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Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

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DOI:

10.3791/53609

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7. Juli 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genethon, 2Cordeliers Research Center, INSERM U872, 3Matter and Complex Systems Laboratory, Université Paris Diderot, 4INSERM U951, 5UMR_S951, Université d'Evry Val d'Essonne

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Biolumineszenz-Bildgebung ist ein bekanntes Werkzeug für Tumoren und Metastasen zu lokalisieren, aber Quantifizierung dieser Bilder erfordert oft komplexe Berechnungen und bestimmte Instrumente. Wir beschreiben die einfach zu bedienende luminoscore-Methode, basierend auf genauen Aufnahmebedingungen, keine Berechnungen erfordern, und ermöglicht die Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung in Mausmodellen beobachtet werden.

Zusammenfassung

Obwohl die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) vielversprechend für die Überwachung der Tumorlast in Tiermodellen von Krebs ist, bleiben diese Analysen größtenteils qualitativ. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Biolumineszenz-Bildgebung, um eine semi-quantitative Analyse der Tumorlast und des Therapieansprechens zu erhalten. Diese Methode basiert auf der Berechnung eines Luminoscores, einem Wert, der den Vergleich von zwei Tieren aus demselben oder unterschiedlichen Versuchen ermöglicht. Aktuelle BLI-Instrumente ermöglichen die Berechnung dieses Luminoscores, die sich hauptsächlich auf die Aufnahmebedingungen (Rück- und Vorderseite) und die Zeichnung des interessierenden Region-of-Interest (manuelles Markup um die Maus herum) stützt. Anhand von zwei zuvor beschriebenen Maus-Lymphommodellen, die auf Zelltransplantation basieren, zeigen wir, dass die Luminoscore-Methode als nicht-invasive Methode dienen kann, um die erfolgreiche Inokulation von Tumorzellen zu verifizieren, die Tumorlast zu überwachen und die Auswirkungen einer in situ Krebsbehandlung (CpG-DNA) zu bewerten. Schließlich zeigen wir, dass diese Methode für verschiedene experimentelle Designs geeignet ist. Wir schlagen vor, diese Methode für frühe Abschätzungen des Therapieansprechens in präklinischen Kleintierstudien zu verwenden.

Einleitung

Frühe Tumorzelldetektion bleibt eine Herausforderung und ist von entscheidender Bedeutung für die Krebsbehandlung Wirksamkeit verbessert wird . In - vivo - Biolumineszenz - Bildgebung (BLI) ist eine sehr empfindliche, nicht - invasive optische Technik, die weithin für die Überwachung von Tumoren bei Kleintieren eingesetzt. Glühwürmchen - Luciferase-exprimierenden Zellen werden für solche Experimente 1,2 verwendet. Diese Oxygenase oxidiert D-Luciferin mit molekularem Sauerstoff erfordert jedoch zwei Cofaktoren - Mg 2+ und Adenosintriphosphat 3. Glühwürmchen - Luciferase ist besser geeignet für in - vivo - Bildgebung als Renilla - Luciferase 4 , weil seine Quantenausbeute höher ist .

Das oxidierte Substrat - Oxyluciferin - emittiert spontan ein Photon zu seiner fundamentalen Zustand zurückzukehren und dann inaktiv wird. Die emittierten Photonen haben eine maximale Wellenlänge um 530 nm. Eine hochempfindliche Kamera kann die Leuchtphotonen von der Innenseite eines kleinen Tieres erfassen und Bilder liefern, die es POSS machenIVK Tumorzellen zu lokalisieren.

Die Fähigkeit, Tumorlast genau durch Photonenzählungen dienen zur Quantifizierung der Wirksamkeit der Behandlung als leistungsfähiges und empfindliches Werkzeug könnte zu quantifizieren. Weil Behandlungseffekte früher erkannt werden, kann diese Empfindlichkeit machen es möglich, den genauen Zeitpunkt zu bestimmen, an dem eine Behandlung wirksam wird.

Absolute Quantifizierung der gesamten emittierten Photonen ist sehr komplex. Die Anzahl der Photonen hängt von der Tiefe des Tumors gesammelt und auf die Organe durch die Photonen emittiert werden. Korrekturkoeffizienten basierend auf Gewebeabsorptionskoeffizienten können 5, aber die absolute Quantifizierung der Tumorzellzahlen erfordert die Anzahl von Photonen , die von jeder Tumorzelle emittiert zu wissen , berechnet werden. Außerdem Luciferase - Expression, wie die von vielen Reportergene (z. B. fluoreszierende Proteine) nicht homogen ist , auch in einer Zellpopulation aus einem einzigen Klon abgeleitet 6. Die Zahl der Luciferase-Proteine ​​in Zellen kann nicht genau berechnet werden. Die Etablierung von standardisierten experimentellen Bedingungen scheint somit entscheidend für eine zuverlässige semi-quantitative Analyse.

