Name: Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie die phagenvermittelte Lieferung von sRNA-Kassetten zur Gen-Knockdown in E. coli. Diese Methode ermöglicht schnelles Gen-Silencing in Batch-Kulturen ohne vorherige genetische Modifikation.

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Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von der Fondation Bettencourt Schueller zur Unterstützung der Pariser Bettencourt iGEM-Team zur Verfügung gestellt. Wir danken dem INSERM U1001 Forschungseinheit und Chantal Lotton für technische Hilfe und Beratung. Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP wurde von Monica Ortiz und Drew Endy von der Stanford zur Verfügung gestellt.

1. Planung und Bau von Phagemidvektoren Bearing sRNA Silencing Cassetten <ol><li> De - novo - Design von sRNA Silencing Kassetten 8 <ol><li> Identifizieren die vollständige Sequenz der mRNA eine DNA-Sequenz-Datenbank zum Schweigen gebracht werden. Um die Zielsequenz erzeugen, notieren Sie die ersten 24 bp der kodierenden Sequenz von Position 1 bis 24 , beginnend mit dem Start - Codon (zB ATG). Hinweis: Silencing ist weniger effizient , wenn andere Seiten oder Abschnitten der mRNA 8 ausgerichtet sind. </li><li> Nehmen Sie die reverse Komplement der Zielsequenz des GUIDE-Sequenz für die sRNA Kassette zu erzeugen. Siehe Tabelle 1 für Beispiele von TARGET und GUIDE Sequenzen für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). </li><li> Zur Gestaltung des 292 bp komplette sRNA Expressionskassette, ordnen Sie die pR - Promotor, GUIDE Sequenz, Hfq Protein - Bindungsdomäne und T1 / TE Transkriptionsterminatorsequenzen in Serie (Tabelle 2). </li><li> Fügen Sie zusätzliche Klonierungsstellen der Wahl Klonierung der sRNA Kassette in den Zielvektor zu erleichtern. </li><li> Beziehen Sie die komplette sRNA Kassette durch kommerzielle Gensynthese oder ein ähnliches Verfahren und klonen Sie es in jeden Phagemid - Vektor mit einem funktionellen f1 - Replikationsursprung 11. Siehe die vollständige Sequenz des endgültigen Phagemid-Vektor Hintergrundinformationen. </li></ol></li><li> Das Ändern der von einer vorhandenen sRNA - Expressionskassette Zielsequenz unter Verwendung von PCR-basierten Website - Directed Mutagenesis 12 <ol><li> Identifizieren Sie die 24 bp GUIDE-Sequenz in einer bestehenden sRNA-Expressionskassette. Hinweis: Die kommentierte pAB.001 Plasmid, in dieser Arbeit verwendet wird, als eine zusätzliche Sequenz-Datei zur Verfügung steht. </li><li> Design-Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit kurzen Regionen mit Homologie zu den bestehenden sRNA Kassette die neue 24 bp GUIDE Sequenz flankieren. Besorgen Sie sich die Primer durch kommerzielle Oligonukleotidsynthese. Hinweis: Primer-Design für die ortsgerichtete Mutagenese ist depicted in Abbildung 2. Genaue Templatsequenzen Primer sind in Tabelle 3 vorgesehen. </li><li> Bereiten Sie eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung der sRNA Ausdruck Phagemid Vorlage. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. </li><li> Extrahieren und reinigen Sie die Vorlage sRNA Ausdruck Phagemid aus dem 5 ml Bakterienkultur eine DNA - Minipräparationskit oder ähnliches Verfahren unter Verwendung von 12. </li><li> Bereiten zwei PCR - Reaktionen unter Verwendung der Schablone sRNA Expression Phagemid und High - Fidelity - Polymerase, eine mit dem vorderen und eine mit dem Rückwärts - Primer (Tabelle 4). Verwendung der PCR - Bedingungen , wie durch die Polymerase - Lieferanten (Tabelle 5) empfohlen. Erhöhen Sie die Vorlage Konzentration auf 10-50x höher als eine Standardreaktion für die Tatsache zu berücksichtigen, dass die einzelnen Primer Reaktion nicht exponentielle Amplifikation erzeugt. </li><li> Kombinieren Sie die beiden oben genannten PCR-Reaktionen in einem Reaktionsgefäß. Anneal die Produkte durch Erhitzen auf 98 ° C in einem kochenden Wasserbad. Unmittelbar nach dem Reaktionsgefäß im Wasserbad platziert, die Wärmequelle entfernen und das Bad erlauben langsam über 1-2 h auf Raumtemperatur zurückzukehren. </li><li> Zur Beseitigung der nicht-mutierten Vorlage sRNA Ausdruck Phagemid, fügen 1 ul. DpnI-Restriktionsenzym zur Mischung und für 1 h bei 37 ° C inkubieren, oder die vom Hersteller für die vollständige Verdauung empfohlene Zeit. Hinweis: DpnI verdaut nur methylierte Zielstellen, die auf dem Host-replizierten Phagemide vorhanden sind, aber nicht PCR-Produkte. </li><li> Trans gekauft oder 13 chemisch kompetente E. vorbereitet coli mit 1-5 &amp; mgr; l des PCR - Produkts geglüht. Isolieren Sie einzelne Kolonien des transformierten Stammes durch selektive Beschichtung auf LB-Agar-Platten, die entsprechenden Antibiotika. </li><li> Um den Einbau des richtigen Leitsequenz, Screenen der resultierenden Kolonien durch Kolonie-PCR verifizieren. Mit einer 200 ul Pipettenspitze, collect eine geringe Menge an Zellen, die aus einer einzigen transformierten Kolonie. Mark und die ursprüngliche Kolonie für nachgeschaltete Verwendung nach Überprüfung bewahren. </li><li> Fügen Sie die gesammelten Zellen zu 50 ul Nuklease-freies Wasser in einem Reaktionsgefäß. Mischen durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> Verwendung einer Benchtop-Thermocycler oder ein siedendes Wasserbad, lysieren die Zellen durch Erhitzen auf 95 ° C für 2 min. </li><li> PCR-Amplifizierung der Phagemid-Region unter Verwendung von 1 ul wärme lysierten Zellen als ein DNA-Templat. PCR - Bedingungen und Thermozykler - Protokolle sind in den Tabellen 6 und 7 vorgesehen. Siehe die zusätzliche pAB.001 Sequenzdatei zur Überprüfung Primersequenzen. </li><li> Sequenz, die die PCR-Produkt Einbau des richtigen GUIDE-Sequenz zu überprüfen. </li><li> Impfen eine 5 - ml - Kultur des E. coli Klon , der die Sequenz-verifiziert sRNA Ausdruck Phagemid trägt. