Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in E. coli

RNA-vermittelte Gen-Knockdowns gehen in zwei Stufen. Zunächst wird ein RNA-Molekül zu einer Zelllinie oder eines Organismus der Studie eingeführt. Zweitens endogene RNA-bindende Proteine ​​RNA-Zielerkennung erleichtern und die Dämpfungswirkung erzeugen. Alle RNA-Technologien profitieren Knockdown von der anpassbaren Natur des synthetischen sRNAs, die leicht ein bestimmtes Ziel von Interesse übereinstimmen hergestellt werden können. Allerdings variieren die molekularen Details der RNA-Aufnahme und silencing weit über Modellsystem beschränke wo und wie RNA Niederschlägen angewendet werden kann.

In Nematoden, doppelsträngige Moleküle RNA (dsRNA) in den Medien direkt oder durch die Würmer mit einer Bevölkerung von dsRNA-exprimierenden E. Fütterung coli - Zellen ^1,2. In Drosophila kann RNAi ³ durch Mikroinjizieren Embryonen mit dsRNA erreicht werden, oder in Zelllinien durchgeführt , indem einfach dsRNA zu dem Kulturmedium ⁴ hinzugefügt wird . In Säugetierzelllinien,synthetischen small interfering RNAs (siRNAs) an lebenden Zellen durch Elektroporation ^1,2,5, verpackt in Liposomen ^3,6, oder ausgedrückt von DNA - Plasmid - Vektoren ^4,7 geliefert werden. Sobald die RNA-Spezies in das Cytosol erreicht, stützt sich die RNAi-Weg auf der RISC-Komplex dsRNA zu verarbeiten, erleichtern Antisense Erkennung des Ziels und katalysieren translationale Repression Abbau mRNA oder Heterochromatinbildung, auf dem Host abhängt.

Aufgrund dieser Anforderungen können klassische RNAi nur in Organismen durchgeführt werden, die effizient exogene RNA aufnehmen und exprimieren RISC oder eine RISC-ähnliche Aktivität. Bemerkenswert ist , schließt dies das Modell Bakterium E. coli, die das RNAi - Weg fehlt. die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie bieten jedoch die Werkzeuge sowohl das Lieferproblem und das Silencing Problem zu lösen.

In diesem Protokoll werden sRNA - Konstrukte in E. ausgedrückt coli aus einer DNA - Vektor geliefert living Zellen des M13 Phagemid / Helfer-System. Ein Phagemid ist jedes Plasmid mit einem Phagen abgeleitete f1-Replikationsursprung. Ein Helferplasmid, in diesem Fall M13KO, trägt die alle Maschinen Viruspartikel zu produzieren erforderlich, ist aber selbst nicht zuständig für die Replikation und Verpackung. Wenn ein Phagemid und Helferplasmid werden co-transformiert, haftet allein der Phagemid an der f1-Ursprung repliziert, verpackt und ausgeschieden werden. Die vektorisiert Phagemid ist dann zuständig Live E. zu infizieren coli über das F - Pilus.

In diesem System wird der Schalldämpfungseffekt durch individuelle sRNA Kassetten Kombinieren einer Gerüstsequenz mit einem Target-Bindungssequenz erzeugt wird. Die Zielbindungssequenz ist 24 Basenpaare Antisense-mRNA zu einem Ziel, typischerweise an der Ribosomenbindungsstelle (RBS). Die Gerüstsequenz, entwickelt von Na und Kollegen ⁸ enthält eine Hfq-Bindungsmotiv aus micc extrahiert, eine kleine regulatorische RNA endogenen E. coli. Die Hfq Protein stimuliert RNA-RNA Binding und mRNA Degradation, eine Rolle in diesem System ähnlich RISC in RNAi dient. 1 zeigt ein komplettes System für den Phagen-vermittelter sRNA Niederschläge, inklusive der sRNA Kassettenstruktur, Phagemid Vektorisierung und Silencing - Mechanismus.