Wir wendeten die luminoscore Methode auf zwei verschiedene Maus - Lymphom - Modelle 7.8.9. In diesen Modellen sind syngene Tumorzellen in das Auge injiziert oder unter die Haut zu erhalten, die jeweils eine primäre intraokulare Lymphom (PIOL) Modell und ein subkutanes Lymphom (SCL) Modell. In jedem dieser orthotope Modellen wird die Behandlung in situ verabreicht, sieben Tage nach der Tumor - Inokulation für PIOL und wenn der Tumor 0,5 bis 0,7 cm in ihrem größten Durchmesser für SCL erreicht hat.

Wir verwendeten die luminoscore Verfahren die Auswirkungen von in situ CpG - Therapie zu überwachen, vorher wirksamen 7,10,11 erwiesen. CpG ist eine Oligonukleotidsequenz und einem Liganden von TLR9, das wiederum ein intrazellulärer Rezeptor durch zahlreiche ce exprimiertenlls des Immunsystems, einschließlich dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten und natürlichen Killerzellen. CpG-DNA ist ein 20-mer-DNA-Sequenz, die das CpG (CG) immunstimulatorischen Motiv enthält; die Steuerung (ODN-Kontrolle) ist die gleiche 20-mer DNA-Sequenz, mit der Ausnahme, dass die immunstimulatorischen CG-Sequenz invertiert wird (GC). TLR9 Engagement im Maus - Lymphom wir studieren induziert Apoptose 10, aktiviert das Immunsystem 12 und reduziert dadurch deutlich Tumorbelastung 7,11.

Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur Quantifizierung von Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung durch Biolumineszenz Bilder. Dieses Verfahren beruht auf verschiedene Aspekte des Bildgebungsverfahrens, von der Erfassung bis zur Analyse, die Zuverlässigkeit zu optimieren, Reproduzierbarkeit, nicht-Benutzerabhängigkeit, und die statistische Signifikanz. Ein Biolumineszenz-Quantifizierungsindex wird jeder Maus zurückgeführt; nicht nur zwischen den Tieren, sondern al kann dieser Wert, der wir eine luminoscore nennen, verglichen werdenso zwischen den Experimenten.

In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Biolumineszenz-Bildgebung Verfahren sowie die Bild Quantifizierung durch die luminoscore Methode. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Methode für die Injektions Verifizieren, Überwachung der Tumorbelastung, und die Beurteilung der Wirksamkeit von in situ Behandlung von Krebs. Jeder dieser Punkte wird in repräsentative Ergebnisse aus Experimenten dargestellt mit verschiedenen Mausmodellen die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode zu markieren.

Protokoll

Alle Verfahren Mäuse denen mit EU-Richtlinien erfüllt, Französisch Vorschriften für Tierversuche (Ministerium für Landwirtschaft Gesetz Nr 2001-464, Mai 2001) und den Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Ausschuss für Tierforschung und wurden von der zuständigen lokalen Kommission gebilligt (die Charles Darwin Ethikkommission für Tierversuche, Paris, Frankreich; Zulassungsnummer: p3 / 2009/004).

1. Zellpräparation

  1. Wachsen Maus-B-Lymphom-Zellinie A20.IIA-luc2 in RPMI-1640-Glutamax-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM Natriumpyruvat, 50 & mgr; M 2-Mercaptoethanol und 0,50 mg / ml Hygromycin B.
  2. Pflegen Zellkultur bei 37 ° C, 5% CO 2 und ändern Medium alle zwei bis drei Tage. Ernte 5 ml der Zellsuspension mit einer Pipette einen Tag nach dem Wechsel des Mediums.
  3. Spin-Zellen bei 3005; g für 10 min, und die Zellen in 3 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um die Zellen zu waschen.
  4. Mischen Sie 15 ul Zellsuspension mit 30 ul Trypanblau Markierung vor einer Malassez Zählkammer geladen werden. Berechne die Zellkonzentration mit der Formel: Konzentration (Zellen / ml) = Anzahl der Zellen in der Zählung grid * 3 * 1000.
  5. Drehen Sie die Zellen ein weiteres Mal bei 300 g für 10 min. Entfernen Überstand mit einer Pipette. Mit der C-Konzentration in dem Schritt berechnet 1.4), ist die Anzahl der Zellen N = C * 3.
  6. Berechne das Volumen steriler PBS 1x erforderlich , um Zellsuspension A bei einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml mit der folgenden Formel erhalten: PBS - Volumen (ml) = N / (5 x 10 7). Suspendiere das Zellpellet (aus Schritt 1.5)) in dem Volumen steriler PBS 1x im vorhergehenden Satz berechnet. Die Zellsuspension A ist in der SCL - Modell verwendet werden (in vivo injizierte Volumen beträgt 100 & mgr; l: 5 x 10 6 Zellens).
  7. Pipette 10 ul Suspension einer Zelle und fügen 90 ul sterilem PBS in einem 1,5 - ml - Röhrchen 100 & mgr; l der Zellsuspension B zu erhalten , auf 5 x 10 6 Zellen pro ml. Die Zellsuspension B ist in pIOL Modell verwendet werden (in vivo injizierte Volumen beträgt 2 & mgr; l: 1 x 10 4 Zellen).

