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Methodenartikel

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus

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DOI:

10.3791/53572

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19. Januar 2016

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1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um grundlegende Informationen über die Sorption und das Recycling von Gold aus wässrigen Systemen zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von Au(III)- und Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schicht-Proteinen untersucht. Die Sorption von Proteinpolymeren wurde mittels ICP-MS und die von proteinhaltigen Monolayern mit QCM-D untersucht. Ein anschließendes AFM ermöglicht die Abbildung der Nanostrukturen.

Zusammenfassung

In dieser Veröffentlichung wird das Goldsorptionsverhalten von Oberflächenschichtproteinen (Slp1) von Lysinibacillus sphaericus JG-B53 beschrieben. Diese Biomoleküle ordnen sich in parakristallinen zweidimensionalen Anordnungen auf Oberflächen an, binden Metalle und sind somit für verschiedene biotechnische Anwendungen interessant, wie z.B. biosorptive Materialien zur Entfernung oder Rückgewinnung verschiedener Elemente aus der Umwelt und industrielle Prozesse. Die Abscheidung von Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schichten, entweder durch S-Schicht-gerichtete Synthese 1 oder Adsorption von Nanopartikeln, eröffnet neue Möglichkeiten für vielfältige sensorische Anwendungen. Obwohl zahlreiche Studien die biosorptiven Eigenschaften der S-Schichten 2-5 beschrieben haben, bleibt ein tieferes Verständnis der Protein-Protein- und Protein-Metall-Wechselwirkung immer noch eine Herausforderung. In der folgenden Studie wurde die induktiv gekoppelte Massenspektrometrie (ICP-MS) zur Detektion der Metallsorption durch suspendierte S-Schichten eingesetzt. Dies wurde mit Messungen der Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) korreliert, die den Online-Nachweis der Bildung und Metallabscheidung von proteinhaltigen Monolagen und damit ein detaillierteres Verständnis der Metallbindung ermöglicht.

Die ICP-MS-Ergebnisse zeigten, dass die Bindung von Au(III) an die suspendierten S-Schicht-Polymere pH-abhängig ist. Die maximale Bindung von Au(III) wurde bei pH 4,0 erreicht. Die QCM-D-Untersuchungen ermöglichten den Nachweis der Au(III)-Sorption sowie die Abscheidung von Au(0)-NPs in Echtzeit während der in situ Experimente. Darüber hinaus konnte mit dieser Methode der Einfluss der Metallbindung auf die Proteingitterstabilität von Slp1 untersucht werden. Die strukturellen Eigenschaften und die Stabilität der Proteinschicht konnten direkt nach dem QCM-D-Experiment mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) sichtbar gemacht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination dieser verschiedenen Methoden ein tieferes Verständnis der Metallbindung durch bakterielle S-Schicht-Proteine in Suspension oder als Monoschichten auf Bakterienzellen oder rekristallisierten Oberflächen ermöglicht.

Einleitung

Aufgrund der zunehmenden Verwendung von Gold für verschiedene Anwendungen wie Elektronik, Katalysatoren, Biosensoren oder medizinische Instrumente hat sich die Nachfrage des Edelmetalls in den letzten Jahren 6-9 gewachsen. Gold sowie viele andere wertvolle und Schwermetalle in die Umwelt über industrielle Abwässer in verdünnten Konzentrationen durch Bergbauaktivitäten freigesetzt, und Entsorgungs 7,8,10, obwohl die meisten Umweltkontamination durch schwere oder Edelmetalle ist ein fortlaufender Prozess vor allem durch technologische Aktivitäten verursacht. Dies führt zu einer erheblichen Störung der natürlichen Ökosysteme und könnte möglicherweise die menschliche Gesundheit gefährden 9. Die Kenntnis dieser negativen Ergebnisse fördert die Suche nach neuen Techniken, um Metalle aus kontaminierten Ökosystemen und Verbesserungen beim Recycling von Metallen aus industriellen Abwässern zu entfernen. Etablierte physikalisch-chemische Methoden wie Fällung oder Ionenaustausch sind nicht so effektiv, vor allem in der Hochly verdünnten Lösungen 7,8,11. Biosorption entweder mit lebenden oder toten Biomasse, ist eine attraktive Alternative für die Abwasserbehandlung 10,12. Die Verwendung solcher biologischer Materialien kann der Verbrauch von toxischen Chemikalien zu verringern. Viele Mikroorganismen beschrieben worden zu sammeln oder zu immobilisieren Metallen. Zum Beispiel Zellen der Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 haben hohe Bindungskapazitäten für Edelmetalle, dargestellt beispielsweise Pd (II), Pt (II), Au (III) und anderen toxischen Metallen wie Pb (II) oder U (VI) 4,13, Zellen des Bacillus megaterium für Cr (VI) 14, Zellen von Saccharomyces cerevisiae für Pt (II) und Pd (II) 15 und Chlorella vulgäre zur Au (III) und U (VI) 16 , 17. Die Bindung von Metallen wie Au vorherigen (III), Pd (II) und Pt (II) wurde auch für Desulfovibrio desulfuricans 18 gemeldet und L. sphaericus JG-B53 19,20. Dennoch sind nicht all Mikroben binden große Mengen von Metallen und deren Anwendung als Sorptionsmaterial begrenzt 12,21. Weiterhin Metallbindungskapazität hängt von verschiedenen Parametern, beispielsweise Zell-Zusammensetzung, die verwendet Biokomponente oder Umwelt- und experimentellen Bedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur etc.). Das Studium der isolierten Zellwandfragmente 22,23, wie Membranlipiden, Peptidoglycan, Proteinen oder anderen Komponenten kann dabei die Metallbindungsverfahren komplexer aufgebaut ganzen Zellen 8,21 zu verstehen.

