Erzeugen eines "humanisierte" Drosophila S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Drosophila S2-Zelllinie erzeugt wird, die empfindlich auf niedermolekulare Inhibitoren von Kinesin-5 reagiert. Die Verwendung dieser Zellen in einem zellbasierten Fehlerkorrektur-Assay wird ebenfalls skizziert.

Zusammenfassung

Kinetochore sind große proteinbasierte Strukturen, die sich während der Zellteilung auf Zentroeren anlagern und Chromosomen mit Spindelmikrotubuli verbinden. Die richtige Verteilung des genetischen Materials erfordert, dass die Schwester-Kinetochore auf jedem Chromosom biorientiert werden, indem sie sich von gegenüberliegenden Spindelpolen an Mikrotubuli anheften, bevor sie in die Anaphase übergehen. Fehlerhafte, nicht-biorientierte Bindungszustände sind jedoch häufig und es existieren zelluläre Wege, um solche Bindungen während der Zellteilung sowohl zu erkennen als auch zu korrigieren. Der Prozess, durch den unsachgemäße Kinetochor-Mikrotubuli-Wechselwirkungen destabilisiert werden, wird als Fehlerkorrektur bezeichnet. Um die Fehlerkorrektur in lebenden Zellen zu untersuchen, werden absichtlich falsche Attachments durch chemische Hemmung des Kinesin-5-Motors erzeugt, was zu einer monopolaren Spindelanordnung führt, und der Übergang von Fehlorientierung zu Biorientierung wird nach dem Auswaschen des Medikaments beobachtet. Die große Anzahl von Chromosomen in vielen Modell-Gewebekultur-Zelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse dar. Drosophila S2-Zellen sind bessere Probanden für solche Studien, da sie nur 4 Chromosomenpaare besitzen. Kleinmolekulare Kinesin-5-Inhibitoren sind jedoch gegen Drosophila Kinesin-5 (Klp61F) unwirksam. Hier beschreiben wir, wie man eine Drosophila-Zelllinie aufbaut, die Klp61F effektiv durch humanes Kinesin-5 ersetzt, was die Zellen empfindlich gegenüber pharmakologischer Hemmung des Motors macht und für den Einsatz im zellbasierten Fehlerkorrektur-Assay geeignet ist.

Einleitung

Equal Segregation des Genoms während der Zellteilung erfordert korrekte Wechselwirkungen zwischen den DNA repliziert und Spindel Mikrotubuli. Mikrotubuli physisch Chromosomen zu interagieren durch ein Ensemble von Proteinen, die an Zentromeren als Kinetochor ¹ bekannt versammelt. Korrekte Verteilung der Chromosomen erfordert Schwester Kinetochore sind biorientierte, wobei jede Schwester mit Mikrotubuli von gegenüberliegenden Spindelpole Ursprung verbunden. Kinetochor Mikrotubuli (kt-MT) Anlagen, die in der biorientierten Konformation nicht schnell und effizient destabilisiert, die Gelegenheit zu Biorientierung in einem Prozess als Fehlerkorrektur bekannt zu etablieren ist. Eine Fehlerkorrektur-Assay, die zuvor in Säugetierzellen hergestellt wurde ⁵ erfordert die Montage monopolare Spindeln mit umkehrbarer niedermolekularen Inhibitoren gegen Eg5 (Kinesin-5). Die medikamentöse Behandlung erzeugt eine Vielzahl von fehlerhaften syntelic Anhänge, in denen Both Schwester Kinetochoren zu befestigen, um die gleiche Spindel-Pol. Eine nachfolgende Auswaschung des Wirkstoffs ermöglicht die Visualisierung der dem Fehlerkorrekturverfahren. Die Fehlerkorrektur-Assay kann in Anwesenheit von Kleinmolekül-Inhibitoren oder Niederschlägen durchgeführt, um den Beitrag von Kandidatenproteinen auf die Korrektur fehlerhafter kt-MT-Anhänge zu untersuchen.