2. Luciferin

  1. Verdünnen Sie 1 g D-Luciferin-Kaliumsalz-Pulver in 30 ml sterilem PBS 1x in einem 50-ml-Röhrchen und schütteln für ein paar Sekunden, um die Aggregate aufzulösen.
    Hinweis: Da Luciferin lichtempfindlich ist, bereiten 500 ul Aliquots in dunkel 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C.
    HINWEIS: Die Aliquots können mehrere Monate gelagert werden.
    Nach dem Auftauen sind die Aliquots nicht länger als 1 Tag bei + 4 ° C gelagert werden. Gefrier-Tau-Zyklen sind vorzuziehen Lagerung bei 4 ° C.
  3. Injizieren von 100 & mgr; l D-Luciferin-Kaliumsalzlösung intraperitoneal für jede Abbildungs ​​ASSAy.
    ANMERKUNG: Diese Lösung entspricht 3,3 mg pro Maus für eine Dosis von 150 mg / kg.

3. Anästhetikagemischs und Betäubung

  1. Bereiten Sie eine Anästhesielösung durch Mischen von Ketamin 120 mg / kg und Xylazin 6 mg / kg in steriler PBS 1x.
  2. Injizieren 60 ul Anästhetikagemischs intraperitoneal für jeden Abbildungs ​​Test mit einer 25 G-Nadel. Für Chirurgie (mit pIOL oder SCL-Modell), injizieren 80 ul der Mischung eine tiefere Anästhesie zu erhalten. Setzen Sie die Maus zurück in seinen Käfig.
  3. Wenn die Maus unbeweglich erscheint, entfernen Sie sie aus dem Käfig und sanft die Maus des Beines zwischen den Fingern zusammendrücken. Wenn die Maus mit einem Escape-Reflex reagiert, warten Sie einige Minuten. Wiederholen Sie die Aktion, bis die Maus nicht reagiert, die eine zufriedenstellende anesthetization bestätigt.
  4. Platzieren Sie die Maus auf einer Wärmeplatte oder unter einem wärmenden Licht.
  5. Bewerben Augensalbe Augentrockenheit während anesthetization für die Bildgebung Assay oder für SCL Operation zu vermeiden. Tragen Sie dieAugensalbe nach der Operation für pIOL Modell.

4. Chirurgie und Zellinokulation

HINWEIS: Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe auf einer Wärmeplatte oder unter einem wärmenden Licht in einem Typ-1-MSW in einem Tierbiosicherheitsstufe 2 Möglichkeiten. Alle chirurgischen Werkzeuge in diesem Abschnitt verwendet wurden vor der Verwendung autoklaviert.

  1. Subkutan Lymphom Modell:
    1. Herstellung von 100 ul der Zellsuspension in Schritt erhaltenen 1,6 in einer 1-ml-Spritze mit einer 25 G Nadel. Drücken Sie vorsichtig die Haut von Mäusen auf der Flanke zwischen den Fingern, an der Injektionsstelle. Führen Sie die Nadel genau in die Hautfalte. Um eine subkutane Injektion zu gewährleisten, muss die Nadel nicht tief in das Gewebe.
      1. Injizieren der Zellen in den skinfold. Beobachten Sie, ob ein wenig Flüssigkeit Ball unter der Haut erscheinen, um zu bestätigen, dass die Injektion korrekt durchgeführt wurde.
  2. PIOL Modell:
    HINWEIS: Diese procedure erfordert 2 Betreiber, bezeichnet hier als Operator 1 und Operator 2.
    1. Die Entfernung von Binde:
      1. Haben Operator 1 Platzieren Sie die Maus unter einem Binokular. Drücken Sie vorsichtig mit den Fingern an jeder Seite des Auges, es zu löschen. Halten Sie diese Position.
      2. Haben Operator 2 l ook durch das Binokular. Fassen Sie die Bindehaut mit einer kleinen Zange in der Hand; mit der anderen Hand, schneiden Sie die Bindehaut knapp unterhalb der Zange mit einem kleinen chirurgische Schere.
      3. Haben Operator 1 Release das Auge der Maus in Schritt 4.2.1.1 gedrückt)
    2. Zellinjektion:
      1. Bereiten Sie eine 10-ul stumpfe Präzisionsspritze. Waschen Sie es mit sterilem entionisiertem Wasser durch sie gepumpt wird. Zweimal wiederholen oder dreimal um sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen in der Spritze. Dann bereiten 2 ul Zellsuspension zur Injektion.
      2. Haben Operator 2 drücken Sie vorsichtig mit den Fingern aufe Hand auf jeder Seite des Auges um es zu löschen. Halten Sie diese Position.
      3. Haben Sie Operator 1 greifen den Rand des Auges mit einer kleinen Zange in einer Hand und ziehen Sie sie vorsichtig nach hinten um das Gewebe zu dehnen.
      4. Haben Operator 2 l ook durch das Binokular. Mit der anderen Hand, machen ein kleines Loch in der unteren Augapfel der Maus mit einer 32 G-Nadel.
      5. Haben Operator 2 die Nadel setzen nach unten und holen (mit der gleichen Hand) , um die Präzision Spritze und führen Sie die Nadel in das Loch in dem Schritt 4.2.2.4 gemacht.
      6. Haben Operator 1 Druck auf den Spritzenkolben mit der anderen Hand.
      7. Haben Operator 2 v erify mit dem Binokular , die die Zellsuspension in der Spritze in den Augapfel richtig injiziert wurde (der Flüssigkeitsstrom ist leicht zu beobachten).
      8. Haben Operator 2 r emove die Präzisionsspritze.
      9. Haben Operator 1 r den Rand des ein Eleaseimal Auge gegriffen in Schritt 4.2.2.3)
      10. Haben Operator 2 r elease die Seiten des Auges bei Schritt gedrückt 4.2.2.2)
      11. Tragen Sie die Augensalbe sofort.
        HINWEIS: Wenn alle Schritte korrekt durchgeführt wurden, sollte die Maus überhaupt nicht während dieses Vorgangs entlüften.