Die Zellbestandteile in dieser Studie konzentrierte sich auf sind S-Layer-Proteine. S-Layer-Proteine ​​sind Teile der äußeren Zellhülle von vielen Bakterien und Archaebakterien, und sie machen etwa 15 bis 20% der Gesamtproteinmasse dieser Organismen. Wie die erste Schnittstelle für die Umwelt, diese Zell Verbindungen beeinflussen die Bakterien Sorptionseigenschaften 3. S-Schicht-Proteine ​​mit Molekulargewichten im Bereich von vierzigHunderte von kDa sind innerhalb der Zelle produziert, aber außerhalb montiert, wo sie in der Lage, Schichten auf den Lipidmembranen oder polymere Zellwandbestandteile bilden. Nach der Isolierung fast alle S-Layer-Proteine ​​die intrinsische Eigenschaft, sich spontan durch Selbstorganisation in Suspension, an Grenzflächen oder auf Oberflächen bilden ebene oder röhrenförmige Gebilde 3. Die Dicke der Proteinmonoschicht hängt von den Bakterien und ist in einem Bereich von 5 bis 25 nm 24. Im Allgemeinen können die gebildeten S-Layer-Protein-Strukturen eine schräge (P1 oder P2), quadratisch (p4) oder hexagonal (p3 oder P6) symmetrisch Gitterkonstanten von 2,5 bis 35 nm 3,24 haben. Die Gitterbildung scheint in vielen Fällen abhängig von zweiwertigen Kationen und hauptsächlich Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Dennoch ist die vollständige Reaktionskaskade des Monomers Faltung Monomer-Monomer-Wechselwirkung, die Bildung eines Gitters, und die Rolle, die aus unterschiedlichen Metallen, insbesondere zweiwertigen Kationen, wie Ca 2+ und Mg 2+, noch nicht vollständig verstanden.

Die Gram-positive Stamm L. sphaericus JG-B53 27 (von Bacillus sphaericus, nachdem neue phylogenetische Einordnung umbenannt) wurde aus dem Uranbergbau Halde "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sachsen, Deutschland) 4,28,29 isoliert. Seine Funktions S-Layer-Protein (SLP1) einen quadratischen Gitter, ein Molekulargewicht von 116 kDa 30 und eine Dicke von ≈ 10 nm an lebenden Bakterienzellen 31. In früheren Studien wurde die in vitro Bildung einer geschlossenen und stabilen Proteinschicht mit einer Dicke von etwa 10 nm in weniger als 10 min 19 erreicht. Die verwandten Stammes L. sphaericus JG- angezeigtA12, auch ein Isolat aus dem "Haberland" Haufen, besitzt eine hohe Metallbindungskapazitäten und seiner isolierten S-Schicht-Protein hat eine hohe chemische und mechanische Stabilität und gute Sorptionsraten für Edelmetalle wie Au (III) gezeigt, Pt (II), und Pd (II) 4,32,33. Diese Bindung von Edelmetallen ist mehr oder weniger spezifisch für bestimmte Metalle und hängt von der Verfügbarkeit der funktionellen Gruppen auf der äußeren und inneren Proteinoberfläche des Polymers und die in ihren Poren, der Ionenstärke und dem pH-Wert. Relevante funktionelle Gruppen für die Metall-Wechselwirkung durch die Proteine ​​sind COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - und SO. Grundsätzlich Metallbindungskapazitäten eröffnen ein breites Spektrum von Anwendungen, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). zB als biosorptive Komponenten zur Entfernung oder Wiederherstellungvon gelösten toxischen oder wertvolle Metalle, Vorlagen für die Synthese oder definierte Abscheidung von regelmäßig strukturierten metallischen Nanopartikeln (NPs) für die Katalyse und andere Bio-engineered Materialien wie Bio-sensorischen Schichten 3,5,18,33. Regelmäßig angeordnet NP Arrays wie Au (0) -NPs könnte für große Anwendungen, die von der molekularen Elektronik und Biosensoren, Ultrahochdichte-Speichergeräte, und Katalysatoren für die CO-Oxidation 34-37 verwendet werden. Die Entwicklung solcher Anwendungen und intelligente Design dieser Materialien erfordert ein tieferes Verständnis der zugrundeliegenden Metallbindungsmechanismen.

Eine Voraussetzung für die Entwicklung solcher Materialien auf biologischer Basis ist die zuverlässige Ausführung eines Schnittstellenschicht zwischen dem Biomolekül und der technische Oberfläche 38,39. Zum Beispiel Polyelektrolyte mit der Schicht-für-Schicht (LBL) Technik 40,41 zusammengebaut wurden als Zwischenschicht zur Rekristallisation von S-Layer-Proteine ​​39 verwendet wurden . Eine solche Schnittstelle bietet eine relativ einfache Möglichkeit, die Proteinbeschichtung auf eine reproduzierbare und quantitative Weise auszuführen. Durch Durchführung verschiedener Experimente mit und ohne Modifikation mit Klebevermittler, ist es möglich, Aussagen über die Beschichtungs Kinetik, Schichtstabilität und die Interaktion von Metallen mit Biomolekülen 19,42, Raff, J. et al machen. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Jedoch ist die komplexen Mechanismen der Proteinadsorption und Protein-Oberflächen-Wechselwirkung nicht vollständig verstanden. Vor allem Informationen über Konformation, Muster Orientierung und Beschichtungsdichten fehlt noch.