Die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur in lebenden Zellen sichtbar zu machen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen in diesem komplexen Prozess beteiligten weiter zu verstehen. Die große Anzahl von in den meisten Zelllinien vorhanden Chromosomen stellt jedoch eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner kt-MT-Anhänge. Drosophila S2 Zellen wäre ideal für die Anwendung des Fehlerkorrektur Assay, da sie so wenig wie 4 Chromosomen ^6, aber kleine Molekülinhibitoren enthalten von Kinesin-5, wie etwa S-Trityl-L-cystein (STLC) und Monastrol ^7-9 nicht beeinträchtigen Spindelanordnung oder Kinesin-5 Motorik in Drosophila-Zellen. Deshalb Gattungented ein Drosophila S2-Zelllinie menschlichen Kinesin-5 unter einem induzierbaren Promotor, die empfindlich auf Kinesin-5-Hemmer ist, zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die endogenen Drosophila Kinesin-5-Homologen, Klp61F Knockdown, und verwenden Sie diese Zelllinie in der zellbasierten Assay-Fehlerkorrektur.

Protokoll

1. Transfektion von S2-Zellen

1. Aus einer zuvor gezüchteten 25 cm ^{2 -Kolben,} fügen GFP-α-Tubulin-exprimierenden S2-Zellen ^{10 bis} zu einem Endvolumen von 2 ml zu 100% Konfluenz und ihnen erlauben, halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für ca. 1 Std.
2. Entfernen Sie das Medium aus dem Gericht. Transfizieren 2 ug der Eg5-mCherry konstruieren ¹¹ mit 1 ml Schneiders Medium mit 10% FBS (bezeichnet als Schneiders Medien bezeichnet) und Transfektionsreagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Dichten Sie das Gericht mit Parafilm und inkubieren Zellen bei 25 ° C für 16-18 Stunden.
3. 1 ml der Schneider Medien. Zurückzukehren Zellen auf 25 ° C Inkubator.
4. Am Tag 3 nach der Transfektion übertragen 500 ul transfizierter Zellen in eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, enthaltend 1,5 ml des Schneiders Medien für eine Test Induktion. Induzieren die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO ₄ , um eine Endkonzentration von 500 uM. Dichten Sie das Gericht in Parafilm und Inkubation bei 25 ° CO / N.
5. Um Concanavalin A-beschichtete Deckgläser, Pipetten genug Volumen von Concanavalin A (0,5 mg / ml in _H 2 O gelöst) zu beschichten, machen eine Säure gewaschen Deckglas, entfernen Sie das überschüssige, und lassen Sie das Deckglas an der Luft trocknen.
6. Platzieren eines 22 mm x 22 mm Concanavalin-A-beschichtete Deckgläschen in einer sauberen 35-mm-Gewebekulturschale, dann Samen 500 ul zu 100% Konfluenz der induzierten Zellen auf dem Deckglas und damit die Zellen für 1 h bei RT halten.
7. Um Eg5-mCherry Ausdruck zu überprüfen, montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder entsprechende Abbildungsgefäß) mit Medien für die Bildgebung bei RT auf einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie geeignete Lichtquellen und Filter-Sets, um die Zellen zu visualisieren. Beispielsweise das Mikroskop in dieser Studie verwendet wird, besitzt einen LED-Weißlichtquelle und EGFP (FITC / Cy2) und DsRed (TRITC / Cy3) Filterwürfel. Eg5-mCherry lokalisiert an Mikrotubuli und angereichert near Spindelpole.
8. Nachdem sichergestellt ist, dass die Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin, übertragen den Rest der transfizierten, nicht-induzierten Zellen auf eine ²⁵ cm2 Zellkulturflasche mit 4 ml Schneiders Medien.
9. In Blasticidin S HCL in einer Endkonzentration von 25 ug / ml in den Kolben von transfizierten Zellen und weiter Aufteilen in Gegenwart von 25 ug / ml Blasticidin S HCl bis zum Zelltod nicht mehr sicher zu sein, um für die Expression von Eg5-mCherry in regelmäßigen Abständen überprüfen. Inkubieren Zelllinien in 25 ° C-Inkubator.
   HINWEIS: Der Prozentsatz von Zellen, die Eg5-mCherry Zeit zunimmt.
10. Sobald Zellen stabil transfizierten, weiterhin in der Abwesenheit von Arzneimittel aufgeteilt und gefrier ^{12 Zellen} für zukünftige Verwendung.