5. Biolumineszenz-Bildgebung - Tag 0

HINWEIS: Alle Produkte in die Maus injiziert muss vor der Injektion bei RT sein. Nach der Tumorzellen inokuliert wurden, und während das Tier noch anästhesiert wird, um diese Schritte für die Bildgebung stattfindet.

  1. Schalten Sie den Scanner und öffnen Sie die Erfassungssoftware. Initialisieren Sie die Kamera, die Stadien und die Linsen, indem Sie auf die Schaltfläche "Initialisieren" klicken. Die Initialisierung wird 10 bis 15 Minuten dauern Vollständigkeit.
  2. Inject 100 ul D-Luciferin Kaliumsalzlösung intraperitoneal mit einer 25 G - Nadel. intravenös verabreichen Sie es nicht. Wenn intravenous Verwaltung aus irgendeinem Grund erforderlich, die D-Luciferin Natriumsalz muss statt D-Luciferin Kaliumsalz verwendet werden.
    HINWEIS: Luciferin das überschüssige Reaktanden bei dieser Konzentration ist; daher das Biolumineszenz-Signal ein Plateau erreicht nach 3 bis 7 min und bleibt für mehr als 30 min.
  3. 10 Minuten nach der D-Luciferin Injektion 13, platzieren Sie das Motiv Maus in den Scanner. Platzieren Sie die Maus in seiner natürlichen Position, den Rücken in Richtung der Kamera, in so einer Position flach wie möglich. Diese Position ist natürlich und leicht reproduzierbar.
  4. Kreuzen Sie die Belichtungsautomatik - Funktion, und klicken Sie auf Acquire die Rückseite (posterior) Bild des Tieres zu erwerben, mit der automatischen Belichtungsfunktion.
    HINWEIS: Die Auto-Belichtung Funktion optimiert Belichtungszeit, indem sie es von einem 1-sec Belichtungsbild zu berechnen. Wenn die Biolumineszenzsignal Maus negativ oder sehr gering ist, kann die optimale Belichtungszeit könnteautomatisch auf mehr als 20 min. In diesem Fall kann eine Belichtungszeit von 8 bis 10 min ein guter Kompromiss. Die Belichtungszeit kann manuell eingestellt werden, jedoch müssen die Bilder nicht gesättigten Pixel enthalten.
  5. Drehen Sie die Maus über die Vorderseite der Maus , um die Kamera zu belichten. Versuchen Sie, die Maus zu glätten und breitete seine vorderen Gliedmaßen, so dass sie nicht über die Brust zu blockieren.
  6. Erwerben Sie ein Frontbild des Tieres. Stellen Sie sicher, dass die automatische Belichtungskontrollkästchen ist immer noch wieder aktiviert und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen".
    HINWEIS: Das vordere Bild kann vor dem Rück Bild und umgekehrt erworben werden. Die Belichtungszeit der Vorder- und Rückseitenbild kann in Abhängigkeit von der relativen Intensität jeder Seite der Maus unterschiedlich sein. Es wird automatisch berechnet, wenn die Belichtungsautomatik-Funktion. Quantifizierung verwendet nur den Photonenfluss (Photonen pro Sekunde) und hängt nicht von der Belichtungszeit.
  7. Platzieren Sie die Maus auf eine wärmende plate oder unter einem wärmenden Licht, bis er aus der Narkose erholt und es dann in seinem Käfig Platz zurück.