Quarzmikrowaage mit Verlustüberwachung (QCM-D) Technik hat sich die Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als ein Werkzeug für die Untersuchung der Proteinadsorption, Beschichtungs Kinetik und Interaktion pro zogenProzesse auf der Nanometerskala 19,43-45. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Erfassung der Masse Adsorption in Echtzeit und kann als Indikator für das Protein selbst Montage und die Kopplung der funktionellen Moleküle auf Proteingitter 19,20,42,46-48 verwendet werden. Darüber hinaus öffnen QCM-D-Messungen die Möglichkeit, Metallwechselwirkungsprozesse mit der proteinhaltigen Schicht unter natürlichen biologischen Bedingungen zu studieren. In einer neueren Studie der Wechselwirkung des S-Layer-Protein mit ausgewählten Metallen wie Eu (III), Au (III), Pd (II) und Pt (II) wurde mit der QCM-D 19,20 sucht. Die adsorbierte Proteinschicht kann als vereinfachtes Modell eines Zellwand von gram-positiven Bakterien dienen. Die Untersuchung dieses einzelne Komponente kann zu einem tieferen Verständnis der Metall-Wechselwirkung beitragen. Allerdings wissen nur QCM-D-Experimente nicht Aussagen in Bezug auf Oberflächenstrukturen und Einflüsse von Metallen, um Protein zu ermöglichen. Andere Techniken sind notwendig, um diese Informationen zu erhalten. Eine postung für Abbildungs ​​bio-Nanostrukturen und Gewinnung von Informationen über Struktureigenschaften ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM).

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sorption von Gold (Au (III) und Au (0) -NPs) bis S-Layer-Proteine ​​zu untersuchen, insbesondere SLP1 von L. sphaericus JG-B53. 5.0 Verwendung von ICP-MS und immobilisiert S-Schichten unter Verwendung von QCM-D - Experimente wurden mit suspendierten Proteine ​​auf Ansatzgröße in einem pH-Bereich von 2,0 durchgeführt. Zusätzlich wurde der Einfluß der Metallsalzlösung auf dem Gitter Stabilität mit anschließender AFM-Studien untersucht. Die Kombination dieser Techniken trägt zu einem besseren Verständnis der in-vitro-Metall-Interaktionsprozesse als Werkzeug für das Lernen mehr über Bindungsereignisse auf ganze Bakterienzellen in Bezug auf bestimmte Metall Affinitäten. Diese Erkenntnis ist nicht nur wichtig für die Entwicklung von anwendbaren Filtermaterialien zur Rückgewinnung von Metallen für den Umweltschutz und zur Erhaltung der WiederQuellen 49, sondern auch für die Entwicklung von hoch geordneten Arrays von metallischen Nanopartikeln für verschiedene technische Anwendungen.

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Protokoll

1. Mikroorganismus und Anzuchtbedingungen

Anmerkung:. Alle Experimente wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt L. sphaericus JG-B53 wurde von einem kryokonserviert Kultur 29,30 erhalten.

  1. Transfer kryokonserviert Kultur (1,5 ml) unter der Sterilbank auf 300 ml sterile Nährbrühe (NB) Medien (3 g / l Fleischextrakt, 5 g / l Pepton, 10 g / l NaCl). Danach rühren Sie die Lösung für mindestens 6 h bei 30 ° C, um die Vorkultur für den Anbau zu erhalten.
  2. Kultivieren der Bakterien unter aeroben Bedingungen in NB Medien bei pH 7,0, 30 ° C in einem 70 L skaliert Dampf-in-place-Bioreaktor. Deshalb füllen den Reaktor mit ≈ 57 L VE-Wasser. Hinzufügen und lösen feste NB Medien direkt im Bioreaktor (Konzentrationen siehe oben).
    1. Zusätzlich fügen Antischaummittel (30 & mgr; l / L NB-Medium) an die Medien, um während der Kultivierung die Schaumbildung zu unterdrücken, dann Autoklaven (122 ° C, Temperaturhaltezeit 30 min) die Medienim Inneren des Reaktoranlage.
  3. Kühlen Sie sich die Medien und führen komplette Sauerstoffsättigung. Den pH-Wert auf 7,0 (mit 1 MH 2 SO 4 und 2 M NaOH) und starten Sie die automatische Impfung des 300 ml Vorkultur. Starten Sie die Datenaufzeichnung der Kultivierungsparameter an der Impfstelle. Melden Sie sich Online-Parameter zB gelöstem Sauerstoff (DO 2), Säure- und Basenadditions und pH-Werte im Anbau.
    1. Überwachung des Bakterienwachstums Online durch die nicht-invasive Trübungsmessungen.
  4. Führen Sie zusätzliche Probenahme nach jeder Stunde des Anbaus und der Bestimmung weiterer Parameter wie Bio Trockengewicht (BDW) und Offline-optische Dichte (OD). Daher sammeln 20 ml Kultivierungsbrühe an jedem Probenpunkt unter sterilen Bedingungen.
    1. Bestimmen Sie offline OD durch photometrische Messung der Absorption bei 600 nm. Verwenden Sie sterile filtrierte NB-Medium als Leerwert. Achterner erreichte Adsorption> 0,4 ​​verdünnten Zellsuspension nach der Linearität des Lambert-Beer'schen Gesetz.
    2. Zur Bestimmung BDW Zentrifuge 1 bis 5 ml Bakteriensuspension (abhängig von der Zelldichte) bei 5000 × g für 5 min bei RT. Trocknen des erhaltenen Zellpellets bei 105 ° C in einem Heizofen bis Massenstabilität und messen die Pelletmasse.
  5. Nehmen mikroskopische Bilder mit optischen Phasenkontrastforschungsmikroskop in 400 und 1000 facher Vergrößerung (Phasenkontrast Kondensator 2 und 3) zur Überprüfung des bakteriellen Wachstums und als Kreuzkontaminationskontrolle.
  6. Nach dem Erreichen der nach online erfasst exponentiellen Wachstumsphase DO 2 und Online-Trübung, Ernte der Biomasse von Flow-Through-Zentrifugation bei 15.000 × g, 4 ° C und zweimal waschen der Biomasse mit Standard-Puffer (50 mM Tris, 10 mM MgCl 2, 3 mM NaN 3, pH = 7,5).
    Hinweis: Die gewonnene Biomasse Pellet bei -18 & # gespeichert werden176; C bis zur weiteren Verwendung zur Isolierung.

