung von Proteinen Konzentration
Mini-PROTEAN vertikale Elektrophoresekammer	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland	165-3322	Für SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland	1708030	Zur Bildgebung von SDS-PAGE-Gelen
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), USA	N8120536	Zur Bestimmung der Metallkonzentration
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich	ZEN3600	Zur Bestimmung der Nanopartikelgröße
Q-Sense E4 Gerät	Q-Sense AB, Göteborg, Schweden	QS-E4	bestellt über LOT quantum design (Software im Lieferumfang der E4-Plattform enthalten)
Q-Soft 401 (Datenaufzeichnung)	Q-Sense AB, Göteborg, Schweden
Q-Tools 3 (Datenauswertung und -modellierung)	Q-Sense AB, Göteborg, Schweden
QCM-D Strömungsmodule QFM 401	Q-Sense AB, Göteborg, Schweden	QS-QFM401	bestellt über LOT quantum design
QSX 303 SiO₂ piezoelektrische AT-Cut Quarzsensoren	Q-Sense AB, Göteborg, Schweden	QS-QSX303	bestellt über LOT quantum design
Ozonreinigungskammer	Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA	QS-ESA006	bestellt über LOT quantum
design Rasterkraftmikroskop MFP-3D Bio AFM	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	MFP-3DBio	AFM Mess- und Bildgebungssoftware
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA		Imaging-Software in Cat. Nein. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software	WaveMetrics, Inc., USA		Imaging Software in Cat. Nein. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	Bioheater	Probenheizer für AFM-Messungen
Biolever mini Cantilever, BL-AC40TS-C2	Olympus Germany LLC, Deutschland	BL-AC40TS-C2	Bevorzugter Ausleger für AFM-Messungen
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L. , Spanien	Freeware-Software	für die AFM-Analyse
Name<	strong>Company	Katalognummer	>
Reinigungsmittel und andere Geräte
saure Säure, 100 %, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3738.5	Gefährliche, entzündbare und ätzende Flüssigkeiten und Dämpfe. Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden.
Antischaum 204	Sigma-Aldrich Co., LLC.	A6426	Zur Schaumunterdrückung
Bromphenolblau, Natriumsalz	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525	---
Coomassie Brilliant Blue R (C₄₅H₄₄N₃NaO₇S₂)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3862.1	---
Desoxyribonuklease II aus Schweinemilz	Sigma-Aldrich Co., LLC.	D4138	Typ IV , 2.000 - 6.000 Kunitz Einheiten/mg
Protein Ethanol, 95%	VWR, Deutschland	20827.467	Gefahr, brennbares
Glycerin, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3783.1	---
Guanidinhydrochlorid (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
Salzsäure (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	4625.2	Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Einstellung
Lysozym aus Hühnereiweiß	Sigma-Aldrich Co. LLC verwendet.	Nr. L6876	Lyophilisiertes Pulver, Protein = 90 %, = 40.000 Einheiten/mg Protein (Sigma)
Magnetrührer mit Heizung MR 3000K	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Deutschland	504.10100.00	Standardrührer im Experiment
NB-Media DM180	Mast Diagnostica GmbH	121800---
Salpetersäure (HNO₃)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN50.1	Gefahr; oxidierende, korrosierende
PageRuler Ungefärbte Proteinleiter	ThermoScientific-Pierce	26614---
Poly(sodium 4-styrolesulfonat) (PSS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	243051	durchschnittlichen Mw ~70.000
Polyethylenimin (PEI), verzweigte	Sigma-Aldrich Co. LLC.	408727	Warnung; Schädlich, reizend, gefährlich für die Umwelt; durchschnittlich Mw ~25.000
Kaliumcarbonat wasserfrei (K₂CO₃)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	60108	Warnung; Schädliche
Ribonuklease A aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R5503	Typ I-AS, 50 - 100 Kunitz Einheiten/mg Protein
Natriumazid (NaN₃)	Merck KGaA	106688	Gefahr; sehr giftig und umweltgefährlich
Natriumchlorid (NaCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3957.2	---
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	L-5750	Gefahr; giftiges
Natriumhydroxid (NaOH)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	6771.1	Gefahr; Korrosiv, zur pH-Regulierung in der Kultivierung und zur pH-Einstellung
Spectra/Por 6, Dialysemembran, MWCO 50.000	CARL ROTH GmbH+CO. KG	1893.1	---
Schwefelsäure (H₂SO₄)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	HN52.2	Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Regulierung in der Kultivierung
Tanninsäure (C₇₆H₅₂O₄₆)	Sigma-Aldrich Co. LLC verwendet.	16201	---
TRIS HCl (C₄H₁₁NO₃HCl)	CARL ROTH GmbH+CO. KG	9090.2	---
Triton X-100	CARL ROTH GmbH+CO. KG	3051.3	Warnhinweis; Schädlich, gefährlich für die Umwelt
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Ultrafiltrationsrohre	Sartorius AG	VS0132---
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M6250	Gefahr, giftig

------ von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W.

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S Layer Proteine Goldsorption QCM D Analyse ICP MS Detektion AFM Bildgebung Slp1 Monoschicht Metallbindung Proteinrekristallisation Nanopartikeladsorption

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