6. Biolumineszenz-Bildgebung - Nach dem Tag 0

  1. Schalten Sie den Imager, initialisieren Sie die Kamera, die Stufen und die Linsen, wie in Schritt 5.1).
  2. Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 60 ul der Ketamin (120 mg / kg) / Xylazin (6 mg / kg) Gemisch (siehe Schritte 3.1 bis 3.5).
    Hinweis: Diese Methode von anesthetization ermöglicht die Abbildung alle 5 Tage. Zur Durchführung tägliche Bildgebung, eine Methode, die Isofluran als das Anästhetikum und ein Biolumineszenz-Imager für erforderlich ist, mit dieser Betäubung Einsatz verwendet.
  3. Erwerben Sie Vorder- und Rückseite Bilder des Tieres, mit der Belichtungsautomatik - Funktion, wie in den Schritten 5.5) und 5.6). Gehen Sie mit der Maus, wie in Schritt 5.7).

7. Biolumineszenz Quantifizierung und Bildanalyse

HINWEIS: Die luminoscore Methode basiert auf Bild analysis. Sobald die Bilder wurden nach den obigen Schritten erworben wurde, kann die Quantifizierung zu jeder Zeit durchgeführt werden (einschließlich der unmittelbar nach der Übernahme), eine luminoscore jeder Maus zu jedem Zeitpunkt zu assoziieren.

  1. Rufen Sie das "Tool-Palette", indem Sie auf das Menü "Ansicht" klicken und dann auf "Tool-Palette", wenn nicht bereits angezeigt wird. Klicken Sie auf das "ROI Tool" Register der Tool-Palette. Wählen Sie die "Kontur" Taste und wählen Sie dann "Free Draw".
  2. Manuell markieren die Region of Interest (ROI) um die Maus durch die Kanten auf der Vorderansicht der Maus folgen. Schließen Sie die Kontur mit einem Rechtsklick auf die Computer-Maus.
  3. Klicken Sie auf das Menü "Ansicht" und dann "ROI-Messungen". Stellen Sie sicher, "Radiance (Photons)" ist in den "Messtypen" Scrolling-Menü auf der linken unteren Ecke des "ROI-Messungen" Fenster ausgewählt. Wenn nicht, wählen Sie es aus. Dann messen die Photonen flux (ph / s) durch Aufzeichnen der Wert in der "Total Flux [p / s]" -Box.
    HINWEIS: Verwenden Sie Radiance oder andere Gerät nicht, die der ROI-Oberfläche ist relativ.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2) und 7.3) für die Rückansicht.
  5. Addieren Sie die beiden Flusswerte Photon von Vorder- und Rückansicht erhalten. Das Ergebnis ist die luminoscore.
  6. Vergleichen Sie die Werte für jede Gruppe eine entsprechende Statistik - Test (nicht-parametrischer zweiseitigen Mann-Whitney - Test, zum Beispiel) 14.

Ergebnisse

Die Luminoscore Methode kann die Injektion der Tumorzellen Überprüfen Serve

Bei Modellen, die Injektion von einer kleinen Zahl von Tumorzellen, oder wenn die Injektionsstelle nicht zulässt visuelle Überprüfung der Injektions beteiligt, kann es sehr schwierig sein, die Qualität der Einspritzung sicherzustellen. Die luminoscore Methode dient als schnelles und bequemes Werkzeug, um die Qualität des Verfahrens zu überprüfen und festzustellen, leicht und schnell, dass alles funktioniert hat. In beiden Modellen ist der Tumor nachweisbar bereits 10 min nach der Injektion (1A). Die Bilder allein ausreichen, dass Tumorzellen in der richtigen Stelle vorhanden sind, zu überprüfen. eine Vorstellung von der Heterogenität der Injektions Dennoch bietet die Bilder zu quantifizieren. Das Punkt - Diagramm (Abbildung 1B) zeigt deutlich einen Unterschied zwischen Tieren , die (schwarze Punkte) erhalten und nicht wiederCEIVE (rote Linie) Injektionen. Interessanterweise ist das Signal in der SCL-Modell erhaltenen 100-mal höher als in der PIOL Modell; Dieser Befund ist mit der Anzahl der Zellen injiziert (5 x 10 6 und 1 × 10 4 Zellen) konsistent.