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB selektiven Medien. </li><li> Bereiten Sie einen Glycerolstammlösungder Sequenz-verifiziert Klon. In 750 ul der Übernachtkultur auf 250 &amp; mgr; l von 60% Glycerin in einem Schraubverschluss Kryo Röhrchen. </li><li> Lagern Sie das Glycerolstammlösung bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. Der Rest der Übernachtkultur kann als eine Quelle für die sRNA Expression Phagemid in Schritt 2 verwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Produktion und Ernte von Phagemid Stocks-M13 verpackt <ol><li> Bereiten Sie eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung des sRNA Ausdruck Phagemid. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. Hinweis: Die sRNA Ausdruck Phagemid kann , wie in Schritt 1.1.5 oder modifiziert werden aus einem bestehenden Phagemid und geerntet in Schritt 1.2.16 beschrieben durch de novo - Klonen erhalten werden. </li><li> Ebenso bereiten eine 5 - ml - Kultur von E. coli Durchführung des M13KO7 Helferplasmid. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB selektiven Medien. </li><li> Extrahieren und reinigen die sRNA expression Phagemid und Helferplasmid eine DNA - Extraktions - Kits oder ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von 12. </li><li> Cotransform gekauft oder 13 hergestellten chemisch kompetente E. coli mit 1 ul jeweils von sRNA Ausdruck Phagemid und Helferplasmid. Wählen Sie für Kotransformanten durch Plattierung auf LB-Agar mit selektiven Antibiotika für beide Konstrukte. </li><li> Bereiten Sie eine 10-ml-Kultur aus einer einzelnen Kolonie des cotransformiert Stamm in LB mit selektiven Antibiotika. bei 37 ° C bebrütet 8-12 h oder über Nacht unter Schütteln. </li><li> Zentrifugieren der Kultur bei 3.300 × g für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und filtriert durch ein 0,2 um Filter. Achtung: Bei Medien verschütten, reinigen Sie den Bereich mit verdünnter Bleiche (0,5%) infektiöse Phagenpartikel zu zerstören. </li><li> Lagern Sie das verpackte Phagemid Filtrat bei 4 ° C. Anmerkung: Die Proben können für Tage bis Wochen ohne Aktivitätsverlust aufrechterhalten werden. </li></ol> 3. Herstellung von F + Zellen Ziel für Silencing <ol><li> Bestimmen Sie, ob die Zellen zum Schweigen zu bringen , die F - Pilus 14 ausdrücken gezielt werden. Wenn die F-Pilus bereits vorhanden ist, gehen Sie zu Schritt 4. Hinweis: Allgemeine Laborstämme von E. coli werden als F + oder F &#39;kommentierten die Anwesenheit des F - Pilus in ihrem Genom , um anzuzeigen , oder auf einem Plasmid. </li><li> Erhalten Sie F + Stamm von E. coli wie TOP10F &#39;. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Zielstamm trägt einen einzigartigen Resistenzmarker, um aus dem F-Plasmid Spender nach der Konjugation getrennt werden. </li><li> F pilus durch Konjugation mit einem F + Stamm einzuführen, bereiten 5 ml Kulturen sowohl der Zielstamm und F-Plasmid Spender 14. Wachsen die Zellen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln in LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. </li><li> Am folgenden Tag verdünnen beide Stämme 1: 100 in 5 ml LB selektiven und weiter Kultivieren bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Bestimmen Sie die Wachstumsphase der Zellen durch die Opt Messsche Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) ein benchtop Spektralphotometer. Kultur für die Zellen etwa 2 h , bis eine OD 600 von 0,3 erreicht ist, was anzeigt , log-Phasenwachstum 15. </li><li> Vorbereitung 3 Konjugationsreaktionen in Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 ml F-Plasmid-Donor + 0,5 ml Zielstamm, 0,5 ml F-Plasmid-Donor + 0,5 ml LB-Medium (negative Kontrolle) und 0,5 ml Zielstamm + 0,5 ml LB-Medium (negative Kontrolle). Lassen Sie die Konjugation für 2 Stunden bei 37 ° C ablaufen unter Schütteln. </li><li> Platte 100 ul jeder Konjugationsreaktion auf selektive LB-Agar mit Antibiotika spezifisch für das F-Plasmid (typischerweise Tetracyclin) und Zielstamm. Platte, die negativen Kontrollreaktionen bestätigen, dass weder Spender oder Empfängerstamm beide Antibiotikaresistenzen auszudrücken. </li></ol> 4. Eine Infektion mit Packaged Phagemide für Silencing <ol><li> Beimpfen einer einzelnen Kolonie von F + Zielzellen in einen 5 - ml - Kultur von LB medieine mit geeigneten Antibiotika. über Nacht bei 37 ° C inkubieren unter Schütteln. </li><li> Am folgenden Tag, verdünne die F + Zielzellen von 1: 100 in 5 ml LB selektiven Medien und zur Kultur bei 37 ° C unter Schütteln fortgesetzt. </li><li> Bestimmung der Wachstumsphase der Zellen , die durch die optische Dichte der Kultur bei 600 nm gemessen (OD 600) ein benchtop Spektralphotometer. Kultur für die Zellen etwa 2 h , bis eine OD 600 von 0,3 erreicht ist, was anzeigt , log-Phasenwachstum 15. Hinweis: Die Expression des F-Pilus und Infektionseffizienz ist in der log-Phase am höchsten. </li><li> Fügen Sie die M13-verpackten Phagemide (aus Schritt 2.6) an die Zielzellen in einem Volumenverhältnis von 1: 100 fast 99% Befall der Zielpopulation zu erreichen. Lassen Sie die Infektion bei 37 ° C ablaufen 30-60 Minuten unter Schütteln. </li><li> Assay, um die sRNA-Silencing-Phänotyp nach der Methode der Wahl. Hinweis: für ein fluoreszierendes Protein Target kann der Schalldämpfungseffekt zu quantifizierendirekt durch Fluorometrie 10. Alternativ kann phänotypischen Assays verwendet werden , um die