Als ein Verfahren der Genexpression in E. modulieren coli, ist sRNA Silencing einfach, schnell und vielseitig. Die gezielte E. coli ist nicht über Ausbreiten des Phagemid und Expression des sRNA belastet. Dies kann im Rahmen der synthetischen Biologie oder der Grundlagenforschung in denen die Expression von größeren heterologe Konstrukte belasten können zelluläre Ressourcen ⁹ relevant sein. Phagemide mit neuen Ziele können mit einem einzigen PCR und geerntet einen Tag nach Phagemid Transformation hergestellt werden. Schließlich kann nahezu jede mRNA gerichtet werden. Die sRNA - Regulationskassette (auf einem Standard - Plasmid) wurde auf einer Vielzahl von Zielen in den Stoffwechsel mit typischen Repression Ebenen> 90% ⁸ zu arbeiten , gezeigt.

10 Kassetten. Zuerst wird eine verpackte Phagemid zu einer Batch - Kultur von E. eingeführt coli Zellen und verwendete Ausdruck des fluoreszierenden Proteins mKate2 zum Schweigen zu bringen. Nachfolgende Fluoreszenzänderungen werden in Echtzeit überwacht. Zweitens Klopfen nach unten das CAT-Gen wird gezeigt, auf Agarplatten phänotypischen Resistenz gegen Chloramphenicol zu reduzieren. In beiden Fällen führt das Phagemid selbst ein GFP-Marker, so dass Infektionsrate unabhängig von der Zuschlagseffizienz gemessen werden.

