Dieses Protokoll beschreibt, wie eine klare native gel-eluierte Flüssigfraktions-Einschlusselektrophorese (CN-GELFrEE) hergestellt und durchgeführt wird, eine native Trenntechnik für nicht-kovalente biomolekulare Anordnungen und Proteine aus heterogenen Proben, die mit verschiedenen nachgeschalteten Proteinanalysetechniken kompatibel ist.
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Methodenartikel
CN-GELFrEE - Clear india geleluiert flüssige Fraktion Verleitung Elektrophorese
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Protein-Komplexe führen eine Reihe von entscheidenden zellulären Funktionen. Aufklären ihre nicht-kovalente Wechselwirkungen und Dynamik ist von größter Bedeutung für das Verständnis der Rolle der Komplexe in biologischen Systemen. Während die direkte Charakterisierung biomolekularer Baugruppen zunehmend in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen hat, einheimische Fraktionierung Techniken, die mit Techniken Downstream-Analyse kompatibel sind, einschließlich der Massenspektrometrie, sind notwendig, um weiter diese Studien erweitern. Dennoch fehlt das Feld einen hohen Durchsatz, Weitbereichs, High-Recovery-Trennverfahren für native Protein Baugruppen. Hier präsentieren wir klare nativen geleluiert flüssige Fraktion Einklemmung Elektrophorese (CN-GELFrEE), das ist eine neue Trennmethode für nicht-kovalente Protein-Baugruppen. CN-GELFrEE Trennleistung wurde durch Fraktionierung Komplexe aus Mäuseherzen extrahiert demonstriert. Die Fraktionen wurden über 2 Stunden gesammelt und angezeigt im Bereich diskrete Banden von ~ 30 bis 500 kDa. A congängige Muster Molekulargewicht Bandbreiten der Erhöhung beobachtet, jeweils im Bereich ~ 100 kDa. Ferner zeigte anschließende Re-Analyse von nativen Fraktionen über SDS-PAGE Molekulargewicht mit der Denaturierung von Proteinkomplexen konsistent verschiebt. Daher wurde CN-GELFrEE erwies sich die Fähigkeit zur Durchführung hochauflösenden und hoch Recovery nativen Trennungen auf Proteinkomplexe aus einem großen Molekulargewichtsbereich zu bieten, Fraktionen bieten, die mit kompatibel sind Downstream-Protein analysiert.
Einleitung
Der Großteil der biologischen Prozesse innerhalb einer Zelle passiert sind gedacht , durch Proteinanordnungen statt 1 einzelne Proteine durchgeführt werden. Folglich, um die spezifische biologische Rolle einer Protein - Untereinheit in einer Zelle zu erläutern ist es notwendig , seine strukturelle Wechselwirkungen mit anderen Proteinen oder Liganden in den Komplexen 2 zu verstehen. Allerdings Proteine nativ zu studieren, die Aufrechterhaltung ihrer nicht-kovalente Wechselwirkungen und Aktivität, bleibt eine Herausforderung. Einer der Nachteile von nativem Protein Studien ist eine geeignete einheimische Trenntechnik, die mit verschiedenen Dow....
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Protokoll
Hinweis: Dieses Video - Protokoll basiert auf einer zugehörigen Veröffentlichung 9. Spezifische Reagenzien, Material und Ausrüstung notwendig, alle Schritte in diesem Protokoll beschriebenen Aufgaben werden in der Materialien aufgeführt. Die Rezepte und Informationen für die Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Gießen von Gradient Röhrchengele
- Montage des Gießsystem
- Mit einem flamm erhitzt Rasierklinge oder einem Skalpell, schneiden Sie ein 20 ml serologische Pipette entlang einer orthogonalen Abschnitt 10 cm von der Spitze der Abgabespitze. Stellen Sie....
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Ergebnisse
200 & mgr; g Proteine aus kryogen gemahlener Mäuseherzen extrahiert wurden jeweils mit dem CN-GELFrEE Verfahren in einem 1-12% T Gelrohr nativ in 14 Fraktionen von 150 & mgr; l fraktioniert. Eine aliquote Menge von 10 ul jeder Fraktion auf einer CN-PAGE Flachgel und mit Silber gefärbt wurde durchgeführt. Eine klare Darstellung der Fraktionierung und Auflösung erhalten mit CN-GELFrEE Fraktionierung ist in 2A gezeigt. Fraktionen wurden über zwei Stunden gesammelt.......