phänotypischen Folgen Knock-Down 8 zu beobachten. </li><li> Bereiten Sie einen Glycerolstammlösung für die sRNA-exprimierenden Phagemid Host folgende Schritte 1.2.14-1.2.16. Hinweis: Die Phagemid auf unbestimmte Zeit im Wirtsstamm ausbreitet und kann mit Antibiotika ähnlich einem herkömmlichen Plasmid beibehalten werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorliegende Verfahren erreicht 80% ige Reduktion der mKate Fluoreszenzwerte im Vergleich zu ungezielte Kontrollen. Dies steht im Einklang mit anderen RNA - Knockdown - Methoden, bei denen das gesamte Silencing wird nicht beobachtet und 50-90% Wirkungsgrad ist typisch 16,17. Auf der phänotypischen Ebene CAT-bezogene Niederschläge konnten deutlich Chloramphenicol-Resistenz zu dämpfen, und beseitigen es unter bestimmten Bedingungen. Der Zuschlag Phänotyp war nach nur wenigen Stunden nach der Infektion (3B) auf Bevölkerungsebene nachweisbar. Dies stellt ein wichtiges Merkmal des Phagen-basierten Delivery: kann eine hohe Zuschlags Frequenz ohne vorherige genetische Modifikation direkt in Batch-Kultur erhalten werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Modifikationen genetischen Plasmidtransformation oder genomische Integration verwenden, wird Phageninfektion nicht verlangen, dass eine Population von einer einzelnen isolierten Kolonie wieder angebaut werden. Dadurch können die Auswirkungen von Phageninfektion zu sein explored in Populationen mit komplexen räumlichen Dynamik 11, mit bereits bestehenden räumlichen Strukturen wie Biofilme 18 oder in genetisch gemischten natürlichen Populationen 19. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist die Herstellung von verpackten Phagemiden bei hohen Titer. Die metabolische Belastung mit Phagenteilchens Produktion verbunden sind, können in dem Phagemid Produktionsstamm zu hohen Mutationsraten oder Plasmid-Verlust führen. Es wird empfohlen, die Phagemid Produktionsstamm direkt aus einer einzigen cotransformiert Kolonie und nicht gekühlt, gefroren oder Unter kultiviert Phagen Ernte vor kultiviert werden. Eine geringe Effizienz der Co-Transformation kann auch beobachtet werden , wenn die Phagemid und Helferplasmid E. Einführung gleichzeitig coli. In diesem Fall können höhere Wirkungsgrade durch Transformieren des ersten Helferplasmid erhalten werden, dann kompetente Zellen Herstellung des Helferplasmid für die nachfolgende Transformation mit dem Phagemid trägt. Phagemid Infektion oder sRNA Expression erlegt auch eine nachweisbare metabolische Belastung auf den Zielzellen und in einigen phänotypischen Störungs führen kann. Zum Beispiel wurde eine Verringerung der mKate2 Fluoreszenz beobachtet , selbst wenn die Zellen mit einem Phagemid - Targeting - CAT (Abbildung 3) infiziert waren. Eine Infektion mit M13 ist nicht daran gedacht , systemische Stressreaktionen in E. auslösen 20 coli, kann aber indirekt Transkriptionsmuster verändern. Alternativ kann das GFP oder Ampicillin - Resistenzmarker auf dem Phagemid enthalten für zellulare Ressourcen konkurrieren, wodurch mKate2 Expression und das Wachstum 9. Schließlich Genexpressionsprofile verändern die sRNA Kassette selbst global durch das Hfq Protein Titrieren oder durch Off-Target-mRNA-Silencing. Aus Zielwirkungen sind häufig in in vivo RNAi - Targeting 21-23, aber sie haben noch systematisch für dieses System untersucht werden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Infektion effizienz ist weniger als 100%, einige nicht-infizierten Bakterien ermöglicht in der Bevölkerung zu persistieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit und frühere Arbeit 10 deuten darauf hin , dass nicht infizierte Zellen 1-10% der Gesamtbevölkerung ausmachen, und sind verantwortlich für die meisten der nonsilenced Phänotypen beobachtet. Eine Vielzahl von Routen zu M13-Resistenz sind bekannt, mit dem die gängigste Mutations - Verlust von Pilus Ausdruck 24. In Anbetracht dieser Beschränkungen sollten Kontrollen verwendet werden, um hohe Infektionsraten und Zuschlags Effizienz zu bestätigen. Eine weitere potentielle Beschränkung für einige Anwendungen ist die gelegentliche Übertragung von Helferphagen zu kontaminieren. Obwohl M13K07 ein mutiertes Verpackungssignal enthält, kann es auf infizierte Populationen bei niedriger Frequenz und übertragen verpackt in Phagen Kapsid werden, was in Zellen kompetent für die Phagenproduktion und die fortgesetzte Ausbreitung der Phagen über die anfängliche Infektionsereignis 25. Änderungen an der Helferphage haben sich bewährtbei unspezifischen Verpackungs Verringerung, wenn auch manchmal auf Kosten einer reduzierten Phagenproduktion 26. Ausgeführt Bakteriophagen sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für E. geworden coli synthetischen Biologie ermöglicht die schnelle Bereitstellung neuer Gene zu einer wachsenden Bevölkerung. Neuere Arbeiten haben 11 interzellulären Kommunikationsschaltungen erzeugt oder Transkriptionsfaktoren ausgedrückt Antibiotika - Resistenz zu unterdrücken Pfade 27. Das Protokoll vorgestellt fügt hier zu einer wachsenden Sammlung von Werkzeugen, die durch programmierte RNAs Kontrolle der bakteriellen Physiologie ermöglichen. CRISPR-Cas Nukleasen, wenn sie mutiert Nukleaseaktivität zu beseitigen, wurden Transkription 17,28 an RNA-geführten Genziele zu verdrängen gezeigt. Im Gegensatz dazu arbeitet sRNA silencing auf der Translationsebene und erfordert keine exogenen Protein-Expression. Next-Generation Biotechnologien können Transkriptions- und Translationskontrolle mit dem Phagen-vermittelte Abgabe vereinen komplexe Phänotypen zu programmierenTypen in Echtzeit.