2. RNA-Interferenz

1. PCR zu amplifizieren ein ~ 500 bp Region Klp61F von cDNA (LD15641) unter Verwendung des Primers mit Mehr T7-Promotorsequenz (Sequenz in der Materialliste zur Verfügung gestellt) zu sein,als Matrize für dsRNA-Synthese eingesetzt.
   1. Vier PCR-Reaktionen, die jeweils 50 ul, enthaltend 100 ng Template-DNA, 25 & mgr; M von jedem Primer, geeignete Puffer und Polymerase eingestellt. Stellen Sie den PCR-Protokoll auf dem Thermocycler nach der Polymerase Herstellerprotokoll.
   2. Pool und sauber vier PCR-Reaktionen unter Verwendung eines PCR bereinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Bewahren Sie die saubere Vorlage bei -20 ° C.
2. Bereiten doppelsträngige RNA (dsRNA) aus Vorlage unter Verwendung eines T7-RNA-Transkription-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Erwarten Sie ~ 5-15 mg / ml Konzentration der dsRNA. Speichern dsRNA bei -20 ° C.
3. Um Klp61F mit dsRNA Knockdown, ermöglichen S2-Zellen, die Eg5-mCherry bei 25% Konfluenz auf halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für 1 h.
4. Entfernen Sie die Medien aus den Schalen und fügen Sie 5 ug dsRNA gegen Klp61F (Drosophila Kinesin-5) in 1 ml Serum-freien Schneider verdünnt "s Medien.
5. Inkubation bei RT für 1 h, dann fügen Sie 1 ml Schneider-Medien mit 10% FBS. Inkubiere Zellen bei 25 ° C.
6. 24 h nach der dsRNA Behandlung induziert die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO _{4 bis zu einer} Endkonzentration von 500 uM. Zellen inkubieren bei 25 ° C für weitere 24 Stunden.

3. Live Cell Imaging

1. Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckglas in eine saubere 35-mm-Gewebekulturschale.
2. Samen 500 ul der Zellen, die mit dsRNA behandelt worden und induzierte O / N auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas und ihnen erlauben, für etwa 1 Stunde zu halten.
3. Montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder andere geeignete Behälter) für die Bildgebung.
4. Finden mitotischen Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin.
   HINWEIS: Mitotische Zellen nur GFP-α-Tubulin-ausdrücken sollte monopolare Spindeln seit Klp61F, die für Spindel Bipolarität erforderlich sind, wird zu Boden geworfen ^10,13.
5. Sammeln Sie Zeitrafferbilder von bipolarer Spindeln (zB 1 Frame pro Minute) in Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin.
6. Während Bildgebung, entfernen Sie die Medien aus dem Rosenkammer, und ersetzen Sie es mit Schneider-Medium, das 1 & mgr; M STLC über 3 aufeinanderfolgende Medienaustausch (~ 5 ml insgesamt) in die Kammer, um Spindel Zusammenbruch zu visualisieren.
7. Um das Medikament Auswaschen und umgekehrt die Spindel Kollaps, entfernen Sie vorsichtig die STLC haltigen Medien aus dem Rosenkammer, und waschen in Schneiders Medien 4x (6-8 ml gesamt) vor dem Nachfüllen der Rose Kammer ein letztes Mal durch frische Medien. Weiter Bildgebung.