2. S-Layer-Protein Isolierung und Reinigung

Hinweis: Reinigen SLP1 Polymere gemäß einem angepassten Verfahren wie zuvor 2,19,30,32,50,51 beschrieben.

  1. Homogenisieren gewaschen und aufgetauten rohen Biomasse aus dem Anbau in Standardpuffer erhalten (1: 1 (w / v)), um Geißeln mit Hilfe eines Dispergators (Ebene 3, 10 min) unter Eisbadkühlung bei 4 ° C zu entfernen.
  2. Zentrifugieren Sie die Suspension (8.000 × g, 4 ° C für 20 min) und zweimal waschen das erhaltene Pellet mit Standard-Puffer (1: 1 (w / v)). Nach Waschen und Zentrifugation (8000 x g, 4 ° C für 20 min), das Pellet in Standardpuffer (1: 1 (w / v)), fügen DNase II und RNase (0,4 Einheiten / g Biomasse) zu der Suspension und zerfallen die Zellen bei 1000 bar mit einem Hochdruckhomogenisator. Danach zentrifugieren der Suspension bei 27.500 x g, 4 ° C für 1 Stunde.
    Hinweis: Steuerzellsuspension mit den Forschungs mikop. Bruch ist abgeschlossen, wenn weniger als 2-3 intakte Zellen in das Gesichtsfeld des Mikroskops in 400-facher Vergrößerung sichtbar sind.
  3. Zweimal Waschen des Pellets mit Standard-Puffer (1: 1 (w / v)) und führen Sie die Zentrifugation erneut. Anschließend das Pellet in Standardpuffer (2: 1 (w / v)) mit 1% Triton X-100 gemischt und inkubiert für 20 Minuten unter aufeinander Schütteln (100 UpM), um Lipidablagerungen solubilisieren.
  4. Zentrifuge die Lösung (27.500 × g, 4 ° C für 1 h), und die erhaltenen Pellets dreimal Waschen mit Standardpuffer (1: 1 (w / v)).
  5. Inkubieren nach zusätzlicher Zentrifugation (27.500 × g, 4 ° C für 1 h) 6 h lang in Standardpuffer erhaltene Pellet (1: 1 (w / v)) mit 0,2 g / l Lysozym, gemischt werden, um Bindungen in Peptidoglycan 50 hydrolysieren. Zusätzlich zu der Suspension hinzu DNase II und RNase (jeweils 0,4 Einheiten / g Biomasse).
  6. Nach Zentrifugation (45.500 × g, 4 ° C, 1 h), resuspendieren obere weiße Proteinphase mit einem geringen Volumen von ter Zentrifugationsüberstand (<30 ml), die Protein-Untereinheiten.
  7. Solubilisierung des weißen Suspension durch Mischen von 1: 1 mit 6 M Guanidinhydrochlorid (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Die Lösung wird hell.
  8. Zuführen Sterilfiltration (0,2 um) des GuHCl behandelte Lösung gefolgt von einer zusätzlichen Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (45.500 × g, 4 ° C für 1 h).
  9. Den Überstand in einen Dialysemembranrohre (MWCO 50.000 Dalton) dialysiert gegen Rekristallisation Puffer (1,5 mM Tris, 10 mM CaCl 2, pH = 8,0) für 48 Stunden.
  10. Übertragen Sie die weißen rekristallisierte Proteinpolymerlösung in Rohren und Zentrifuge bei 45.500 × g, 4 ° C für 1 Stunde. Das Pellet in einem geringen Volumen von ultrareinem Wasser (<30 ml).
  11. Anschließend übertragen Sie die Suspension in Dialysemembran Röhren und führen Sie eine Dialyse gegen Reinstwasser für 24 Stunden, um Pufferinhalt zu entfernen.
    Hinweis: Mehrere Pufferwechsel oder Reinstwasser dährend der Dialyse sind unverzichtbar.
  12. Lyophilisieren die gereinigt SLP1 in einem Gefriertrockner.

3. Charakterisierung und Quantifizierung von SLP1 für Experimente

Anmerkung: SLP1 Konzentration zur Sorption und Beschichtungsexperimente wurden durch UV-VIS-Spektrophotometrie quantifiziert.

  1. Pipette 2 ul SLP1 Probe direkt auf die untere Mess Sockel des Photometers. Bestimmen Proteinkonzentration bei Adsorptionsbedingungen Maximum bei einer Wellenlänge von 280 nm, die charakteristisch für Proteine. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten von 0,61 bis SLP1 Konzentration zu bestimmen. Verwenden SLP1 kostenlose Lösung für Referenzmessungen.
  2. Verdünnen des Proteins mit dem Puffer (für Sorptionsexperimenten im Batch-Modus zu verwenden 0,9% NaCl, pH = 6,0 und für die QCM-D Experimenten Umkristallisation Puffer, pH = 8,0) bis zur gewünschten Konzentration für die Experimente (1 g / L und 0,2 g / L beziehungsweise).
  3. Analysieren SLP1 Qualität und Molekulargewicht durch die Standard bioanalytical Verfahren Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli, UK 52 beschrieben.
    1. Führen SDS-PAGE, bevor Sie SLP1 in Experimenten und zB nach Au (0) -NP Inkubation mit 10% Polyacrylamid Trenn Gele.
    2. Für SDS-Proben-Mix ≈10 ul der Anbau oder Proteinprobe mit Probenpuffer (1,97 g TRIS, 5 mg Bromphenolblau, 5,8 ml Glycerin, 1 g SDS, 2,5 ml β-Mercaptoethanol, füllen mit hochreinem Wasser bis 50 ml) in ein Verhältnis von 1: 1 (v / v) und Pipetten der Mischung nach 4 min Inkubation bei 95 ° C in die Geltaschen.
    3. Run SDS-PAGE 30 Minuten bei einer Spannung von 60 V, bis die Proben übergeben Sie die Sammlung Gel und Änderungsspannung bis 120 V, wenn das Bestehen der Trennung Gel.
    4. Entfernen Sie die Gele aus dem Gel-System gründlich mit hochreinem Wasser und Platz für 1 h in Fixierungslösung (10% Essigsäure, 50% absolutem Ethanol). Danach spülen Sie die Gele mit hochreinem Wasser.
    5. Stain Geledurch die Verwendung eines geeignet unspezifische kolloidale Coomassie-Brilliantblau-Methode 53,54. Nach Entfärben 72,73 nehmen SDS-PAGE-Bilder von der Gel-Dokumentations-System nach Herstellerprotokoll.