RNA-vermittelte Gen-Knockdowns gehen in zwei Stufen. Zunächst wird ein RNA-Molekül zu einer Zelllinie oder eines Organismus der Studie eingeführt. Zweitens endogene RNA-bindende Proteine ​​RNA-Zielerkennung erleichtern und die Dämpfungswirkung erzeugen. Alle RNA-Technologien profitieren Knockdown von der anpassbaren Natur des synthetischen sRNAs, die leicht ein bestimmtes Ziel von Interesse übereinstimmen hergestellt werden können. Allerdings variieren die molekularen Details der RNA-Aufnahme und silencing weit über Modellsystem beschränke wo und wie RNA Niederschlägen angewendet werden kann. In Nematoden, doppelsträngige Moleküle RNA (dsRNA) in den Medien direkt oder durch die Würmer mit einer Bevölkerung von dsRNA-exprimierenden E. Fütterung coli - Zellen 1,2. In Drosophila kann RNAi 3 durch Mikroinjizieren Embryonen mit dsRNA erreicht werden, oder in Zelllinien durchgeführt , indem einfach dsRNA zu dem Kulturmedium 4 hinzugefügt wird . In Säugetierzelllinien,synthetischen small interfering RNAs (siRNAs) an lebenden Zellen durch Elektroporation 1,2,5, verpackt in Liposomen 3,6, oder ausgedrückt von DNA - Plasmid - Vektoren 4,7 geliefert werden. Sobald die RNA-Spezies in das Cytosol erreicht, stützt sich die RNAi-Weg auf der RISC-Komplex dsRNA zu verarbeiten, erleichtern Antisense Erkennung des Ziels und katalysieren translationale Repression Abbau mRNA oder Heterochromatinbildung, auf dem Host abhängt. Aufgrund dieser Anforderungen können klassische RNAi nur in Organismen durchgeführt werden, die effizient exogene RNA aufnehmen und exprimieren RISC oder eine RISC-ähnliche Aktivität. Bemerkenswert ist , schließt dies das Modell Bakterium E. coli, die das RNAi - Weg fehlt. die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie bieten jedoch die Werkzeuge sowohl das Lieferproblem und das Silencing Problem zu lösen. In diesem Protokoll werden sRNA - Konstrukte in E. ausgedrückt coli aus einer DNA - Vektor geliefert living Zellen des M13 Phagemid / Helfer-System. Ein Phagemid ist jedes Plasmid mit einem Phagen abgeleitete f1-Replikationsursprung. Ein Helferplasmid, in diesem Fall M13KO, trägt die alle Maschinen Viruspartikel zu produzieren erforderlich, ist aber selbst nicht zuständig für die Replikation und Verpackung. Wenn ein Phagemid und Helferplasmid werden co-transformiert, haftet allein der Phagemid an der f1-Ursprung repliziert, verpackt und ausgeschieden werden. Die vektorisiert Phagemid ist dann zuständig Live E. zu infizieren coli über das F - Pilus. In diesem System wird der Schalldämpfungseffekt durch individuelle sRNA Kassetten Kombinieren einer Gerüstsequenz mit einem Target-Bindungssequenz erzeugt wird. Die Zielbindungssequenz ist 24 Basenpaare Antisense-mRNA zu einem Ziel, typischerweise an der Ribosomenbindungsstelle (RBS). Die Gerüstsequenz, entwickelt von Na und Kollegen 8 enthält eine Hfq-Bindungsmotiv aus micc extrahiert, eine kleine regulatorische RNA endogenen E. coli. Die Hfq Protein stimuliert RNA-RNA Binding und mRNA Degradation, eine Rolle in diesem System ähnlich RISC in RNAi dient. 1 zeigt ein komplettes System für den Phagen-vermittelter sRNA Niederschläge, inklusive der sRNA Kassettenstruktur, Phagemid Vektorisierung und Silencing - Mechanismus. Als ein Verfahren der Genexpression in E. modulieren coli, ist sRNA Silencing einfach, schnell und vielseitig. Die gezielte E. coli ist nicht über Ausbreiten des Phagemid und Expression des sRNA belastet. Dies kann im Rahmen der synthetischen Biologie oder der Grundlagenforschung in denen die Expression von größeren heterologe Konstrukte belasten können zelluläre Ressourcen 9 relevant sein. Phagemide mit neuen Ziele können mit einem einzigen PCR und geerntet einen Tag nach Phagemid Transformation hergestellt werden. Schließlich kann nahezu jede mRNA gerichtet werden. Die sRNA - Regulationskassette (auf einem Standard - Plasmid) wurde auf einer Vielzahl von Zielen in den Stoffwechsel mit typischen Repression Ebenen&gt; 90% 8 zu arbeiten , gezeigt. 10 Kassetten. Zuerst wird eine verpackte Phagemid zu einer Batch - Kultur von E. eingeführt coli Zellen und verwendete Ausdruck des fluoreszierenden Proteins mKate2 zum Schweigen zu bringen. Nachfolgende Fluoreszenzänderungen werden in Echtzeit überwacht. Zweitens Klopfen nach unten das CAT-Gen wird gezeigt, auf Agarplatten phänotypischen Resistenz gegen Chloramphenicol zu reduzieren. In beiden Fällen führt das Phagemid selbst ein GFP-Marker, so dass Infektionsrate unabhängig von der Zuschlagseffizienz gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzym</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helfer Phage</td><td></td><td>NEB N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F' Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage-vermittelte lieferung von targeted srna konstruiert down-gene nach knock expression in<em&gt; e. coli</em

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-vermittelte Niederschläge werden weithin zur Kontrolle der Genexpression verwendet. Diese vielseitige Familie von Techniken macht Gebrauch von kurzen RNA (sRNA), die mit jeder Sequenz synthetisiert werden kann, und gestaltet jedes Gen für silencing gezielt zu ergänzen. Weil sRNA Konstrukte können direkt auf vielen Zelltypen eingeführt werden, oder eine Vielzahl von Vektoren verwenden, können die Genexpression in lebenden Zellen ohne aufwendige genetische Veränderung unterdrückt werden. Die häufigste RNA Knockdown-Technologie, RNA-Interferenz (RNAi), nutzt die endogene RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) -Sequenz Erkennung und Spaltung der Ziel-mRNA zu vermitteln. Anwendungen dieser Technik sind daher auf RISC-exprimierenden Organismen beschränkt ist, in erster Linie Eukaryoten. Vor kurzem haben eine neue Generation von RNA Biotechnologen alternative Mechanismen entwickelt, die für die Genexpression durch RNA steuern und so möglich, die RNA-vermittelte Gen in Bakterien hergestellt Niederschlägen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Schweigen