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Diskussion
CN-GELFrEE wird aus der klaren Mutter (CN) PAGE - Puffersystem abgeleitet , die eine Mischung aus anionischen und neutralen Reinigungsmitteln als Trägermoleküle 9 für molekulargewichtsabhängige Proteinfraktionierung durch eine Gelmatrix verwendet. Die Anwendung des CN-GELFrEE zu einer nativen Maus Herz Proteinextrakt erzeugt geringe Komplexität Fraktionen mit diskreten Bandbreiten unter Beibehaltung nicht-kovalente Wechselwirkungen von Biomolekülen Baugruppen. Vergleich der Fraktionen zwischen CN-PAGE und red.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die WM Keck-Stiftung großzügig Mittel für diese Arbeit. Dieses Material basiert auf der Arbeit von Grant FAPERJ Forschung unterstützt 100,039 / 2014 von der Regierung von Bundesstaat Rio de Janeiro - Brasilien für RDM, Wissenschaft ohne Grenzen Stipendium 88888,075416 / 2013-00 von der Koordination zur Verbesserung der Hochschulpersonal, unter der Regierung die National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Kameradschaft Nummer 2014171659 für OSS und durch CNPq Forschungsstipendium 202011 / 2012-7 von der Regierung von Brasilien für LHFDVPCH von Brasilien, für HSS, ist ein Empfänger einer der Northwestern University Chemie der Lebensprozesse Institut ....
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Materialien
Länge ca.
n-Butanol
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| 30%ige Acrylamid/bis-Lösung, 37,5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Diese Lösung ist neurotoxisch. |
| 6-Aminohexansäure (ε-Aminocapronsäure) | Sigma-Aldrich | A2504 | Diese Chemikalie ist reizend. |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Diese Chemikalie ist brennbar, giftig und ätzend. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltosid | Sigma-Aldrich | D4641 | Diese Chemikalie ist reizend. |
| Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) | FLUKA | 3777 | Diese Chemikalie ist giftig. |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | Diese Chemikalie ist giftig. |
| Glycerin | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Flüssiger Stickstoff | Jeder Lieferant | n/a | Lagerung von flüssigem Stickstoff in Behältern für Niedertemperatur- -Flüssigkeiten Mausherz |
| Bioreclamation LLC | -heart | ||
| Fisher Scientific | 71-36-3 | Diese Chemikalie ist brennbar und giftig. | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Proteasehemmer Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Diese Chemikalie ist giftig. |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | 30970 | Diese Chemikalie ist reizend. |
| Saccharose | JTBaker | 4097 | |
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Diese Chemikalie brennbar und reizend. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Equipment | |||
| Gradientenmischer | Hoefer | SG15 | |
| Magnetrührer | Alle Lieferanten | n/a | |
| Magnetstäbe | Alle Lieferanten | n/a | Klein genug, um in die gradiet Mischerkammern zu passen. |
| Stromversorgung | Bio-Rad | 164-5056 | Spannung bis 1.500 V |
| Kühlzentrifuge | Eppendorf | 022622552 | Bis zu 15.000 x g |
| Materials15 | |||
| ml konisches Rohr | beliebig | n/a | |
| 30 kDa-MWCO ultra Zentrifugalfilter | Millipore | UFC503096 | |
| Flexibler Schlauch | Saint-Gobain | B000FOV1J0 | 1 m |
| Eiskübel | Jeder Lieferant | n/a | |
| Ventil aus Flüssigkeit/Luft aus Metall oder Kunststoff. (z.B. Aquarium Luft/Wasser Durchfluss Hebel Ventil) | Jeder Lieferant | n/a | Aquarienventile sind kompatibel. |
| Mörser und Stößel | Jeder Lieferant | n/a | |
| Native PAGE 3-12% T Plattengel | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petrischale | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Protein Low Bind Tube 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Rasierklinge | IDL Tools | TE05-091C | |
| Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose 3.500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| SDS-PAGE Plattengel für alle kDa | Bio-Rad | 456-9036 | |
| Serologische Pipetten (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| Spritze (10 ml) | Alle Lieferanten | n/a |
Referenzen
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. <....
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Nachdrucke und Genehmigungen
