Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.
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Methodenartikel
Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit von CD4 T-Zellen-Effektorfunktionen durchzuführen ist abhängig von der eine rasche und effiziente Migration dieser Zellen in entzündetem peripheren Geweben durch eine bislang undefinierten Mechanismus. Die Anwendung der Multiphotonenmikroskopie auf die Untersuchung des Immunsystems liefert ein Werkzeug, um die Dynamik der Immunantworten in intakten Geweben zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die nicht-invasive intravital Multiphotonen- Bildgebung von CD4-T-Zellen in den entzündeten Mausohr Dermis. Verwenden einer benutzerdefinierten Imaging-Plattform und ein Katheter ermöglicht die Visualisierung von CD4 T-Zell-Dynamik in der dermalen interstitium, mit der Fähigkeit, diese Zellen in Echtzeit über die Zugabe von blockierenden Antikörpern zu den wichtigsten molekularen Komponenten der Motilität beteiligt zu befragen. Dieses System bietet Vorteile gegenüber sowohl in vitro - Modellen und chirurgisch - invasiven bildgebenden Verfahren. die Wege, die von CD4-T-Zellen für die Motilität Verständnis liefern kann letztlich Einblick in die Basic Funktion der CD4-T-Zellen sowie die Pathogenese der beiden Autoimmunerkrankungen und Pathologie von chronischen Infektionen.
Einleitung
Die Effektorfunktion von CD4-T-Zellen hängt entscheidend von ihrer Fähigkeit ab, schnell in eine Vielzahl von peripheren Geweben einzudringen und diese zu durchqueren, um nach Schäden zu suchen, Infektionsherde zu lokalisieren oder Pathologien durch chronische Infektionen oder Autoimmunität zu verursachen. Während die Prozesse des Homings zu den entzündeten Stellen1-4 und der Extravasation5-7 aus dem Gefäßsystem in das Gewebe gut charakterisiert wurden, sind die Faktoren, die die interstitielle Motilität von T-Zellen antreiben und regulieren, noch nicht definiert. Die Migration von T-Zellen in komplexen 3D-Umgebungen wurde in vitro unte....
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Protokoll
Alle Verfahren Mäuse beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Rochester genehmigt und durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und der Public Health Service Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labor verabreicht Tiere von den National Institutes Gesundheitsamt für Labortierschutz.
1. Herstellung von Effektorzellen CD4 T-Zellen
HINWEIS: Balb / c-TCR-transgenen Mäusen, die DO 11.10 spezifisch ein Peptid aus Hühnerei Ovalbumin (Pova: ISQAVHAAHAEINEAGR) erkennen. Andere TCR-transgenen Systeme ersetzt werden kann, die entsprechende v....
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Ergebnisse
Die Fähigkeit , Immunreaktionen in situ zu untersuchen , ohne die Immunumgebung zu verändern ist wesentlich, mit einem entzündeten Gewebe in Echtzeit Wechselwirkungen von T - Effektorzellen zu studieren. Imaging der intakten Ohr Dermis durch dieses Protokoll, umrissen in Figur 1A und B, ermöglicht die Visualisierung der übertragenen fluoreszenzmarkierten T - Effektor - Zellen in der dermalen Interstitium. Dies ermöglicht sowohl hochauflösendes <.......
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Diskussion
Bedeutung
Hier präsentieren wir ein komplettes Protokoll für die 4D-Visualisierung übertragen, antigenspezifischen Effektor Th1-Zellen in den intakten Mausohr Dermis. Dieses Verfahren bietet Vorteile gegenüber einigen aktuellen Bildgebungsmodalitäten aus mehreren Gründen. Durch die Abbildung der ventralen Ohr Dermis, sind wir in der Lage Haarentfernung zu verzichten, die für die Bildgebung Protokolle unter Einbeziehung anderer Hautstellen erforderlich ist. Obwohl Enthaarungsmittel A.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken der University of Rochester Multiphotonenionisation Mikroskop Core Facility für die Hilfe bei Live-Bildgebung. Unterstützt von NIH AI072690 und AI02851 zu DJF; AI114036 bis AG und AI089079 zu MGO.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BALB/c-Mäuse | Jackson Laboratories | 000651 verwendete Mäuse wurden von hauseigenen | |
| DO11.10-Mäusen gezüchtet, | Jackson Laboratories | 003303 | verwendeten Mäuse wurden von hauseigenen gezüchtet |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118,03 | Hitze inaktiviert bei 56 ° C für 30 Minuten |
| Meerschweinchen-Komplementär | Cedarlane | CL-5000 | |
| Anti-CD8-Antikörper | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antikörper abgeleitet von diesem Hybridom |
| anti-MHC Klasse II Antikörper | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antikörper abgeleitet von diesem Hybridom |
| anti-CD24 Antikörper | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antikörper abgeleitet von dieses Hybridom |
| anti-Thy1.2 Antikörper | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antikörper abgeleitet von dieses Hybridom |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylierter Anti-CD62L-Antikörper (Klon MEL-14) | BD | ||
| Streptavidin magnetische Trennkügelchen | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Trennsäule | Miltenyi | 130-042-401 | |
| rekombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| rekombinante Maus IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rekombinante Maus IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg-Antikörper (Klon XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4-Antikörper (Klon 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-Glutamin | Fisher | 15323671 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| Ovalbumin-Peptid | Biopeptid | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH-Peptid | |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Hitze inaktiviert bei 56 &de; C für 30 Minuten |
| 24-Well-Kulturplatte | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 Insulinspritzen, 1 ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 Insulinspritzen, 300 μm l | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB Spritzen, 1 ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 Nadeln | BD | 305106 | |
| PE-10 medizinischer Schlauch | BD | 427400 | |
| Cyanacrylat-Veterinärklebstoff (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Heizplatte | WPI | 61830 | |
| Heizplatten-Controller | WPI | ATC-2000 | |
| Wasserdecken-Controller | Gaymar | TP500 | Nicht mehr in Produktion, neueres Äquivalent verfügbar |
| Wasserdecke | Kent Scientific | TP3E | |
| Isofluran-Verdampfer | LEI Medical | Isotec 4 | Nicht mehr in Produktion, neueres Äquivalent verfügbar |
| Isofluran | Henry Schein | Bestellt über Veterinary | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | für Personal VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| Medical Tape | 3M | 1538-0 | |
| Isofluran-Nasenkonus | Im eigenen Haus gebaut, siehe Abb. 2 | ||
| Bildgebungsplattform | Im eigenen Haus gebaut, siehe Abb. 2 | ||
| gebogene Pinzette | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| Scheren | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| Glasdeckgläser | VWR | Multiple Equivalent | |
| Hochvakuumfett | Fisher | 146355D | |
| Wattestäbchen Multiple | Equivalent | ||
| Delicate Task | Wipes Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM aufrechtes Mikroskop mit Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa Laser | Olympus | Angebot anfordern | |
| optischer Tisch mit Vibrationskontrolle | Newport | Angebot anfordern | |
| 25x NA 1.05 Wasserimmersionsobjektiv für Multiphotonen-Bildgebung | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Objektivheizung | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detektionsfilter Würfel | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietärer Würfel, kann aus einzelnen Filtern/dichroitischem |
| Anti-Integrin &Beta approximiert werden; 1 Antikörper (Klon hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azidfreies, endotoxinarmes |
| Anti-Integrin & Beta; 3 Antikörper (Klon 2C9. G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azidfreies, endotoxinarmes |
| Texas Red Dextran (70.000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
Referenzen
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