zu bringen Gen Expression in E. coli , die funktionell ähnlich RNAi. In diesem System wird ein synthetisches Phagemid wurde entwickelt sRNA auszudrücken, die entworfen können eine beliebige Sequenz abzuzielen. Das Expressionskonstrukt ist auf eine Population von E. zuge coli - Zellen mit nicht-lytische Phage M13, wonach es in der Lage ist , in stabiler Weise als ein Plasmid replizieren. Antisense - Ansatz und silencing der Ziel - mRNA durch die Hfq Protein endogen E. vermittelter coli. Dieses Protokoll umfasst Methoden für die Gestaltung der Antisense sRNA, die Konstruktion des Phagemid-Vektor, Verpackung des Phagemid in M13-Bakteriophagen, eine Live-Zellpopulation für eine Infektion der Vorbereitung und Durchführung der Infektion selbst. Das fluoreszierende Protein mKate2 und das Antibiotikaresistenz-Gen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) sind gezielte repräsentative Daten zu generieren und Zuschlags Wirksamkeit zu quantifizieren.

Silencing von mKate2 Fluoreszenz in flüssigen Medien Abbildung 1 zeigt das Schema für sRNA-vermittelten Knockdowns in dieser Arbeit beschrieben, einschließlich der sRNA Kassettenentwurf, Phagemid Vektorisierung und Silencing - Mechanismus. Nach Protokoll 1.2 wurde die sRNA-Silencing-Kassette von Plasmid pAB.001 verändert mKate Ziel. Die sRNA - Kassette wurde synthetisiert und kloniert in Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP, ein Geschenk von Monica Ortiz und Drew Endy 11. Dieses Phagemid trägt Marker für die GFP-Expression und Kanamycin-Resistenz, wodurch erfolgreiche Infektionen zu verfolgen. Verpackt Phagemid Bestände wurden folgende Protokoll 2 hergestellt. Ein Derivat von E. coli K12 MG1655 eine konstitutiv exprimiert, chromosomal integriert mKate2 Marker trägt , wurde für Phageninfektion durch Konjugation vorbereitet<html> mit einem F-Stamm Plasmid Spender folgende Protokoll 3. Die Zellen folgende Protokoll 4. Nach Phagemid Infektion bis Mitte der log-Phase und dem Phagemid eingeführt wurden gezüchtet wurden 200 &amp; mgr; l Kulturen auf einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät übertragen und Fluoreszenz wurde kontinuierlich für 24 Stunden überwacht. Abbildung 3 zeigt die Wirkung von sRNA-vermitteltes Silencing auf mKate2 Expression. Der Stamm infiziert mit einem Anti-mKate2 Phagemid zeigte keine nachweisbare mKate2 Fluoreszenz gegenüber dem Hintergrund. Im Gegensatz dazu hat dieser Stamm das GFP-Marker exprimieren, zeigen damit die erfolgreiche Aufnahme des Phagemid. Nicht infizierte Kontrollzellen mKate2 Fluoreszenz produziert, aber nicht GFP. Eine zusätzliche Steuerung, in dem die anti-mKate2 Targeting-Domäne mit einer Sequenz Targeting CAT ersetzt wurde, hatte keine Wirkung auf mKate2 Fluoreszenz. Silencing von Chloramphenicol-Resistenz auf Agar-Platten Inhalt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Nach Protokoll 1.1, eine sRNA - Silencing - Kassette wurde hergestellt CAT Ziel ein Derivat von E. coli K12 MG1655 ein konstitutiv exprimiert, chromosomal integrierte CAT Marker trägt , wurde vorbereitet. Phageninfektion durch Konjugation mit einem F-Plasmid Donorstamm folgende Protokoll 3. die Zellen bis mittleren log-Phase gezüchtet worden waren, und die Phagemid bei 37 ° C folgende Protokoll 4. nach 1 Stunde Inkubation eingeführt wurden infizierte Zellen seriell verdünnt und unter einer plattierten Bereich von Chloramphenicol-Konzentrationen. die Platten wurden durch Zählen von koloniebildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag über Nacht, und der Anteil der resistenten Zellen bei jeder Konzentration wurde bestimmt Chloramphenicol inkubiert. Figur 4 zeigt die Wirkung von sRNA-vermitteltes Silencing auf dem Chloramphenicol - Resistenz - Phänotyp. Nicht-infizierte Zellen oder Zellen infiziert mit Phagemid mKate2 Targeting, waren resistent gegenChloramphenicol bei allen getesteten Konzentrationen. Im Gegensatz dazu mit Phagemid Targeting CAT-infizierten Zellen zeigten Überleben bei niedrigen Konzentrationen Chloramphenicol reduziert und nahezu 99% bei höheren Konzentrationen zu töten. Die Zugabe von Ampicillin, für nur Bakterien zur Auswahl der Phagemid trägt, reduziert Chloramphenicol Überleben auf ein nicht nachweisbares Niveau. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten , dass die Flucht aus dem Phagen - Infektion zeigt eine gemeinsame Route 10 zu entkommen zum Schweigen zu bringen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Abbildung 1: Gene Silencing in E. coli mit sRNA - Expressionskassetten Lieferung von M13 Phage Die sRNA Kassette aus 4 Modulen zusammengesetzt ist. Die PR - Promotor (ein konstitutiver Promotor abgeleitet aus dem Bakteriophagen Lambda), eine 24 bp Targeting - Domäne, eine Hfq Bindungsdomäne von micc extrahiert und einen Transkriptionsterminator 8 </sup&gt;. Die Kassette wird in ein Phagemid eingebaut, um die M13 f1-Replikationsursprung trägt und in das M13-Kapsid mit dem Helfer-Phagen M13KO7 verpackt. Verpackt Phagemide sind in der Lage E. zu infizieren coli Expression des F - Pilus, wo sRNA Ausdruck beginnt. Die sRNA rekrutiert dann das Hfq Protein (in rot dargestellt) und bindet ein Antisense - mRNA Ziel in der Nähe der Ribosomen - Bindungsstelle, in translationale Repression und mRNA - Abbau führt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Primer - Design und zielgerichtete Mutagenese des sRNA Zielsite werden zwei Primer mit teilweise Homologie zu einer vorhandenen sRNA Kassette entworfen. Der Vorwärtsprimer enthält 20 bp homolog zu der pR-Promotor am 5&#39;-Ende, gefolgt von24 bp die neue Führungssequenz darstellt, dann 18 bp homolog zur Hfq-Bindungsdomäne an das 3&#39;-Ende. Der Reverse-Primer ist die genaue reversen Komplement des Vorwärtsprimers, mit Regionen der Homologie zu den bestehenden sRNA Kassette das reverse Komplement der neuen Führungssequenz flankieren. Exact Primersequenzen sind in Tabelle 3. Separate Einzelprimer - PCR - Reaktionen mit den Vorwärts- und den Rückwärtsprimer erzeugen lineare, einzelsträngige DNA