4. Error Correction Assay

1. Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckgläser in saubere 35-mm-Gewebekulturschalen.
2. Samen 500 ul Zellen, die mit Klp61F dsRNA auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas behandelt wurden und es ihnen zu haften.
3. Nachdem die Zellen ADHERed, fügen Sie 1,5 ml Schneider Medien zu jeder Schale, um das endgültige Volumen auf 2 ml zu bringen.
4. Um Zellen zu verhaften in der Mitose, fügen MG132 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zu jedem der Gerichte, und Inkubation für 1 Std.
5. 1 & mgr; M STLC und Inkubation für 1 Stunde, damit Monopole zu bilden.
6. Auswaschen des STLC durch Spülen Deck 3x mit 2 ml frischem Schneiders Medien jedes Mal.
7. Deckgläser mit Schneiders Medien inkubieren zusätzlich zu pharmakologischen Medikamente (zB Aurora-Kinase-Inhibitoren) oder DMSO als Kontrolle.
   Hinweis: Inhibitorkonzentrationen variieren und ordnungsgemäße Endkonzentrationen muss vom Versuchsleiter bestimmt werden. Stammlösungen werden in der Regel so getroffen, daß der Inhibitor, verdünnt 1: 1.000 in Medien. In diesem Fall wird eine 1: 1000 Verdünnung dient DMSO (oder geeigneten Lösemittel), wie der Fahrzeugsteuerung. Wir verwenden den Aurora-B-Hemmstoff Binucleine 2 bei einer Endkonzentration von 40 uM.
8. Fixieren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten to beobachten, das Fortschreiten der bipolaren Spindelbildung und Kinetochor Befestigungsstaaten zu beurteilen. Reparieren:
   1. Schnell spülen Sie die Deckgläser mit 2 ml 1x BRB-80.
   2. Fixieren Zellen durch Zugabe von 2 ml von 10% igem Paraformaldehyd in 1x BRB-80 für 10 min verdünnt. Pipet Para sorgfältig in einer chemischen Abzugshaube.
   3. Permeabilisieren Zellen mit 2 ml 1X PBS + 1% Triton-X für 8 min.
   4. Wasch gleitet 3mal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Triton-X.
   5. Überdeckgläser Zell-Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm (verwenden Sie eine Markierung, um Parafilm beschriften angemessen, den Überblick über die Objektträger zu halten) in einer 150 mm Petrischale.
   6. Decken Sie die Deckgläser mit 150 ul gekocht Eselserum (BDS) und Inkubation bei RT für 1 h auf nicht-spezifischen Antikörper zu blockieren verbindlich.
      Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. Um den Feuchtigkeitskammer stellen, säumen den Rand eines 150 mm-Schalemit einem feuchten Labortuch geben und mit der Petrischale Deckel.
   7. Entfernen Block und inkubiere die Deckgläser für 1 h bei RT mit 150 & mgr; l primärer Antikörper in geeigneter Weise in BDS verdünnt, um Haftstellen und Mikrotubuli zu Endkonzentrationen von 2 ug / ml-Abstrichen (oder entsprechend den Empfehlungen des Herstellers) und 1 & mgr; g / ml .
      Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden.
   8. Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X.
   9. Deck Inkubieren für 30-60 min bei RT mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörper in BDS verdünnt.
   10. Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X.
   11. Inkubieren Deckgläser mit 150 ul BDS, enthaltend 1 ug / ml DAPI Endkonzentration 5 min.
   12. Waschen Sie Deckgläschen 2x mit 1x PBS + 0,1% Triton-X, und montieren coverslips Zellenseite nach unten auf eine 3x1 "Objektträger mit 8 ul Montage Medien. Malen Sie die Ecken mit Nagellack, um die Deckgläser auf Objektträger zu immobilisieren.
9. Bildzellen mit bipolarer Spindeln, die zum Ausdruck bringen Eg5-mCherry werden. Werfen Sie einen Z-Serie, bestehend aus 30 Flugzeugen bei 0,2 & mgr; m Abständen in allen Kanälen mit einem 100x Objektiv. Sorgfältig zu analysieren, die Kinetochoren und Mikrotubuli, die Befestigungszustände (biorientierte oder syntelic Anhänge) zu bestimmen.

