Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der Enterococcus spp. Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Summary

Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.

Abstract

Dieses Manuskript beschreibt eine Duplex - Digital - PCR - Assays (EntHF183 dPCR) für die simultane Quantifizierung von Enterococcus spp. Und dem menschlichen HF183 Marker fäkal-assoziiert. Die EntHF183 Duplex dPCR (bezeichnet als EntHF183 dPCR hereon) Test verwendet die gleichen Primer und Sonden-Sequenzen wie die veröffentlichten Einzel quantitative PCR (qPCR) Pendants. Ebenso wie die gleichen Wasserfiltration und DNA-Extraktionsverfahren vor der qPCR durchgeführt werden, bevor anschließend dPCR zu laufen. Jedoch hat der duplex dPCR Assay mehrere Vorteile gegenüber den qPCR-Assays. Am wichtigsten ist, beseitigt die dPCR Assay die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt wird und somit die zugeordnete Bias und Variabilität, durch direkte Quantifizierung ihrer Ziele. Darüber hinaus, während Duplexing (dh simultane Quantifizierung) Enterococcus und HF183 in qPCR führt oft zu schweren Unterschätzung der weniger reichlich Ziel in einer Probe stellt dPCR konsistente Quantifizierung beider Ziele, wetzensie einzeln oder gleichzeitig in dem gleichen Reaktions quantifiziert. Der dPCR Assay ist auch in der Lage PCR Inhibitorkonzentrationen zu tolerieren, 1.59 Grßenordnungen höher sind als diejenigen, die durch qPCR toleriert. Diese Vorteile machen die EntHF183 dPCR Test besonders attraktiv, weil es bietet gleichzeitig präzise und wiederholbare Informationen über allgemeine und Mensch-assoziierte fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässern ohne die Notwendigkeit zwei getrennte qPCR-Assays auszuführen. Trotz seiner Vorteile gegenüber qPCR, wobei der obere Bestimmungsgrenze des dPCR Assay mit derzeit verfügbaren Instrumentierung ist ungefähr vier Größenordnungen niedriger als die erzielbaren qPCR. Folglich wird Verdünnung für die Messung hoher Konzentrationen von Zielorganismen erforderlich, wie sie typischerweise folgende Abwasser Verschüttungen beobachtet.

Introduction

Quantitative PCR (qPCR) Verfahren wurden für die Freizeit-Überwachung der Wasserqualität und mikrobiellen Quelle Tracking-Anwendungen weit verbreitet, weil sie schneller sind, flexibler und spezifischer im Vergleich zu traditionellen Kultur-basierten Methoden. Folglich wird qPCR für die Erzielung eines raschen Wasserüberwachungsergebnisse für die allgemeine fäkale Indikatoren wie Enterococcus spp empfohlen. In den überarbeiteten USEPA Erholungswasserqualitätskriterien ^1. Viele qPCR - Assays wurden auch zur Identifizierung von Quellen von fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässer ² entwickelt und validiert. Unter diesen sind die HF183 M....

Protocol

1. Assay-Mischung Vorbereitung

1. Machen Sie 100 & mgr; mol / L Lager Konzentrationen für alle Primer in UPW Wasser und Sonden in TE pH 8 - Puffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Hinweis: Die Sonden für die beiden Ziele sind fluoreszierend mit unterschiedlichen Fluorophore ⁷ , wie in Liste der Materialien / Ausrüstung bezeichnet.
2. Bereiten Sie Master-Mix durch Mischen, pro Reaktion geplant, 12 ul digitale PCR-Mix (2x Lager, siehe Liste der Materialien / Geräte), 0,216 ul jeder Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 0,06 & mgr; l jeder Fluoreszenzsonde und 5,016 ul Nuclease freies Was....

Results

Eine gute EntHF183 duplex dPCR Lauf in relativ hohe Anzahl von akzeptierten Tröpfchen (ca. 10,000-17,000) und relativ große Differenz (ca. 5000) zwischen Fluoreszenzwerte für negative und positive Tröpfchen ⁷ führen. Ungewöhnlich niedrige Anzahl von Tröpfchen gibt wahrscheinlich Probleme in der Tröpfchenerzeugungsprozess und einen Cutoff von 10.000 Tröpfchen basiert auf empirischen Daten aus dem Tröpfchen dPCR System in diesem Artikel verwendeten vorgeschlage.......

Discussion

Es gibt einige wichtige Schritte in dem Protokoll. Erstens kann der Testgemische Mischen schwierig sein, da der Master-Mix mehr viskos ist als herkömmliche qPCR Master Mixes. Einfache Vortexen kann zu einer unzureichenden Durchmischung führen, was wiederum zu einer ungleichmäßigen Verteilung von DNA-Matrizen in den Testgemischen und anschließend in den Tröpfchen. Die Misch-by-Pipettiertechnik in dem beschriebenen Protokoll müssen befolgt werden, um genaue dPCR Quantifizierung zu gewährleisten. Zweitens ist es wichtig, T.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Mikroröhrchen	Costar	3207	Für die Lagerung von Reagenzien, Proben/Herstellung von Mastermixen
Nukleasefreies Wasser	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 Puffer	FisherSci	BP2473-100
Hartschale 96 Well Platte	BioRad	HSP-9601	Für den ersten Mastermix und die Probeninokulation
Aluminium-Siegelfolie	BioRad	359-0133	Zum Verschließen der Probenplatte
Tröpfchengenerator	BioRad	186-3002
Tröpfchenerzeugungsöl	BioRad	186-3005
Kartusche	BioRad	186-4008
DG8 Kartuschenhalter	BioRad	186-3051
Dichtung	BioRad	186-3009
20 μ l Pipettenspitzen	Rainin	GP-L10F	Zum Tansferring von Proben/Mastermixen auf Kartusche
200 μ l Pipettenspitzen	Rainin	GP-L200F	Zum Übertragen von Tröpfchen auf das endgültige Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	Zum endgültigen thermischen Cycling und Lesen von Tröpfchen
Durchstechbare Heißsiegelfolie	BioRad	181-4040	Zum Versiegeln der Twin.Tec Platte vor dem Thermocycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 und C1000	Es wird nur der Thermocycler benötigt, keine Optik
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. der digitale PCR-Mix in der handschriftlichen
QuantaSoft-Software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Zum Anzeigen, Analysieren und Exportieren von ddPCR-Daten
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternativer Anbieter kann verwendet werden, aber das Florophor muss FAM
HF183 Forward Primer ( HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternativer Hersteller kann verwendet werden
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternativer Anbieter kann verwendet werden, aber das Florophor muss HEX sein (bei Verwendung von VIC, dann muss die geeignete Matric-Kompensation gewählt werden.
Positivkontrolle			: Mischung aus E. faecalis genomischer DNA und HF183-Standardplasmid (beim IDT bestellt). Für detaillierte Methoden zur Kultivierung von E. faecalis und Sequenzen des geordneten HF183-Plasmids siehe Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Im Handel erhältliche Enterococcus-DNA-Standards (ATCC 29212Q-FZ) können in der Positivkontrolle anstelle von im Labor hergestellter genomischer E. faecalis verwendet werden.