1. Planung und Bau von Phagemidvektoren Bearing sRNA Silencing Cassetten

1. De - novo - Design von sRNA Silencing Kassetten ⁸
   1. Identifizieren die vollständige Sequenz der mRNA eine DNA-Sequenz-Datenbank zum Schweigen gebracht werden. Um die Zielsequenz erzeugen, notieren Sie die ersten 24 bp der kodierenden Sequenz von Position 1 bis 24 , beginnend mit dem Start - Codon (zB ATG).
      Hinweis: Silencing ist weniger effizient , wenn andere Seiten oder Abschnitten der mRNA ⁸ ausgerichtet sind.
   2. Nehmen Sie die reverse Komplement der Zielsequenz des GUIDE-Sequenz für die sRNA Kassette zu erzeugen. Siehe Tabelle 1 für Beispiele von TARGET und GUIDE Sequenzen für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT).
   3. Zur Gestaltung des 292 bp komplette sRNA Expressionskassette, ordnen Sie die pR - Promotor, GUIDE Sequenz, Hfq Protein - Bindungsdomäne und T1 / TE Transkriptionsterminatorsequenzen in Serie (Tabelle 2).
   4. Fügen Sie zusätzliche Klonierungsstellen der Wahl Klonierung der sRNA Kassette in den Zielvektor zu erleichtern.
   5. Beziehen Sie die komplette sRNA Kassette durch kommerzielle Gensynthese oder ein ähnliches Verfahren und klonen Sie es in jeden Phagemid - Vektor mit einem funktionellen f1 - Replikationsursprung ^11. Siehe die vollständige Sequenz des endgültigen Phagemid-Vektor Hintergrundinformationen.
2. Das Ändern der von einer vorhandenen sRNA - Expressionskassette Zielsequenz unter Verwendung von PCR-basierten Website - Directed Mutagenesis ¹²
   1. Identifizieren Sie die 24 bp GUIDE-Sequenz in einer bestehenden sRNA-Expressionskassette. Hinweis: Die kommentierte pAB.001 Plasmid, in dieser Arbeit verwendet wird, als eine zusätzliche Sequenz-Datei zur Verfügung steht.
   2. Design-Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit kurzen Regionen mit Homologie zu den bestehenden sRNA Kassette die neue 24 bp GUIDE Sequenz flankieren. Besorgen Sie sich die Primer durch kommerzielle Oligonukleotidsynthese.
      Hinweis: Primer-Design für die ortsgerichtete Mutagenese ist depicted in Abbildung 2. Genaue Templatsequenzen Primer sind in Tabelle 3 vorgesehen.
   3. Bereiten Sie eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung der sRNA Ausdruck Phagemid Vorlage. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika.
   4. Extrahieren und reinigen Sie die Vorlage sRNA Ausdruck Phagemid aus dem 5 ml Bakterienkultur eine DNA - Minipräparationskit oder ähnliches Verfahren unter Verwendung von ^12.
   5. Bereiten zwei PCR - Reaktionen unter Verwendung der Schablone sRNA Expression Phagemid und High - Fidelity - Polymerase, eine mit dem vorderen und eine mit dem Rückwärts - Primer (Tabelle 4). Verwendung der PCR - Bedingungen , wie durch die Polymerase - Lieferanten (Tabelle 5) empfohlen. Erhöhen Sie die Vorlage Konzentration auf 10-50x höher als eine Standardreaktion für die Tatsache zu berücksichtigen, dass die einzelnen Primer Reaktion nicht exponentielle Amplifikation erzeugt.
   6. Kombinieren Sie die beiden oben genannten PCR-Reaktionen in einem Reaktionsgefäß. Anneal die Produkte durch Erhitzen auf 98 ° C in einem kochenden Wasserbad. Unmittelbar nach dem Reaktionsgefäß im Wasserbad platziert, die Wärmequelle entfernen und das Bad erlauben langsam über 1-2 h auf Raumtemperatur zurückzukehren.
   7. Zur Beseitigung der nicht-mutierten Vorlage sRNA Ausdruck Phagemid, fügen 1 ul. DpnI-Restriktionsenzym zur Mischung und für 1 h bei 37 ° C inkubieren, oder die vom Hersteller für die vollständige Verdauung empfohlene Zeit.
      Hinweis: DpnI verdaut nur methylierte Zielstellen, die auf dem Host-replizierten Phagemide vorhanden sind, aber nicht PCR-Produkte.
   8. Trans gekauft oder ¹³ chemisch kompetente E. vorbereitet coli mit 1-5 & mgr; l des PCR - Produkts geglüht. Isolieren Sie einzelne Kolonien des transformierten Stammes durch selektive Beschichtung auf LB-Agar-Platten, die entsprechenden Antibiotika.
   9. Um den Einbau des richtigen Leitsequenz, Screenen der resultierenden Kolonien durch Kolonie-PCR verifizieren. Mit einer 200 ul Pipettenspitze, collect eine geringe Menge an Zellen, die aus einer einzigen transformierten Kolonie. Mark und die ursprüngliche Kolonie für nachgeschaltete Verwendung nach Überprüfung bewahren.
   10. Fügen Sie die gesammelten Zellen zu 50 ul Nuklease-freies Wasser in einem Reaktionsgefäß. Mischen durch Pipettieren von oben und unten.
   11. Verwendung einer Benchtop-Thermocycler oder ein siedendes Wasserbad, lysieren die Zellen durch Erhitzen auf 95 ° C für 2 min.
   12. PCR-Amplifizierung der Phagemid-Region unter Verwendung von 1 ul wärme lysierten Zellen als ein DNA-Templat. PCR - Bedingungen und Thermozykler - Protokolle sind in den Tabellen 6 und 7 vorgesehen. Siehe die zusätzliche pAB.001 Sequenzdatei zur Überprüfung Primersequenzen.
   13. Sequenz, die die PCR-Produkt Einbau des richtigen GUIDE-Sequenz zu überprüfen.
   14. Impfen eine 5 - ml - Kultur des E. coli Klon , der die Sequenz-verifiziert sRNA Ausdruck Phagemid trägt. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB selektiven Medien.
   15. Bereiten Sie einen Glycerolstammlösungder Sequenz-verifiziert Klon. In 750 ul der Übernachtkultur auf 250 & mgr; l von 60% Glycerin in einem Schraubverschluss Kryo Röhrchen.
   16. Lagern Sie das Glycerolstammlösung bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. Der Rest der Übernachtkultur kann als eine Quelle für die sRNA Expression Phagemid in Schritt 2 verwendet werden.