Ergebnisse

Klp61F erforderlich ist, um bipolare Spindeln zu bilden. Der menschliche Kinesin-5, Eg5, kann die Funktion des Klp61F in Drosophila S2-Zellen (1A und D) zu retten. Nach Zugabe des Kinesin-5-Inhibitor (STLC), Mikrotubuli-assoziierten Niveaus des Kraftabfall (1B und E) und die Spindel zusammenbricht, was in einer Monopol (1C und F) in Zellen, denen endogene Klp61F bei erfolgreicher RNAi (Supplemental Film 1). Es ist bemerkenswert, dass die bipolare Spindeln bei Zugabe von STLC in den humanisierten S2-Zellen zusammenbrechen, weil Kinesin-5-Aktivität ist nicht verpflichtet, Spindel Bipolarität in menschlichen Zellen zu erhalten. Diese interessante Diskrepanz kann eine Folge der Unterschiede in inter Mikrotubuli Überschneidungen und / oder Stabilität in den beiden Modellsystemen ¹⁴ zu sein. Kinesin-5-Hemmung (2A und E) können reve werden durch Auswaschen des Arzneimittels und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel RSED kann im Laufe der Zeit folgen. Bei Entfernung des Inhibitors (2B und F) wieder assoziierten Eg5-mCherry mit den Mikrotubuli als bipolarer Spindel montiert (2C und G), und die Zellen können in einer bipolaren Anaphase (2D und H, Supplemental Film 2 Fortschritt ).

Abbildung 1. Die Zugabe von 1 uM STLC führt zu monopolaren Spindeln in Drosophila S2 Zellen. Repräsentative Bilder von Zeitraffer Bildgebung eines Drosophila S2 exprimierenden Zelle Eg5-mCherry (AC) und GFP-α-Tubulin (DF) während der Zugabe von 1 & mgr; M STLC. Die Eg5-Inhibitor wurde nach 3 min zugegeben. Maßstabsbalken = 5 um. Timestamp = min: sec. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Eine bipolare Spindel Reformen beim Entfernen STLC. Repräsentative Bilder von Zeitraffer-Bildgebung eines Drosophila 2 Zelle, die Eg5-mCherry (AD) und GFP-α-Tubulin (EH) während eines STLC Auswaschen Experiment. STLC wurde bei 5 min gewaschen. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des STLC. Maßstabsbalken = 5 um. Zeitstempel: min: sec. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> STADT Film 1. (Rechtsklick zum Download). Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry ( links) und GFP-α-Tubulin (rechts). 1 uM STLC wurde auf 2 min zugegeben und die Spindel bildet einen Monopol innerhalb 10 min nach Zugabe des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min gewonnen und spielte bei einer Rate von 10 Rahmen pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um.

STADT Film 2 (Rechtsklick zum Download). Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry (links) und GFP-α-Tubulin (rechts). Medien, die 1 & mgr; M STLC wurde entfernt undin 5 min gespült. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min erworben und spielte mit einer Rate von 10 Bildern pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um.

Diskussion

Visualisierung von Fehlerkorrektur ist eine wertvolle Technik, um die Schritte in diesem wichtigen und komplexen zellulären Prozess beteiligt zu studieren. Um dies zu tun, werden fehlerhafte Anhänge mit reversible Inhibitoren erzeugt und die Fehlerkorrektur nach Auswaschen des Arzneimittels beobachtet. Dieser Test wurde ursprünglich unter Verwendung von Säugetier-Gewebekulturzellen ⁵ entwickelt. Jedoch ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von Haftstellen in vielen Modellsäugetierzelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse. Drosophila S2 Zellen besitzen so wenige wie 4 Paare von Haftstellen, so dass sie eine mehr bevorzugte Zelllinie zur Beobachtung der Fehlerkorrektur. Jedoch ist ein großer Nachteil, dass viele Inhibitoren unwirksam Drosophila S2 Zellen. Somit stellt die Fähigkeit, eine humanisierte Drosophila S2 Zelllinie zu generieren, die menschliche Kinesin-5 ein wertvolles Werkzeug, um eine Fehlerkorrektur zu studieren.