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Abbildung 1. Überprüfung der Injektion in verschiedenen Maus - Lymphom - Modelle. Die luminoscores gemessen 10 min nach der Tumorzellinokulation in verschiedenen Lymphom - Modelle. (A) Repräsentative Bilder der beiden Modelle. (B) Luminoscore jedes Tier in den verschiedenen Modellen. Die rote Linie entspricht der mittleren Hintergrundrauschen gemessen an 10 Tieren vor Tumorzellinokulation; die gepunkteten Linien sind der Mittelwert +/- Standardabweichung. Für jedes Modell werden alle Tiere können vom Hintergrundrauschen unterschieden werden. Im PIOL Modell, 1 x 10 4 Zellen waren INOClierten in den Glaskörper des rechten Auges und in der SCL - Modell, 5 x 10 6 Zellen subkutan in jede Flanke der Maus. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Überwachung der Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung

Die luminoscore ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug für das Tumorwachstum und die Wirksamkeit der Behandlung zu studieren. 2A zeigt repräsentative Bilder der Überwachung von Tumorwachstum in der Kontrolle und der behandelten CpG PIOL Gruppen. Die Mäuse wurden mit 1 x 10 4 Tumorzellen inokuliert , jeweils, und die Behandlung wurde in situ an Tag 7. Die Bilder zeigen , dass verabreicht , nachdem eine ausreichende Zeit (28 Tage), Metastasen in der Kontrollgruppe zu erscheinen begann. Obwohl der primäre Tumor auf die Behandlung nicht empfindlich erscheinen, wenigerMetastasen wurden in der CpG-behandelten Gruppe (Tabelle 1) beobachtet. Die quantitative Analyse der Tumorlast in jeder Gruppe (2B) zeigt , dass CpG Tumorentwicklung verlangsamt, einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der behandelten Herstellung und der Kontrollgruppe nach 28 Tagen (nicht-parametrischer two-tailed Mann-Whitney - Test p = 0,0079 ). Dennoch wuchsen die Tumoren noch in den behandelten Mäusen, und keiner von ihnen überlebten (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten: CpG hat keine signifikanten Auswirkungen auf die primäre Augentumoren 10. Der wesentliche Effekt, den wir hier zwischen dem ODN und dem CpG-Gruppe haben kommt von der Metastasierung Wachstumshemmung.

figure-results-2
Abbildung 2. Überwachung der Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung. (A) Repräsentative Bilder der beiden Gruppen (ODN-Steuerung und CpG-behandelt) of PIOL tragenden Mäusen. (B) Die Überwachung der Tumorlast mit dem luminoscore. Wie auf dem Punktdiagramm zu sehen ist, signifikant die Wirkung von CpG auf der luminoscore am Tag 28. In diesen beiden Gruppen gemacht dieses Verfahren es möglich, Tumorlast zu überwachen und die leichte, aber signifikante (p = 0,0079) Wirkungen von CpG zu messen DNA, die durch Bilder nicht allein erkennen konnte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gruppen Maus Das Vorhandensein von Metastasen Ort Photonenfluss (ph / s)
CpG 1 Nein X X
2 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten 9.32E + 05
3 Nein X X
4 Nein X X
5 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten 2.21E + 07
ODN 1 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten 1.06E + 07
2 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten 7.25E + 07
3 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen 7.64E + 08
4 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen 1.74E + 09
5 ja Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen 9.76E + 07

Tabelle 1 Ter Luminoscore Verfahren kann auf verschiedene Ansätze angepasst werden

Die luminoscore Verfahren ist nicht auf eine einzige Art von Mausmodell beschränkt. 3 zeigt , dass es an verschiedene Mausmodelle angepasst werden. In der SCL-Modell werden zwei Tumoren auf jeder Seite der Maus transplantiert. Die Behandlung wird in situ auf einer einzigen Seite an Tag 0 und die kontralaterale Tumors dient als Kontrolle (3A) verabreicht. Daher wurden zwei ROI pro Maus gezogen: eine für jede Seite (3C). Das Verhältnis zwischen der luminoscore auf den behandelten und Kontrollseiten beschreibt die relative Verlauf jedes Tumors. Dieses Verhältnis wurde auf 1 gesetzt, am Tag 0, wenn die Behandlung verabreicht wurde. Wir beobachteten eine signifikante Abnahme in diesem Verhältnis 13 Tage nach der Behandlung Verwaltung (3D; nichtparametrischer zweiseitigen Mann-Whitney - Test p = 0,004). Dieser Rückgang zeigt, dass die behandelte seitige Tumorwurde als auf den repräsentativen Biolumineszenz Bilder (3B) gezeigt resorbiert.