2. Produktion und Ernte von Phagemid Stocks-M13 verpackt

1. Bereiten Sie eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung des sRNA Ausdruck Phagemid. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. Hinweis: Die sRNA Ausdruck Phagemid kann , wie in Schritt 1.1.5 oder modifiziert werden aus einem bestehenden Phagemid und geerntet in Schritt 1.2.16 beschrieben durch de novo - Klonen erhalten werden.
2. Ebenso bereiten eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung des M13KO7 Helferplasmid. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB selektiven Medien.
3. Extrahieren und reinigen die sRNA expression Phagemid und Helferplasmid eine DNA - Extraktions - Kits oder ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von ^12.
4. Cotransform gekauft oder ¹³ hergestellten chemisch kompetente E. coli mit 1 ul jeweils von sRNA Ausdruck Phagemid und Helferplasmid. Wählen Sie für Kotransformanten durch Plattierung auf LB-Agar mit selektiven Antibiotika für beide Konstrukte.
5. Bereiten Sie eine 10-ml-Kultur aus einer einzelnen Kolonie des cotransformiert Stamm in LB mit selektiven Antibiotika. bei 37 ° C bebrütet 8-12 h oder über Nacht unter Schütteln.
6. Zentrifugieren der Kultur bei 3.300 × g für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und filtriert durch ein 0,2 um Filter. Achtung: Bei Medien verschütten, reinigen Sie den Bereich mit verdünnter Bleiche (0,5%) infektiöse Phagenpartikel zu zerstören.
7. Lagern Sie das verpackte Phagemid Filtrat bei 4 ° C. Anmerkung: Die Proben können für Tage bis Wochen ohne Aktivitätsverlust aufrechterhalten werden.

3. Herstellung von F ⁺ Zellen Ziel für Silencing

1. Bestimmen Sie, ob die Zellen zum Schweigen zu bringen , die F - Pilus ¹⁴ ausdrücken gezielt werden. Wenn die F-Pilus bereits vorhanden ist, gehen Sie zu Schritt 4.
   Hinweis: Allgemeine Laborstämme von E. coli werden als F ⁺ oder F 'kommentierten die Anwesenheit des F - Pilus in ihrem Genom , um anzuzeigen , oder auf einem Plasmid.
2. Erhalten Sie F ⁺ Stamm von E. coli wie TOP10F '.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Zielstamm trägt einen einzigartigen Resistenzmarker, um aus dem F-Plasmid Spender nach der Konjugation getrennt werden.
3. F pilus durch Konjugation mit einem F ⁺ Stamm einzuführen, bereiten 5 ml Kulturen sowohl der Zielstamm und F-Plasmid Spender ^14. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika.
4. Am folgenden Tag verdünnen beide Stämme 1: 100 in 5 ml LB selektiven und weiter Kultivieren bei 37 ° C unter Schütteln.
5. Bestimmen Sie die Wachstumsphase der Zellen durch die Opt Messsche Dichte der Kultur bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ ein benchtop Spektralphotometer. Kultur für die Zellen etwa 2 h , bis eine OD ₆₀₀ von 0,3 erreicht ist, was anzeigt , log-Phasenwachstum ^15.
6. Vorbereitung 3 Konjugationsreaktionen in Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 ml F-Plasmid-Donor + 0,5 ml Zielstamm, 0,5 ml F-Plasmid-Donor + 0,5 ml LB-Medium (negative Kontrolle) und 0,5 ml Zielstamm + 0,5 ml LB-Medium (negative Kontrolle). Lassen Sie die Konjugation für 2 Stunden bei 37 ° C ablaufen unter Schütteln.
7. Platte 100 ul jeder Konjugationsreaktion auf selektive LB-Agar mit Antibiotika spezifisch für das F-Plasmid (typischerweise Tetracyclin) und Zielstamm. Platte, die negativen Kontrollreaktionen bestätigen, dass weder Spender oder Empfängerstamm beide Antibiotikaresistenzen auszudrücken.

