Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in E. coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gene zu beseitigen, die für eine wachsende Population von E.coli von Interesse sind. Gen-Knockdowns werden häufig eingesetzt, um grundlegende Fragen der Genfunktion zu untersuchen. Diese Methoden können auch in der synthetischen Biologie Anwendung finden.

Zum Beispiel, indem unerwünschte Gene wie Virulenzfaktoren zum Schweigen gebracht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in Chargenkulturen von E.coli ohne vorherige genetische Veränderung durchgeführt werden kann, wobei die Ergebnisse bereits nach wenigen Stunden sichtbar sind. Führen Sie zunächst unter Verwendung eines Plasmids, das eine sRNA-Expressionskassette enthält, die gemäß dem Textprotokoll entworfen wurde, eine ortsgerichtete Mutagenese an der Sequenz durch, indem Sie zunächst die 24-Basenpaar-Guide-Sequenz in der Expressionskassette identifizieren.

Design und Synthese von Vorwärts- und Rückwärtsprimern mit kurzen Homologiebereichen zur bestehenden sRNA-Kassette, die die neue 24-Basenpaar-Guide-Sequenz flankieren. Bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur mit E.coli in LB und Antibiotika vor, die die Matrizen-sRNA-Expression Phagenmid tragen. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Nach der Extraktion und Reinigung des Template-sRNA-Phagemids aus der Kultur bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen vor, bei denen die 10- bis 50-fache Menge an DNA-Template für das sRNA-Phagemid und die High-Fidelity-Polymerase verwendet wird. Bereiten Sie eine Reaktion mit dem Vorwärts- und eine mit dem Rückwärtsprimer vor. Nachdem Sie die Reaktionen unter Standard-PCR-Bedingungen durchgeführt haben, kombinieren Sie die beiden Reaktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Anschließend glühen Sie die Produkte, indem Sie sie in einem kochenden Wasserbad auf 98 Grad Celsius erhitzen. Schalten Sie die Wärmequelle sofort aus und lassen Sie das Bad in den nächsten ein bis zwei Stunden langsam wieder auf Raumtemperatur zurückkehren. Um die nicht mutierte Matrizen-sRNA zu eliminieren, fügen Sie der Mischung einen Mikroliter DpnI-Restriktionsenzym hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius oder für die vom Hersteller empfohlene Zeit für einen vollständigen Verdau.

Als nächstes transformieren Sie chemisch kompetente E.coli-Zellen mit einem bis fünf Mikrolitern des geglühten PCR-Produkts. Isolieren Sie dann einzelne Kolonien durch selektives Plattieren auf LB-Platten mit Antibiotika. Um den Einbau der richtigen Leitsequenz mit der Kolonie-PCR zu überprüfen.

Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine kleine Menge Zellen aus einer einzigen transformierten Kolonie zu sammeln. Die gesammelten Zellen werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser gegeben und durch Pipettieren gemischt. Dann lysieren Sie die Zellen mit einem Tisch-Thermocycler oder einem kochenden Wasserbad, indem Sie sie zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen.

Unter Verwendung eines Mikroliters der lysierten Zellen als DNA-Template führen Sie die PCR gemäß den hier gezeigten Bedingungen durch. Nachdem Sie die korrekte Leitsequenz überprüft haben, inokulieren Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur mit dem richtigen sRNA-Klon und züchten Sie die Zellen über Nacht. Bereiten Sie am nächsten Tag eine Glycerinbrühe vor, indem Sie 750 Mikroliter der Nachtkultur mit 250 Mikrolitern 60%igem Glycerin in einem Kryoröhrchen mit Schraubverschluss kombinieren.

Zur Herstellung von M13-verpackten Phagenbrühen bereiten Sie eine fünf Milliliter lange Übernachtkultur von E. coli vor, die die sRNA-Expression Phagenmid trägt. Bereiten Sie außerdem eine Fünf-Milliliter-Übernachtkultur mit E.coli vor, die das M13KO7-Helferplasmid enthält. Am folgenden Tag, nach der Reinigung der DNA, co-transformieren Sie chemisch kompetente E.coli mit je einem Mikroliter des sRNA-Expressionsphagen und des Helferplasmids.