4. Sorptionsexperimenten im Batch-Modus und Metall Quantifizierung

  1. Für Batch Sorptionsexperimenten vorzubereiten Au (III) Stammlösung von HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O verdünnt man das Metallsalz und mischen Sie es mit dem SLP1 / NaCl-Lösung auf einen anfänglichen Metallkonzentration von 1 mM und letzte SLP1 Konzentration von 1 g / l . Führen Sie Experimente in Dreiergruppen mit einem zusätzlichen Negativkontrolle ohne SLP1. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 5 ml für Sorptionsexperimenten.
  2. Schütteln Sie die Suspension kontinuierlich bei RT an verschiedenen voreingestellten pH-Werten zwischen 2,0 bis 5,0 während 24 Stunden (pH-Einstellung mit niedriger konzentrierte HCl und NaOH-Lösung).
  3. Nach der Sorption Zentrifugation der Proben bei 15000 x g, 4 ° C für 20 min), um Separaß SLP1 vom Überstand.
  4. Den Überstand in die Ultrafiltrationsröhrchen (MWCO 50.000 Da) und Zentrifuge diese bei 15.000 × g, 4 ° C für 20 min, um gelösten Proteins Monomere zu entfernen.
  5. Bestimmen Sie die Metallkonzentration in dem erhaltenen Filtrat durch ICP-MS 19,20 und die Ergebnisse für die Rückrechnung des sorbierten Metall vom SLP1 Trockenmasse. Messprinzipien wurden Möglichkeiten des Verfahrens und der Komponenten des verwendeten ICP-MS in der Literatur 55 beschrieben.
    1. Vorbereitung der Proben und Referenzen für ICP-MS-Messungen unter Verwendung von 1% HNO 3 als Matrix und Rhodium als interner Standard (1 mg / ml).

5. Synthese von Au-NP und Bestimmung von Partikelgröße

Anmerkung: Citrat stabilisiert Au (0) -NP wurden gemäß einem zuvor durch Mühlpfordt, H. et al angepasst Verfahren synthetisiert. (1982), um kugelförmige Teilchen mit einem Durchmesser unter Erhalt von 10 bis 15 nm 56,57 .

  1. Bereiten Sie eine stabilisierte 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O Lager für den NP-Bildung.
  2. Verdünnen Sie 250 ul dieser Stammlösung in 19,75 ml hochreinem Wasser und Inkubation diese auf 61 ° C für 15 Minuten unter Schütteln aufeinander.
  3. Vorbereitung 5 ml einer zweiten Stammlösung (12 mM Gerbsäure, 7 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 0,05 mM K 2 CO 3) und inkubiere die 2. Lösung getrennt bei 61 ° C für 15 min.
  4. Fügen Sie unter konstantem Rühren der 2. Stammlösung zu einer Lösung. Rühre das Reaktionsgemisch für mindestens 10 Minuten bei 61 ° C. Danach abkühlen lassen die Lösung und es für NP-Beschichtung auf SLP1 Gitter innerhalb QCM-D-Experimente.
    Hinweis: Die resultierende Au (0) -NP wurden mit UV-VIS-Spektroskopie bei dem Absorptionsmaximum von 520 nm, typischerweise zum Nachweis von Au gebildet (0) -NPs 58 verwendet wird. Die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden.
  5. Analysieren Sie die Größe des gebildetenAu (0) -NP durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), die auch als dynamische Lichtstreuung, ist bekannt.
    1. Zur Bestimmung der NP Größe, über 1,5 ml synthetisiert Au (0) -NP Lösung in Küvetten unter staubfreien Bedingungen in einer Laminar-Flow-Box und analysieren sie mit einer Größe und Zetapotential-Partikelmessgerät. Eine detaillierte Beschreibung des PCS und Probenvorbereitung ist in Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 und Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D-Experimente - SLP1 Beschichtung auf Oberflächen und Au-NP Adsorption auf SLP1 Lattice

Hinweis: Die Messungen wurden mit einem QCM-D mit bis zu vier Flow-Module ausgestattet ist. Alle QCM-D Versuche wurden mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min bei 25 ° C durchgeführt. Slp1 Beschichtung und Metall / NP Inkubation wurden auf SiO 2 piezo AT-geschnittenen Quarz-Sensoren (Ø 14 mm) mit einer Grundfrequenz von ≈ 5 MHz durchgeführt. Spülschritte und fügenition der Lösung sind in den Figuren der repräsentative Ergebnisse Teil markiert. Die QCM-D Experimenten könnte als ein Schritt für Schritt Weise beginnend mit Reinigen und Oberflächenmodifikation der verwendeten Sensoren, gefolgt von SLP1 Rekristallisation und später auf dem Metall und Metalloxid NP Wechselwirkung beschrieben.