4. Eine Infektion mit Packaged Phagemide für Silencing

1. Beimpfen einer einzelnen Kolonie von F ⁺ Zielzellen in einen 5 - ml - Kultur von LB medieine mit geeigneten Antibiotika. über Nacht bei 37 ° C inkubieren unter Schütteln.
2. Am folgenden Tag, verdünne die F ⁺ Zielzellen von 1: 100 in 5 ml LB selektiven Medien und zur Kultur bei 37 ° C unter Schütteln fortgesetzt.
3. Bestimmung der Wachstumsphase der Zellen , die durch die optische Dichte der Kultur bei 600 nm gemessen (OD ₆₀₀₎ ein benchtop Spektralphotometer. Kultur für die Zellen etwa 2 h , bis eine OD ₆₀₀ von 0,3 erreicht ist, was anzeigt , log-Phasenwachstum ^15. Hinweis: Die Expression des F-Pilus und Infektionseffizienz ist in der log-Phase am höchsten.
4. Fügen Sie die M13-verpackten Phagemide (aus Schritt 2.6) an die Zielzellen in einem Volumenverhältnis von 1: 100 fast 99% Befall der Zielpopulation zu erreichen. Lassen Sie die Infektion bei 37 ° C ablaufen 30-60 Minuten unter Schütteln.
5. Assay, um die sRNA-Silencing-Phänotyp nach der Methode der Wahl.
   Hinweis: für ein fluoreszierendes Protein Target kann der Schalldämpfungseffekt zu quantifizierendirekt durch Fluorometrie ^10. Alternativ kann phänotypischen Assays verwendet werden , um die phänotypischen Folgen Knock-Down ⁸ zu beobachten.
6. Bereiten Sie einen Glycerolstammlösung für die sRNA-exprimierenden Phagemid Host folgende Schritte 1.2.14-1.2.16. Hinweis: Die Phagemid auf unbestimmte Zeit im Wirtsstamm ausbreitet und kann mit Antibiotika ähnlich einem herkömmlichen Plasmid beibehalten werden.

Silencing von mKate2 Fluoreszenz in flüssigen Medien

Abbildung 1 zeigt das Schema für sRNA-vermittelten Knockdowns in dieser Arbeit beschrieben, einschließlich der sRNA Kassettenentwurf, Phagemid Vektorisierung und Silencing - Mechanismus. Nach Protokoll 1.2 wurde die sRNA-Silencing-Kassette von Plasmid pAB.001 verändert mKate Ziel. Die sRNA - Kassette wurde synthetisiert und kloniert in Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP, ein Geschenk von Monica Ortiz und Drew Endy 11. Dieses Phagemid trägt Marker für die GFP-Expression und Kanamycin-Resistenz, wodurch erfolgreiche Infektionen zu verfolgen. Verpackt Phagemid Bestände wurden folgende Protokoll 2 hergestellt.

Ein Derivat von E. coli K12 MG1655 eine konstitutiv exprimiert, chromosomal integriert mKate2 Marker trägt , wurde für Phageninfektion durch Konjugation vorbereitet mit einem F-Stamm Plasmid Spender folgende Protokoll 3. Die Zellen folgende Protokoll 4. Nach Phagemid Infektion bis Mitte der log-Phase und dem Phagemid eingeführt wurden gezüchtet wurden 200 & mgr; l Kulturen auf einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät übertragen und Fluoreszenz wurde kontinuierlich für 24 Stunden überwacht.

Abbildung 3 zeigt die Wirkung von sRNA-vermitteltes Silencing auf mKate2 Expression. Der Stamm infiziert mit einem Anti-mKate2 Phagemid zeigte keine nachweisbare mKate2 Fluoreszenz gegenüber dem Hintergrund. Im Gegensatz dazu hat dieser Stamm das GFP-Marker exprimieren, zeigen damit die erfolgreiche Aufnahme des Phagemid. Nicht infizierte Kontrollzellen mKate2 Fluoreszenz produziert, aber nicht GFP. Eine zusätzliche Steuerung, in dem die anti-mKate2 Targeting-Domäne mit einer Sequenz Targeting CAT ersetzt wurde, hatte keine Wirkung auf mKate2 Fluoreszenz.

Silencing von Chloramphenicol-Resistenz auf Agar-Platten

Inhalt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Nach Protokoll 1.1, eine sRNA - Silencing - Kassette wurde hergestellt CAT Ziel ein Derivat von E. coli K12 MG1655 ein konstitutiv exprimiert, chromosomal integrierte CAT Marker trägt , wurde vorbereitet. Phageninfektion durch Konjugation mit einem F-Plasmid Donorstamm folgende Protokoll 3. die Zellen bis mittleren log-Phase gezüchtet worden waren, und die Phagemid bei 37 ° C folgende Protokoll 4. nach 1 Stunde Inkubation eingeführt wurden infizierte Zellen seriell verdünnt und unter einer plattierten Bereich von Chloramphenicol-Konzentrationen. die Platten wurden durch Zählen von koloniebildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag über Nacht, und der Anteil der resistenten Zellen bei jeder Konzentration wurde bestimmt Chloramphenicol inkubiert.