figure-results-3
Abbildung 3. Die Anpassung der Luminoscore Methode zu einem Modell mit zwei primären Tumorstellen. (A) Experimentelle Gestaltung eines SCL - Test. Die Mäuse wurden mit zwei primären Tumoren in jede Flanke injiziert. Einer Seite eingespritzt wird entweder mit CpG-DNA oder ODN-Steuerung, und die andere Seite mit PBS als Kontrolle zu dienen. (B) Repräsentative Bilder von CpG-behandelten und Kontrollmäusen am Tag 0 und Tag 13. Die Behandlung wurde verabreicht am ersten Tag wurde 0. Das Tumorwachstum auf dem CpG-behandelte Seite der Maus gesperrt. (C) Das markiert manuell Regionen von Interesse pro Tier für zwei primäre Tumorstellen. (D) Das Verhältnis zwischen den luminoscores des CpG-behandelt oder ODN-Steuerseite und die Steuerseite PBS ist ein Index,spiegelt die relative Wachstum jedes Tumors innerhalb des gleichen Tieres. Dieses Verhältnis gesetzt wurde auf 1 am Tag 0. Am Tag 13, das Verhältnis der CpG-behandelten Gruppe signifikant gesunken war (p 0,004 =), durch die Verabreichung von CpG-DNA in situ Hemmung des Tumorwachstums enthüllt. Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Die Lichtabsorption von Organen und Geweben bleibt eine Einschränkung der Biolumineszenz-Bildgebung, obwohl diese Einschränkung auf jede optische Bildgebungsverfahren zu eigen ist. Im Rahmen unseres Ansatzes, die Auswirkungen der anatomischen Strukturen auf der luminoscore erwartet geringe Variabilität haben vorgesehen, dass die Studien in einem bestimmten Modell durchgeführt werden (Standort-und-Maus-Strang), so dass dann Vergleiche. Biolumineszenz nicht Anregungslicht benötigen und somit mehr in - vivo - Bildgebung als Fluoreszenz ganzen Körper angepasst.

Die räumliche Auflösung ist auch eine Begrenzung der Biolumineszenz-Bildgebung und genaue Lage des Organs, von dem Biolumineszenz-Photonen emittiert werden, bleibt schwierig. gute Kenntnisse des Modells kann jedoch in der qualitativen Lage der Tumorstellen helfen. Der einzige Ausgang in diesem Biolumineszenz basierende Methode ist die luminoscore. Standort beeinflusst nicht die luminoscore weil die manuelle Aufschlags Region Interest (ROI) deckt die gesamte Maus. Schließlich erfordert Glühwürmchen-Luciferase Sauerstoff. Dementsprechend Biolumineszenz-Bildgebung in der Regel unterschätzt nekrotischen Tumoren. Wiederum eine gute Kenntnis dieser Aspekt des Modells erforderlich ist.

In diesem Papier wollen wir nicht auf die Wirksamkeit von CpG als Anti-Tumor - Medikament Beurteilung (die bereits 7,9,11 nachgewiesen wurde) , aber ein Verfahren , wodurch ein Vergleich der Biolumineszenz Datensätze zu beschreiben. Wir beschreiben in der Tat eine Methode Tumorlast zu quantifizieren helfen soll, für den Vergleich verschiedener Tests an verschiedenen Orten zu unterschiedlichen Zeiten die Akquisitionsprotokoll standardisieren und erfordert keine Computerberechnungen. Um Reproduzierbarkeit und korrekte Photonenfluss Quantifizierung zu gewährleisten, muss die Abbildungsvorrichtung mit einer Licht Referenz für hausgemachte Geräte kalibriert werden oder wie vom Anbieter für kommerzielle Geräte empfohlen.

Unser Protokoll erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf mehrere kritische punkte: (i) Erstens ist die Qualität der Maus Anästhesie entscheidend klare Bilder zu erhalten, insbesondere in Fällen, bei langen Belichtungszeiten. (Ii) Die Quantifizierung Einheit muss immer sein, der Photonenfluss, weil Glanz auf der Oberfläche jeder Maus hängt und könnte für den Vergleich verschiedener Mäuse irrelevant. (Iii) Die Biolumineszenz Bilder müssen nicht gesättigte Pixel enthalten, da diese würde Bias die luminoscore. (iv) Vorder- und Rückseite Erwerb sind verpflichtet , alle Photonen , die von der Tumorstelle emittiert wird, zu sammeln (dh kann vordere Erwerb nicht unbedingt erkennen Photonen von der Rückseite des Tumors). Verschiedene ROI Zeichnungen wurden während der Entwicklung des luminoscore Methode getestet. Nur die manuelle mark-up ergab zufriedenstellende Ergebnisse, die wahrscheinlicher sind statistisch signifikant (Daten nicht gezeigt).

Inoue et al. empfehlen kg eine Luciferin Dosis von 75 mg / 13. Durch die Verwendung einer Dosis von 150 mg / kg statt, den Zeitpunkt der Bildgebung nach demLuciferin Verwaltung bleibt unverändert und wir stellen sicher, dass das Plateau während einer langen Belichtungs Erwerb dauert. Luciferin muss das überschüssige Reaktanden während des Akquisitionsprozesses sein. Je nach Modell kann die Region von Interesse angepasst werden, wie wir in der SCL - Modell zeigte , wo wir zwei ROI pro Tier zog. Im SCL - Modell, die Behandlung injiziert wird , wenn der Tumor 0,5 cm im größten Durchmesser erreicht Variabilität zu begrenzen von Verpflanzung. In Abhängigkeit von den Mäusen, könnte der Tumor unterschiedlich gewachsen. Zur Standardisierung und vergleichen Mäuse, haben wir beschlossen, ein Verhältnis zwischen behandelten und nicht behandelten Seite zu verwenden, um das relative Wachstum beider Flanken Tumoren aufdeckt.