Obwohl Drosophila S2 Zellen sein kannbessere Zelllinie, um eine Fehlerkorrektur zu studieren, die mehrere Schritte bei der Erlangung der Zelllinie und umzuwerfen essentielle Gene beteiligt wirft einige Herausforderungen dieser Technik. Zum Beispiel, kann die Transfektionseffizienz ziemlich niedrig sein. Bei weniger als 20% der Zellen exprimieren die Eg5-mCherry sollte die Transfektion wiederholt werden, wie der Auswahlvorgang dauert länger. Auch kann der Anteil der Zellen, die sowohl fluoreszierende Proteine ​​mit der Zeit ab. Dies kann durch die Spaltung von Zellen in Gegenwart von Blasticidin S HCl und Hygromycin B, um Zellen, die Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin jeweils auszuwählen, überwunden werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Drosophila S2 Zellen Orthologe viele humane Proteine ​​und; daher ist es wichtig, die Zuschlagsbedingungen für die endogenen Proteine ​​zu optimieren. Zuschlags optimalen Bedingungen können in der Menge von dsRNA und die Behandlungsdauer variieren. Angesichts der Entstehung und rasche Verbesserung CRISPR-Cas9 Technologies ^15-17, Erzeugung eines Drosophila-Zelllinie mit der Klp61F Gens durch menschliche Eg5 ersetzt präsentiert eine leistungsfähige Alternative, die die Grenzen der Transfektion und Zuschlags Ansatz zu überwinden wäre. Unsere Arbeit zeigt, dass Fly-zu-Mensch-Gen-Ersatz sollte ein gangbarer Weg ist in diesem Fall, obwohl die notwendigen Reagenzien, um so in Drosophila S2-Zellen tun, werden derzeit entwickelt.

Dieses Verfahren ist nicht auf Eg5 beschränkt, sondern kann angewendet, um die Funktion anderer Proteine ​​von Interesse zu untersuchen. Bei der Verwendung von Inhibitoren, die zuvor festgelegt wurden unwirksam in Drosophila S2-Zellen zu sein, kann dieses Protokoll geändert werden, um die unmittelbare Wirkung von Inhibitoren in lebenden Zellen, ohne Bedenken bezüglich vorbei Effekte zu studieren. Die Verwendung dieses Protokolls produziert Zelllinie könnte auch im Hochdurchsatz-Screening verwendet werden analysiert, um potenzielle Medikamente gegen Proteine, die in Fehlerkorrektur beteiligt sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Effectine Transfection Reagenz	Qiagen	301425
Klp61F cDNA	Drosophila Genomic Resource Center	13690	Genname LD15641
Schneider' s Medien	Invitrogen	21720-024
Fötales Rinderserum, zertifiziert	Invitrogen	10082-147	Hitzeinaktiviert, US-Herkunft
Kupfer(II)-sulfat (CuSO4)	Sigma	C8027-500G	500  mM Bestand
S-Trityl-L-Cystein	Sigma	164739-5G	1  mM Lagerbestand in DMSO
Blasticidin HCl	Invitrogen	R21001	5  mg/ml Vorrat in 1x PBS
Hygromycin B	Invitrogen	10687010
T7 Large scale RNA Production System	Promega	P1320	Die ungefähre dsRNA-Konzentration aus jeder Reaktion beträgt etwa 5-15  &Mikro; g/µ l
Klp61F RNAi F Primer	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R Primer	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR Clean-up	Kit Mo Bio Laboratories, Inc	1250
Concanavalin A	Sigma	C5275	0,5  mg/ml Lösung, die durch Auflösen in 1x PBS hergestellt wird.
Gekochtes Eselserum	Jackson ImmunoResearch Labs	017-000-121	5%ige Stammlösung in 1x PHEM-Puffer, Lösung zum Kochen bringen. Gelagert in 4  °C.
Einhängemittel			20  mM Tris pH 8,0,  0,5 % N-propylgallat, 90 % Glycerin. Gelagert in 4  °C.
1x BRB-80			80 mM ROHRE pH 6,9; 1  mM EGTA; 1 mM MgCl2
Weißlichtquelle	Lumencor Inc
ET EGFP Filter Cube	Chroma	49002
DSRed Filter Cube		Chroma 49005
Anti-NDC80 Antikörper			Sonderanfertigung durch das Maresca Lab
DM1α (Anti-Α-Tubulin)	Sigma	T6199
Anti-CID-Antikörper	AbCam	ab10887