  1. Reinigungsverfahren:
    1. Statten Sie die Flüssigkeitszellen mit Sensor-Attrappen. Pumpe mindestens 20 ml (jeweils pro Modul) eines alkalischen flüssigen Reinigungsmittel (2% Reinigungsmittel in ultrareinem Wasser (v / v)) über die QCM-D und Schlauchsystem. Danach pumpen das fünffache Volumen (jeweils pro Modul) von ultrareinem Wasser durch das System (Durchflussmenge bis zu 300 & mgr; l / min). Führen Sie die Reinigung nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Reinigen Sie die SiO 2 Sensoren außerhalb der Flow-Module durch Inkubation (mindestens 20 min) in 2% SDS-Lösung und mehrmals gründlich die Sensoren danach mit Reinstwasser 61,62.
    3. Trocknen Sie die Kristalle gefiltert compressed Luft und legen Sie sie in einem Ozonreinigungskammer für 20 min 63,64.
    4. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang zweimal, um alle organischen Inhaltsstoffe zu entfernen.
    5. Um von der Sensoroberfläche zu entfernen gebundenen Metallen spülen Sie die Sensoren mit 1 M HNO 3. Danach führen alle Spülschritte mit hochreinem Wasser.
  2. Sensor Oberflächenmodifikation durch Polyelektrolyte:
    Hinweis: Die Oberflächenmodifizierung kann entweder im Inneren (durchströmen Verfahren) oder außerhalb des Strömungsmoduls (LbL-Technik). In diesen Experimenten, die auf folgende Weise, um die Oberflächen zu modifizieren, verwendet.
    1. Ändern Sie die Sensoren mit 3 g / l aus alternierenden Schichten von PE Polyethylenimin (PEI, MW 25.000) und Polystyrolsulfonat (PSS, MW 70.000) über Tauchbeschichtung mit LbL-Technik 40,41 vorher für den speziellen verbreitete System in dem Artikel von beschrieben Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Legen Sie die Sensoren im Inneren des entsprechenden PE-Lösung in tiefen well Platten und inkubieren Sie diese für 10 min bei RT.
    3. Nehmen Sie die Sensoren aus der PE-Lösung und spülen Sie die Sensoren zwischen jedem Tauchbeschichtungsschritt intensiv mit hochreinem Wasser.
      Hinweis: Der neue Oberflächenmodifikation aus mindestens drei PE-Schicht endet mit positiv geladenen PEI.
    4. Nach dieser externen Modifikation platzieren Sie die Sensoren im Inneren des Durchflussmodul und ins Gleichgewicht kommen die Sensoren durch Spülen mit hochreinem Wasser vor dem Start der Experimente.
  3. SLP1 Monolayer Umkristallisation:
    1. Aufzulösen SLP1 in 4 M Harnstoff zum Umwandeln Polymeren in Monomeren.
    2. Zentrifugieren monomerisiert Proteine ​​bei 15.000 × g, 4 ° C für 1 Stunde, um größere Agglomerate zu entfernen Protein.
    3. Mischen das solubilisiert und zentrifugiert SLP1 Stand mit Umkristallisieren Puffer auf eine endgültige Proteinkonzentration von 0,2 g / L.
      Hinweis: Das Kalzium abhängig Rekristallisation SLP1 (Selbstmontage) beginnt mit der Zugabe des recrystallization Puffer. Daher pumpen die gemischte Lösung mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min zu den Sensoren (im Strömungsmodulen platziert) unmittelbar. Die Rekristallisation nach stabilen Werten der Frequenz und Verlust Verschiebungen wurden innerhalb von QCM-D-Experimente nachgewiesen wurde.
    4. Nach erfolgreicher Protein Umkristallisation oben auf den PE-modifizierten Sensoren innerhalb der Strömungsmodule Spülen der beschichteten Sensoren Umkristallisation Puffer oder ultra waterintensively mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min, bis stabile Werte der Frequenz und der Verlust Verschiebungen wurden nachgewiesen.
      Hinweis: Der SiO 2 Oberflächenmodifizierung mit PE zur späteren Sorptionsexperimenten auf SLP1 Monoschicht und AFM-Untersuchungen ist in Abbildung 1 visualisiert.

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Abbildung 1. Schematischer Aufbau PE Oberflächenmodifizierung und SLP1 MonolayerBeschichtung; Diese Zahl hat sich von Suhr, M. et al modifiziert. (2015) 19 mit Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Metall und Metall NP Interaktion:
    Anmerkung: Die Sorption mit dem Au-Metallsalzlösung (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) wurde in einer Konzentration von 1 mM oder 5 mM bei pH = 6,0 mit 0,9% NaCl-Lösung durchgeführt. Au-NP-Adsorption wurde mit unverdünntem Au-NPs in 1,6 mM Tri-Natrium-Citrat-Puffer bei pH ≈ 5,0 getan.
    1. Nach erfolgreicher SLP1 Beschichtung in den Flow-Module, spülen Sie die erhaltenen SLP1 Schicht intensiv mit 0,9% NaCl-Lösung, bis stabile Werte für Frequenz und Verlustverschiebungen festgestellt wurden.
    2. Pumpe den vorbereiteten Metalllösung (1 mM) und NP-Lösung für die Leistungsmodule mit einer Fließgeschwindigkeit von 125 ul / min und verfolgen die Massen Adsorption an der Slp1 Schicht. Massen Adsorption kann direkt durch die Verfolgung der Frequenzverschiebungen für den Sauerbrey Gleichung (Gleichung 1) ermittelt werden.
    3. Nach Abschluss der Metalle und Metall NP Wechselwirkung, spülen Sie die Schicht mit Metall / NP freien Puffer zu schwach gebundenen oder schwach befestigt Metalle oder Nanopartikel zu entfernen.
      Wichtig: eine Darstellung der Versuchsaufbau ist in Figur 2 gezeigt.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Schematischer Aufbau QCM-D-Setup unter Verwendung von Flow Modul QFM 401 * 66. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Datenerfassung und Auswertung:
    1. Notieren Sie sich die Verschiebungen in der Frequenz in Hz (Af n) und Verlustleistung (& Delta; D n) Innerhalb der QCM-D-Experimente unter Verwendung von QCM-D spezifische Software.
    2. Verwenden Sie für die Auswertung des adsorbierten Massensensitivität (Delta; m) die Sauerbrey-Gleichung / Modell (Gleichung 1) 65 66, das gilt für ohne Reibung auf der Sensoroberfläche zu der n-ten Oberschwingung angewendet gekoppelt dünn und Hartfolien ist. Der Begriff C (Sauerbrey konstant) für das verwendete 5 MHz AT-Quarzsensor 17,7 ng ∙ ∙ Hz -1 cm -2 68. Für starre, gleichmäßig verteilt, und ausreichend dünn adsorbierten Schichten zu verwenden Gleichung 1 als eine gute Annäherung.
      figure-protocol-3
    3. Führen Sie zusätzliche Modellierung nach der Kelvin-Voigt-Modell gilt für viskoelastische Moleküle 68-71 mit dem herstellerspezifischen Software und vergleichen die Ergebnisse mit dem der Sauerbrey-Modell.
    4. Für die Berechnung der Schichtdicke und Masse Adsorption Verwendungals wichtige Modellparameter eine Schichtdichte der adsorbierten Schicht von 1,35 g cm -3 ∙ entsprechend zuvor für S-Schicht-Proteine ​​72-75 beschriebenen Werte. Verwenden Sie den gleichen Wert für die Berechnung der Metall-Wechselwirkung mit dem proteinhaltigen Schicht.