mit der gewünschten modifizierten Sequenz. Das Glühen der Vorwärts- und Reaktionsprodukte umzukehren, nach Clean-up wie im Protokoll beschrieben, resultiert in doppelsträngiger Plasmid - DNA trägt die gewünschte modifizierte sRNA Kassette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Abbildung 3: Knockdown eines chromosomal integriert mKate2 Fluorescent Reporter. E. coli MG1655 K12 mKate2 exprimieren , wurden entweder unbehandelt gelassen (rote Linien und Balken), infiziert mit einem Anti-mKate2 Phagemid (grüne Linien und Balken) oder mit einer Steuer Phagemid Targeting CAT (blaue Linien und Balken) infiziert. (A) Unbehandelte E. coli stieg auf höhere Sättigungsdichte, eine metabolische Kosten Phageninfektion anzeigt. Die gepunkteten Linien zeigen die Standardabweichungen von drei Replikaten. (B) Das mKate2 Signal wurde reduziert , um in der Nähe von Hintergrundwerte in der Anti-mKate2 behandelten Stamm, aber nicht in Kontrollstämmen. (C) GFP - Fluoreszenz, die ebenfalls von dem Phagemid getragen nachweisbar war nur in Phagemid-behandelten Kontrollen. (D, E) Abschlussfluoreszenzmesswerte nach 24 h Wachstum OD normalisiert wurden. GFP-Signal, Phagemid Infektion anzeigt, war in unbehandelten Kontrollen fehlen, aber auch anti-CAT p folgende erheblich reduzierthagemid Behandlung. Dies kann Nebeneffekte des Phagemid zeigen. Das mKate2 Signal wurde von anti-mKate2 Phagemid Behandlung reduziert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die CAT-gezielte Steuerung Phagemid zeigte keine Wirkung auf mKate2 Fluoreszenz. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Replikaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Abbildung 4: Preissturz von CAT Stellt Chloramphenicol - Empfindlichkeit auf einen genetisch resistenten Population E.. coli MG1655 K12 eine chromosomal integrierte CAT - Gen exprimieren , wurden unbehandelt gelassen (rote Balken), mit einer Steuer Phagemid behandelt mKate2 (grüne Balken) Targeting oder mit einem Phagemid behandelt , um eine anti-CAT Srna (blaue Balken) ausdrückt. Nach 1 Stunde der Infektion, die Lebensfähigkeit auf der angezeigten antibiotics wurde durch serielle Verdünnungen und Galvanisieren bewertet. Stämme mit anti-CAT Phagemid behandelt wurden signifikant (&gt; 90%) von Chloramphenicol bei höheren Konzentrationen getötet, während Kontrollbehandlungen unbeeinflusst waren. Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturplatten wählt positiv für Phagemid-Infektion und beseitigt nicht-infizierten Zellen. Unter diesen Bedingungen wurde beobachtet, keine Chloramphenicol-resistenten Kolonien nach der anti-CAT-Behandlung. Dies zeigt, dass die meisten Überlebenden ein Versagen der Infektion darstellen, sondern als ein Ausfall silencing. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Replikaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> CAT TARGET-Sequenz </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> CAT Leitsequenz </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Ein Beispiel TARGET und Führungssequenz für das CAT - Gen Beachten Sie die reverse Komplement Beziehung. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pR-Promotor </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> Leitsequenz </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> Hfq Bindungsdomäne </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / TE terminator </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tabelle 2:. Sequence Komponenten der sRNA Cassette Jede Sequenz geschrieben 5&#39;-3 &#39;. Der komplette Kassette ist die Verkettung dieser vier Elemente in Ordnung und umfasst 292 bp. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Forward Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> Reverse Primer </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Primer Entwurf zu ändern Bestehende Leitelemente Der Vorwärts - Primer enthält die letzten 20 bp des pR - Promotor, die neue GUIDE - Sequenz und die ersten 18 bp des Hfq-Bindungsdomäne.. Die Zielsequenz ist das genaue Gegenteil Ergänzung des GUIDE-Sequenz. Der Reverse-Primer ist die genaue reversen Komplement des Vorwärtsprimers. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Templat-Plasmid </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M Primer </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTPs </td><td> 0,4 ul </td></tr><tr><td> High-Fidelity-Polymerase (2 U / ul) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 5x PCR-Puffer </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Empfohlene Bedingungen für die Single-Primer mutagene PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> anfängliche Denaturierung </td><td> 98 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 Zyklen </td><td> 98 ° C </td><td> 10 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 Sekunden </td></tr><tr><td> Finale Extension </td><td> 72 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Lagerung </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Empfohlene Thermocycler - Protokoll für die Einzel-Primer mutagene PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Template-DNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M Forward Primer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 &amp; mgr; M Reverse Primer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Taq 2X Master Mix </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> Nuklease-freies water </td><td> 23 &amp; mgr; l </td></tr><tr><td> Volle Lautstärke </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 6: Empfohlene Bedingungen für die Sequenzüberprüfung PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> anfängliche Denaturierung </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 Zyklen </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> Finale Extension </td><td> 68 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Lagerung </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 7: Empfohlene Thermocycler Prokoll für die Sequenzüberprüfung PCR.