Figur 4 zeigt die Wirkung von sRNA-vermitteltes Silencing auf dem Chloramphenicol - Resistenz - Phänotyp. Nicht-infizierte Zellen oder Zellen infiziert mit Phagemid mKate2 Targeting, waren resistent gegenChloramphenicol bei allen getesteten Konzentrationen. Im Gegensatz dazu mit Phagemid Targeting CAT-infizierten Zellen zeigten Überleben bei niedrigen Konzentrationen Chloramphenicol reduziert und nahezu 99% bei höheren Konzentrationen zu töten. Die Zugabe von Ampicillin, für nur Bakterien zur Auswahl der Phagemid trägt, reduziert Chloramphenicol Überleben auf ein nicht nachweisbares Niveau. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten , dass die Flucht aus dem Phagen - Infektion zeigt eine gemeinsame Route 10 zu entkommen zum Schweigen zu bringen.

Abbildung 1: Gene Silencing in E. coli mit sRNA - Expressionskassetten Lieferung von M13 Phage Die sRNA Kassette aus 4 Modulen zusammengesetzt ist. Die PR - Promotor (ein konstitutiver Promotor abgeleitet aus dem Bakteriophagen Lambda), eine 24 bp Targeting - Domäne, eine Hfq Bindungsdomäne von micc extrahiert und einen Transkriptionsterminator 8 E. zu infizieren coli Expression des F - Pilus, wo sRNA Ausdruck beginnt. Die sRNA rekrutiert dann das Hfq Protein (in rot dargestellt) und bindet ein Antisense - mRNA Ziel in der Nähe der Ribosomen - Bindungsstelle, in translationale Repression und mRNA - Abbau führt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Primer - Design und zielgerichtete Mutagenese des sRNA Zielsite werden zwei Primer mit teilweise Homologie zu einer vorhandenen sRNA Kassette entworfen. Der Vorwärtsprimer enthält 20 bp homolog zu der pR-Promotor am 5'-Ende, gefolgt von24 bp die neue Führungssequenz darstellt, dann 18 bp homolog zur Hfq-Bindungsdomäne an das 3'-Ende. Der Reverse-Primer ist die genaue reversen Komplement des Vorwärtsprimers, mit Regionen der Homologie zu den bestehenden sRNA Kassette das reverse Komplement der neuen Führungssequenz flankieren. Exact Primersequenzen sind in Tabelle 3. Separate Einzelprimer - PCR - Reaktionen mit den Vorwärts- und den Rückwärtsprimer erzeugen lineare, einzelsträngige DNA mit der gewünschten modifizierten Sequenz. Das Glühen der Vorwärts- und Reaktionsprodukte umzukehren, nach Clean-up wie im Protokoll beschrieben, resultiert in doppelsträngiger Plasmid - DNA trägt die gewünschte modifizierte sRNA Kassette. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Knockdown eines chromosomal integriert mKate2 Fluorescent Reporter. E. coli MG1655 K12 mKate2 exprimieren , wurden entweder unbehandelt gelassen (rote Linien und Balken), infiziert mit einem Anti-mKate2 Phagemid (grüne Linien und Balken) oder mit einer Steuer Phagemid Targeting CAT (blaue Linien und Balken) infiziert. (A) Unbehandelte E. coli stieg auf höhere Sättigungsdichte, eine metabolische Kosten Phageninfektion anzeigt. Die gepunkteten Linien zeigen die Standardabweichungen von drei Replikaten. (B) Das mKate2 Signal wurde reduziert , um in der Nähe von Hintergrundwerte in der Anti-mKate2 behandelten Stamm, aber nicht in Kontrollstämmen. (C) GFP - Fluoreszenz, die ebenfalls von dem Phagemid getragen nachweisbar war nur in Phagemid-behandelten Kontrollen. (D, E) Abschlussfluoreszenzmesswerte nach 24 h Wachstum OD normalisiert wurden. GFP-Signal, Phagemid Infektion anzeigt, war in unbehandelten Kontrollen fehlen, aber auch anti-CAT p folgende erheblich reduzierthagemid Behandlung. Dies kann Nebeneffekte des Phagemid zeigen. Das mKate2 Signal wurde von anti-mKate2 Phagemid Behandlung reduziert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die CAT-gezielte Steuerung Phagemid zeigte keine Wirkung auf mKate2 Fluoreszenz. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Replikaten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Preissturz von CAT Stellt Chloramphenicol - Empfindlichkeit auf einen genetisch resistenten Population E.. coli MG1655 K12 eine chromosomal integrierte CAT - Gen exprimieren , wurden unbehandelt gelassen (rote Balken), mit einer Steuer Phagemid behandelt mKate2 (grüne Balken) Targeting oder mit einem Phagemid behandelt , um eine anti-CAT Srna (blaue Balken) ausdrückt. Nach 1 Stunde der Infektion, die Lebensfähigkeit auf der angezeigten antibiotics wurde durch serielle Verdünnungen und Galvanisieren bewertet. Stämme mit anti-CAT Phagemid behandelt wurden signifikant (> 90%) von Chloramphenicol bei höheren Konzentrationen getötet, während Kontrollbehandlungen unbeeinflusst waren. Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturplatten wählt positiv für Phagemid-Infektion und beseitigt nicht-infizierten Zellen. Unter diesen Bedingungen wurde beobachtet, keine Chloramphenicol-resistenten Kolonien nach der anti-CAT-Behandlung. Dies zeigt, dass die meisten Überlebenden ein Versagen der Infektion darstellen, sondern als ein Ausfall silencing. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Replikaten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