7. AFM-Messungen

  1. Führen Studien mit vollständig in der Lage AFM auf einer umgekehrten Lichtmikroskop.
    1. Nehmen Sie AFM-Aufnahmen in flüssiger mit dem Umkristallisieren Puffer oder ultrareinem Wasser direkt auf die beschichtete QCM-D-Sensoren.
    2. Spülen Sie die Sensoren mit hochreinem Wasser nach der QCM-D-Experimente und legen Sie sie im Inneren des AFM Fluidzelle. Daher geschlossenes Flüssigkeitszelle mit einem Gesamtvolumen von etwa 1,5 ml. Halten der Temperatur der Fluidzelle konstant bei 30 ° C.
    3. Verwenden einen Ausleger mit einer Resonanzfrequenz von ≈ 25 kHz in Wasser und einer Steifigkeit von <0,1 N / m. Einstellen der Abtastgeschwindigkeit zwischen 2,5 und 10 & mgr; m / sec.
    4. Nehmen Sie Bilder in dynamischen Kontaktmodus, während der Ausleger durch ein Piezo auf ihrer Resonanzfrequenz angeregt wird. Bestimmen des Abstandes des Auslegers an die Oberfläche der Schwingungsdämpfungs 76.
      Achtung: Höhe Bilder mit z-Skala gezeigt, während der z-Werte die genaue Topographie der Oberfläche. Amplitude (Pseudo 3D) Bilder ohne z-Skala gezeigt, weil Amplitude z-Werte hängen von Scan-Parameter und tragen begrenzte Informationen. Die Analyse der Bilder wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Auswertungssoftware 77 getan.

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Ergebnisse

Kultivierung von Mikroorganismen und SLP1 Charakterisierung

Die aufgezeichneten Daten des Bakterienwachstums zeigt das Ende der exponentiellen Wachstumsphase bei etwa 5 Stunden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass SLP1 können von diesem Zeitpunkt der Ernte (4,36 g / L nasser Biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) mit einer maximalen Ausbeute 19 isoliert werden. Dennoch Optimierung der Kultivierung mit...