Platte auf LB-Agar mit Antibiotika zur Auswahl für beide Konstrukte. Die Phagemid-Expression ist eine große Fitnessbelastung für die Zellen und kann zu einer verminderten Transformationseffizienz führen. Es kann notwendig sein, das Plasmid in zwei aufeinanderfolgenden Transformationsschritten einzuführen.

Nachdem Sie die transformierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, bereiten Sie eine 10-Milliliter-Kultur aus einer einzigen Kolonie des co-transformierten Stammes vor. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Kultur bei 3300 x g für 10 Minuten. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn durch einen 0,2-Mikron-Filter.

Lagern Sie das verpackte Phagemidfiltrat bei vier Grad Celsius. Nach der Präparation der F+-Zielzellen gemäß dem Textprotokoll wird eine einzelne Kolonie in eine Fünf-Milliliter-Kultur aus LB-Medium mit Antibiotika geimpft und über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln gezüchtet. Verwenden Sie am nächsten Tag fünf Milliliter selektives LB-Medium, um die F+-Zielzellen ein bis hundert zu verdünnen, und setzen Sie die Inkubation fort.

Kultivieren Sie die Zellen etwa zwei Stunden lang, bis ein OD600 von 0,3 erhalten wird, was auf ein Wachstum in der logarithmischen Phase hinweist. Zellen, die für das Silencing vorgesehen sind, sollten sich in einer exponentiellen Phase befinden, in der die Expression der F-Pilus-Stille für eine effiziente Phagemid-Infektion stattfindet. Fügen Sie den Zielzellen ein Verhältnis von eins zu hundert von M13-verpackten Phagemiden hinzu, um eine Infektion der Zielpopulation von fast 99 % zu erreichen.

Lassen Sie die Infektion bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 30 bis 60 Minuten fortschreiten. Untersuchen Sie dann den sRNA-Silencing-Phänotyp wie gewünscht. Gemäß dem in diesem Video gezeigten Protokoll wird die sRNA-Silencing-Kassette des Plasmids pAB.

001 wurde in target to mKate2 geändert. Diese Abbildung zeigt, dass der mit dem Anti-mKate2-Phagemid infizierte E.coli-Stamm keine nachweisbare mKate2-Fluoreszenz über dem Hintergrund zeigte. Dieser Stamm exprimierte jedoch GFP, was auf eine erfolgreiche Aufnahme des Phagenmids hinweist.

In diesem Experiment wurde ein E.coli-Stamm mit einer chromosomal integrierten Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT-Gen) mit einem Phagemid infiziert, das auf CAT abzielt, und es wurde das sRNA-Silencing der Chloramphenicol-Resistenz getestet. Zellen, in denen das Phagemid auf CAT abzielte, zeigten bei niedrigen Chloramphenicol-Konzentrationen ein verringertes Überleben und bei höheren Konzentrationen eine Tötung von fast 99 %. Auf der anderen Seite waren nicht infizierte Zellen oder Zellen, die mit sRNA infiziert waren, die mKate2 zum Schweigen brachte, in allen getesteten Konzentrationen resistent gegen Chloramphenicol.

Wie hier gezeigt, reduzierte die Zugabe von Ampicillin, das zur Selektion nur von Bakterien verwendet wird, die das Phagenmid tragen, das Überleben von Chloramphenicol auf ein nicht nachweisbares Niveau. Die Veränderung des sRNA-Zielgens und die Produktion infizierter Phagemiden kann in fünf Tagen erfolgen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phagen für andere Experimente im Labor äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung spezieller Laborgeräte, um eine unerwünschte Kontamination zu vermeiden.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man infizierte Phagenmide entwirft, kloniert und produziert, die eine sRNA tragen, um jedes Gen von Interesse in einer aktiv wachsenden Population von E.coli auszuschalten.