CAT TARGET-Sequenz	5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3'
CAT Leitsequenz	5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3'

Tabelle 1:. Ein Beispiel TARGET und Führungssequenz für das CAT - Gen Beachten Sie die reverse Komplement Beziehung.

pR-Promotor	TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC
Leitsequenz	ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT
Hfq Bindungsdomäne	TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG
T1 / TE terminator	CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

Tabelle 2:. Sequence Komponenten der sRNA Cassette Jede Sequenz geschrieben 5'-3 '. Der komplette Kassette ist die Verkettung dieser vier Elemente in Ordnung und umfasst 292 bp.

Forward Primer	5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3'
Reverse Primer	5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3'

Tabelle 3: Primer Entwurf zu ändern Bestehende Leitelemente Der Vorwärts - Primer enthält die letzten 20 bp des pR - Promotor, die neue GUIDE - Sequenz und die ersten 18 bp des Hfq-Bindungsdomäne.. Die Zielsequenz ist das genaue Gegenteil Ergänzung des GUIDE-Sequenz. Der Reverse-Primer ist die genaue reversen Komplement des Vorwärtsprimers.

Komponente Volumen Templat-Plasmid 500 ng 10 & mgr; M Primer 2,5 ul 10 mM dNTPs 0,4 ul High-Fidelity-Polymerase (2 U / ul) 0,5 ul 5x PCR-Puffer 10 ul Volle Lautstärke 50 ul

Tabelle 4: Empfohlene Bedingungen für die Single-Primer mutagene PCR.

Schritt	Temp	Zeit
anfängliche Denaturierung	98 ° C	30 sec
30 Zyklen	98 ° C	10 sec
55 ° C	30 sec
72 ° C	120 Sekunden
Finale Extension	72 ° C	300 sec
Lagerung	10 ° C

Tabelle 5: Empfohlene Thermocycler - Protokoll für die Einzel-Primer mutagene PCR.

Komponente	Volumen
Template-DNA	1 ul
10 & mgr; M Forward Primer	0,5 ul
10 & mgr; M Reverse Primer	0,5 ul
Taq 2X Master Mix	25 ul
Nuklease-freies water	23 & mgr; l
Volle Lautstärke	50 ul

Tabelle 6: Empfohlene Bedingungen für die Sequenzüberprüfung PCR.

Schritt	Temp	Zeit
anfängliche Denaturierung	95 ° C	30 sec
30 Zyklen	95 ° C	30 sec
55 ° C	30 sec
68 ° C	30 sec
Finale Extension	68 ° C	300 sec
Lagerung	10 ° C

Tabelle 7: Empfohlene Thermocycler Prokoll für die Sequenzüberprüfung PCR.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.