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Diskussion

In dieser Arbeit untersuchten die Bindung von Au auf S-Layer-Proteine ​​wurde unter Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Methoden untersucht. Insbesondere die Bindung von Au ist sehr attraktiv, nicht nur für die Wiedergewinnung von Au aus dem Bergbau, Wasser oder Prozesslösungen, sondern auch für die Konstruktion von Materialien, zB sensorischen Oberflächen. Für Studien der Wechselwirkung Au (Au (III) und Au (0) -NPs) mit suspendierten und umkristallisiert Monoschicht von SLP1, das Protei...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die vorliegende Arbeit wurde teilweise durch die IGF-Projekt "S-Sieve" (490 ZBG / 1) durch das BMWi und des BMBF-Projektes "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A) finanziert finanziert. Besonderen Dank an Tobias J. Günther für seine wertvolle Hilfe bei der AFM-Studien und um Erik V. Johnstone zum Lesen des Manuskripts als englischer Muttersprachler. Ferner würde der Autor dieses Papieres gerne Aline Ritter und Sabrina Gurlit (vom Institut für Ressourcenökologie zur Unterstützung bei der ICP-MS-Messungen) zu danken, Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava und die Gruppe Biotechnologie des Helmholtz-Institut Freiberg für Ressourcentechnologie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equipment und Software
Bioreactor, Steam In Place 70L PilotanlageApplikon Biotechnology, NiederlandeZ6XInklusive dO2, pH-Sensoren von Applikon Biotechnology und BioXpert Software V2
Nichtinvasiver Biomassemonitor BugEye 2100BugLab, Concord (CA), USAZ9X---
Spektrometer Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech, Großbritannien80-2109-10Unternehmen jetzt GE Healthcare Life Sciences
MiniStar MikrozentrifugeVWR, Deutschland521-2844Zur Zentrifugation von Kultivierungsproben
Forschungssystemmikroskop BX-61Olympus Germany LLC, Deutschland037006Mikroskop in Kombination mit der Bildgebungssoftware
Cell^P (Version 3.1)Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Mü nster, Deutschland---zusammen mit Mikroskop
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-SCarr Centritech, Florida, USA9010PLTFür die Biomasseernte
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik, Deutschland431-2601Für die Geißelentfernung und Probenhomogenisierung
Sorvall Evolution RC Superspeed ZentrifugeThermo Fisher Scientific, USA728411Wird bei der Proteinisolierung
verwendet Mobiler High-Shear-Fluid-Prozessor, M-110EH-30 PilotMicrofluidics, Massachusetts, USAM110EH30KWird für die Zellruptur
verwendet Alpha 1-4 LSC GefriertrocknerMartin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Deutschland102041---
UV-VIS Spektrophotometrie (NanoDrop 2000c)Thermo Fisher Scientific, USA91-ND-2000C-LZur Bestimmung von Proteinen Konzentration
Mini-PROTEAN vertikale ElektrophoresekammerBio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland165-3322Für SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland1708030Zur Bildgebung von SDS-PAGE-Gelen
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer, Waltham (MA), USAN8120536Zur Bestimmung der Metallkonzentration
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes KönigreichZEN3600Zur Bestimmung der Nanopartikelgröße
Q-Sense E4 Gerät Q-Sense AB, Göteborg, SchwedenQS-E4bestellt über LOT quantum design (Software im Lieferumfang der E4-Plattform enthalten)
Q-Soft 401 (Datenaufzeichnung)Q-Sense AB, Göteborg, Schweden
Q-Tools 3 (Datenauswertung und -modellierung)Q-Sense AB, Göteborg, Schweden
QCM-D Strömungsmodule QFM  401 Q-Sense AB, Göteborg, SchwedenQS-QFM401bestellt über LOT quantum design
QSX  303 SiO2 piezoelektrische AT-Cut QuarzsensorenQ-Sense AB, Göteborg, SchwedenQS-QSX303bestellt über LOT quantum design
OzonreinigungskammerBioforce Nanoscience, Ames (IA), USAQS-ESA006bestellt über LOT quantum
design Rasterkraftmikroskop MFP-3D Bio AFMAsylum Research, Santa Barbara (CA), USAMFP-3DBioAFM Mess- und Bildgebungssoftware
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223Asylum Research, Santa Barbara (CA), USAImaging-Software in Cat. Nein. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 SoftwareWaveMetrics, Inc., USAImaging Software in Cat. Nein. MFP-3DBio
BioHeaterAsylum Research, Santa Barbara (CA), USABioheaterProbenheizer für AFM-Messungen
Biolever mini Cantilever,  BL-AC40TS-C2Olympus Germany LLC, Deutschland  BL-AC40TS-C2Bevorzugter Ausleger für AFM-Messungen
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L. , SpanienFreeware-Softwarefür die AFM-Analyse
Name<strong>CompanyKatalognummer>
Reinigungsmittel und andere Geräte
saure Säure, 100 %, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3738.5Gefährliche, entzündbare und ätzende Flüssigkeiten und Dämpfe. Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden.
Antischaum 204Sigma-Aldrich Co., LLC.A6426Zur Schaumunterdrückung
Bromphenolblau, NatriumsalzSigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)CARL ROTH GmbH+CO. KG3862.1---
Desoxyribonuklease II aus SchweinemilzSigma-Aldrich Co., LLC.D4138Typ IV , 2.000 - 6.000  Kunitz Einheiten/mg
Protein Ethanol, 95%VWR, Deutschland20827.467Gefahr, brennbares
Glycerin, p.A.CARL ROTH GmbH+CO. KG3783.1---
Guanidinhydrochlorid (GuHCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
Salzsäure (HCl) (37%)CARL ROTH GmbH+CO. KG4625.2Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Einstellung
Lysozym aus HühnereiweißSigma-Aldrich Co. LLC verwendet.Nr. L6876 Lyophilisiertes Pulver, Protein = 90 %, = 40.000 Einheiten/mg Protein (Sigma)
Magnetrührer mit Heizung  MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG, Deutschland504.10100.00Standardrührer im Experiment
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
Salpetersäure (HNO3)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN50.1Gefahr; oxidierende, korrosierende
PageRuler Ungefärbte ProteinleiterThermoScientific-Pierce26614---
Poly(sodium 4-styrolesulfonat) (PSS)Sigma-Aldrich Co. LLC.243051durchschnittlichen Mw ~70.000
Polyethylenimin (PEI), verzweigteSigma-Aldrich Co. LLC.408727Warnung; Schädlich, reizend, gefährlich für die Umwelt; durchschnittlich Mw ~25.000
Kaliumcarbonat wasserfrei (K2CO3)Sigma-Aldrich Co. LLC.60108Warnung; Schädliche
Ribonuklease A aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-Aldrich Co. LLC.R5503Typ I-AS, 50 - 100 Kunitz Einheiten/mg Protein
Natriumazid (NaN3)Merck KGaA106688Gefahr; sehr giftig und umweltgefährlich
Natriumchlorid (NaCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG3957.2---
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-Aldrich Co., LLC.L-5750Gefahr; giftiges
Natriumhydroxid (NaOH)CARL ROTH GmbH+CO. KG6771.1Gefahr; Korrosiv, zur pH-Regulierung in der Kultivierung und zur pH-Einstellung
Spectra/Por 6, Dialysemembran, MWCO 50.000 CARL ROTH GmbH+CO. KG1893.1---
Schwefelsäure (H2SO4)CARL ROTH GmbH+CO. KGHN52.2Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Regulierung in der Kultivierung
Tanninsäure (C76H52O46)Sigma-Aldrich Co. LLC verwendet.16201---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)CARL ROTH GmbH+CO. KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO. KG3051.3Warnhinweis; Schädlich, gefährlich für die Umwelt
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO UltrafiltrationsrohreSartorius AGVS0132---
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich Co. LLC.M6250Gefahr, giftig
------ von

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