Wir beschreiben eine Methode, um die Genexpression in einer wachsenden Population von E. coli-Zellen unter Verwendung sequenzgesteuerter sRNA-Expressionskassetten zu unterbinden, die von einem M13-Phagemid-Vektor abgegeben werden.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gene zu beseitigen, die für eine wachsende Population von E.coli von Interesse sind. Gen-Knockdowns werden häufig eingesetzt, um grundlegende Fragen der Genfunktion zu untersuchen. Diese Methoden können auch in der synthetischen Biologie Anwendung finden.Zum Beispiel, indem unerwünschte Gene wie Virulenzfaktoren zum Schweigen gebracht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in Chargenkulturen von E.coli ohne vorherige genetische Veränderung durchgeführt werden kann, wobei die Ergebnisse bereits nach wenigen Stunden sichtbar sind. Führen Sie zunächst unter Verwendung eines Plasmids, das eine sRNA-Expressionskassette enthält, die gemäß dem Textprotokoll entworfen wurde, eine ortsgerichtete Mutagenese an der Sequenz durch, indem Sie zunächst die 24-Basenpaar-Guide-Sequenz in der Expressionskassette identifizieren.Design und Synthese von Vorwärts- und Rückwärtsprimern mit kurzen Homologiebereichen zur bestehenden sRNA-Kassette, die die neue 24-Basenpaar-Guide-Sequenz flankieren. Bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur mit E.coli in LB und Antibiotika vor, die die Matrizen-sRNA-Expression Phagenmid tragen. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.Nach der Extraktion und Reinigung des Template-sRNA-Phagemids aus der Kultur bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen vor, bei denen die 10- bis 50-fache Menge an DNA-Template für das sRNA-Phagemid und die High-Fidelity-Polymerase verwendet wird. Bereiten Sie eine Reaktion mit dem Vorwärts- und eine mit dem Rückwärtsprimer vor. Nachdem Sie die Reaktionen unter Standard-PCR-Bedingungen durchgeführt haben, kombinieren Sie die beiden Reaktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen.Anschließend glühen Sie die Produkte, indem Sie sie in einem kochenden Wasserbad auf 98 Grad Celsius erhitzen. Schalten Sie die Wärmequelle sofort aus und lassen Sie das Bad in den nächsten ein bis zwei Stunden langsam wieder auf Raumtemperatur zurückkehren. Um die nicht mutierte Matrizen-sRNA zu eliminieren, fügen Sie der Mischung einen Mikroliter DpnI-Restriktionsenzym hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius oder für die vom Hersteller empfohlene Zeit für einen vollständigen Verdau.Als nächstes transformieren Sie chemisch kompetente E.coli-Zellen mit einem bis fünf Mikrolitern des geglühten PCR-Produkts. Isolieren Sie dann einzelne Kolonien durch selektives Plattieren auf LB-Platten mit Antibiotika. Um den Einbau der richtigen Leitsequenz mit der Kolonie-PCR zu überprüfen.Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine kleine Menge Zellen aus einer einzigen transformierten Kolonie zu sammeln. Die gesammelten Zellen werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser gegeben und durch Pipettieren gemischt. Dann lysieren Sie die Zellen mit einem Tisch-Thermocycler oder einem kochenden Wasserbad, indem Sie sie zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.Unter Verwendung eines Mikroliters der lysierten Zellen als DNA-Template führen Sie die PCR gemäß den hier gezeigten Bedingungen durch. Nachdem Sie die korrekte Leitsequenz überprüft haben, inokulieren Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur mit dem richtigen sRNA-Klon und züchten Sie die Zellen über Nacht. Bereiten Sie am nächsten Tag eine Glycerinbrühe vor, indem Sie 750 Mikroliter der Nachtkultur mit 250 Mikrolitern 60%igem Glycerin in einem Kryoröhrchen mit Schraubverschluss kombinieren.Zur Herstellung von M13-verpackten Phagenbrühen bereiten Sie eine fünf Milliliter lange Übernachtkultur von E. coli vor, die die sRNA-Expression Phagenmid trägt. Bereiten Sie außerdem eine Fünf-Milliliter-Übernachtkultur mit E.coli vor, die das M13KO7-Helferplasmid enthält. Am folgenden Tag, nach der Reinigung der DNA, co-transformieren Sie chemisch kompetente E.coli mit je einem Mikroliter des sRNA-Expressionsphagen und des Helferplasmids.Platte auf LB-Agar mit Antibiotika zur Auswahl für beide Konstrukte. Die Phagemid-Expression ist eine große Fitnessbelastung für die Zellen und kann zu einer verminderten Transformationseffizienz führen. Es kann notwendig sein, das Plasmid in zwei aufeinanderfolgenden Transformationsschritten einzuführen.Nachdem Sie die transformierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, bereiten Sie eine 10-Milliliter-Kultur aus einer einzigen Kolonie des co-transformierten Stammes vor. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Kultur bei 3300 x g für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn durch einen 0,2-Mikron-Filter.Lagern Sie das verpackte Phagemidfiltrat bei vier Grad Celsius. Nach der Präparation der F+-Zielzellen gemäß dem Textprotokoll wird eine einzelne Kolonie in eine Fünf-Milliliter-Kultur aus LB-Medium mit Antibiotika geimpft und über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln gezüchtet. Verwenden Sie am nächsten Tag fünf Milliliter selektives LB-Medium, um die F+-Zielzellen ein bis hundert zu verdünnen, und setzen Sie die Inkubation fort.Kultivieren Sie die Zellen etwa zwei Stunden lang, bis ein OD600 von 0,3 erhalten wird, was auf ein Wachstum in der logarithmischen Phase hinweist. Zellen, die für das Silencing vorgesehen sind, sollten sich in einer exponentiellen Phase befinden, in der die Expression der F-Pilus-Stille für eine effiziente Phagemid-Infektion stattfindet. Fügen Sie den Zielzellen ein Verhältnis von eins zu hundert von M13-verpackten Phagemiden hinzu, um eine Infektion der Zielpopulation von fast 99 % zu erreichen.Lassen Sie die Infektion bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 30 bis 60 Minuten fortschreiten. Untersuchen Sie dann den sRNA-Silencing-Phänotyp wie gewünscht. Gemäß dem in diesem Video gezeigten Protokoll wird die sRNA-Silencing-Kassette des Plasmids pAB.001 wurde in target to mKate2 geändert. Diese Abbildung zeigt, dass der mit dem Anti-mKate2-Phagemid infizierte E.coli-Stamm keine nachweisbare mKate2-Fluoreszenz über dem Hintergrund zeigte. Dieser Stamm exprimierte jedoch GFP, was auf eine erfolgreiche Aufnahme des Phagenmids hinweist.In diesem Experiment wurde ein E.coli-Stamm mit einer chromosomal integrierten Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT-Gen) mit einem Phagemid infiziert, das auf CAT abzielt, und es wurde das sRNA-Silencing der Chloramphenicol-Resistenz getestet. Zellen, in denen das Phagemid auf CAT abzielte, zeigten bei niedrigen Chloramphenicol-Konzentrationen ein verringertes Überleben und bei höheren Konzentrationen eine Tötung von fast 99 %. Auf der anderen Seite waren nicht infizierte Zellen oder Zellen, die mit sRNA infiziert waren, die mKate2 zum Schweigen brachte, in allen getesteten Konzentrationen resistent gegen Chloramphenicol.Wie hier gezeigt, reduzierte die Zugabe von Ampicillin, das zur Selektion nur von Bakterien verwendet wird, die das Phagenmid tragen, das Überleben von Chloramphenicol auf ein nicht nachweisbares Niveau. Die Veränderung des sRNA-Zielgens und die Produktion infizierter Phagemiden kann in fünf Tagen erfolgen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phagen für andere Experimente im Labor äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung spezieller Laborgeräte, um eine unerwünschte Kontamination zu vermeiden.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man infizierte Phagenmide entwirft, kloniert und produziert, die eine sRNA tragen, um jedes Gen von Interesse in einer aktiv wachsenden Population von E.coli auszuschalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Für die Entwicklung der RNA-Interferenz (RNAi)-basierte Therapien, wurde eine neue Strategie entwickelt, transkingdom RNAi (tkRNAi). Diese Technologie nutzt nicht-pathogenen Bakterien zu produzieren und zu liefern therapeutische kurze Haarnadel-RNA (shRNA) in Zielzellen. Hier wurde tkRNAi erfolgreich Umkehrung der klassischen ABCB1-vermittelte Multidrug-Resistenz (MDR) von Krebszellen eingesetzt.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

Dieses Video beschreibt die Prinzipien hinter der RNAi-Behandlung in C. elegans und demonstriert ein Protokoll zum Knockdown von lin-35 in einem transgenen Wurmstamm.

RNAi-Plating für die Fütterung von C. elegans: Eine Technik zur Induktion der Ziel-dsRNA-Expression in E. coli

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Dieses Video zeigt ein auf CRISPR-Interferenz basierendes Gen-Silencing in pathogenen Leptospiren. Die gezielte Unterdrückung der Genexpression mit einem CRISPR/Cas-System, das die mRNA-Bildung blockiert, hilft bei der Identifizierung von Kandidatengenen für pathologische und pharmakologische Studien.

CRISPR-Interferenz-basiertes Gen-Silencing: Eine Technik zur gezielten Unterdrückung der Genfunktion in pathogenen Leptospiren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Hier wird die Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) für spezifisches Gen-Silencing bei Leptospira-Spezies beschrieben. Leptospira-Zellen werden durch Konjugation mit Plasmiden transformiert, die dCas9 (katalytisch "totes" Cas9) und eine Single-Guide-RNA (sgRNA) exprimieren, die für die Basenpaarung zum gewünschten genomischen Ziel verantwortlich ist. Methoden zur Validierung des Gen-Silencing werden vorgestellt.

Anwendung der CRISPR-Interferenz (CRISPRi) zur Gen-Silencing bei pathogenen Leptospira-Spezies

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Lernen Sie die phagenvermittelte Lieferung von sRNA-Kassetten zur Gen-Knockdown in E. coli. Diese Methode ermöglicht schnelles Gen-Silencing in Batch-Kulturen ohne vorherige genetische Modifikation.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in

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