Wenn kein Signal von einer injizierten Maus beobachtet wird erwartet, positiv zu sein, entweder (i) die Anzahl der Zellen ist sehr gering, und das Signal unter der Erfassungsschwelle liegt; oder (ii) fehlt der Maus Sauerstoff und erfordert eine sofortige Versorgung.

Mehrere der quantitative bioluminescrenz Analysen von verschiedenen Autoren erfordern komplexe Berechnungen und Instrumente (zB 3D - Biolumineszenz - Tomographie) zu nähern , die absolute Quantifizierung der emittierten Photonen Biolumineszenz 5,15 beschrieben. Es gibt keinen Konsens über ein Verfahren zur Biolumineszenz reproduzierbar zu quantifizieren, insbesondere in Tumormodellen, mit einem 2D-Imager Biolumineszenz. Unser Ziel war es, die Bildaufnahme-Protokoll zu begrenzen Benutzer-Abhängigkeit zu standardisieren.

Die Injektion von CpG in situ nach der Tumor - Inokulation der Tumorlast in beiden Modellen verringert. Die luminoscore Methode kann als Werkzeug dienen, um die Tumorlast in anderen Modellen von Tumor Immuntherapien überwachen. Tumorlast Überwachung stellt eine nicht-invasive Methode, die unser Verständnis von Tumorwachstum und Metastasierung Mechanismen, ohne sich mit der Tumor-Mikroumgebung zu verbessern. Die Identifizierung der Tiere, die tun und reagieren nicht mit dieser Methode auf die Behandlung wird durch die Überprüfung der s verstärktUccessful Tumorzellinjektion zu Beginn des Experiments.

Wir zeigten hier die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode in einem SCL Modell A20.IIA-luc2 Zellen. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Tumormodell unter Verwendung von anderen Zelllinien angepasst werden , vorausgesetzt , daß sie die Luciferase oder im Zusammenhang mit T-Zell - Studien (tumorspezifische zytotoxische T-Zellen, regulatorischer T-Zellen, etc.) exprimieren. Die Überwachung von in vivo - Gentransfer im Zusammenhang mit der Gentherapie von seltenen Krankheiten auch die luminoscore Methode durchgeführt werden konnte.

Schließlich zeigen die Daten, dass die Biolumineszenz-basierte luminoscore Verfahren Vergleiche zwischen Experiment ermöglicht, bietet Flexibilität und Anpassungsfähigkeit an spezifische experimentellen Anforderungen und ist ein nützliches Werkzeug für die nichtinvasive Längs präklinischen Studien.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Tiereinrichtungen des Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankreich), Genethon (Evry, Frankreich) und Genopole (CERFE, Evry, Frankreich). Wir danken Jo Ann Cahn für ihre sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung wurde vom Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Universität Paris Descartes, Pierre & Marie Curie-Universität, der Vereinigung pour la Recherche contre le Cancer unterstützt, die tunesische Direction Générale de la Recherche Scientifique, die französisch-tunesische CMCU Projekt und die Aktionen Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) Fonds. JC wurde von den Grenzen in der Life-Science-Doktorandenschule und durch ein Stipendium vom INCA (Institut National du Cancer) unterstützt. RBA war ein Empfänger von Zuschüssen aus dem DGRS-INSERM und dem CMCU. SD erhielt einen Zuschuss aus dem Institut National du Cancer.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CpG 1826InvivogenSequenz: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT
Katalognummer: tlrl-1826
ODN 1826 controlInvivogenSequenz: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT
Katalognummer: tlrl-1826c
D-Luciferin KaliumsalzInterchimKatalognummer: FP-M1224D
KetaminVirbac, Frankreich
XylazinBayer HealthcareRompun 2%
A20. IIA-luc2-ZelllinieA20. IIA transfiziert mit pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7
(Promega E1310)
MäuseBalb/cByjSechs Wochen alte Weibchen aus Charles River
IVIS lumina Biolumienscence ImagerPerkin Elmer
Living Image SoftwarePerkin ElmerWird zur Messung des Photonenflusses auf Bildern und zum Zeichnen von ROIs
R-Software (opensource)R-ProjektWird für statistische Tests
Hamilton Precision Serynge 10 & micro; l HamiltonArtikelnummer 7642-01100
AugensalbeLacrinorm
PräpariermikroskopZEISSStemi 305
verwendet verwendet

Referenzen

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Schlagwörter

Biolumineszenz ImagingLuminoscore MethodeD Luciferin InjektionRegion of Interest Analyseberwachung der TumorlastBewertung des TherapieansprechensCpG DNA Therapiepr klinisches Kleintiermodell

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