Methodenartikel

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

DOI:

10.3791/53620

⸱

27. Januar 2016

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben hier einen Test durch Kopplung DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikation (DAMiD), um Hochdurchsatz-Sequenzierung (DAMiD-seq). Dieses verbesserte Verfahren bietet eine höhere Auflösung und einen größeren Dynamikbereich und erlaubt die Analyse DAMiD-seq Daten in Verbindung mit anderen Hochdurchsatz-Sequenzierung Daten wie ChIP-seq, RNA-seq usw.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikationsassay (DamID) ist eine leistungsstarke Methode, um Protein-DNA-Wechselwirkungen sowohl lokal als auch genomweit zu erkennen. Es handelt sich um einen alternativen Ansatz zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Ein exprimiertes Fusionsprotein, bestehend aus dem interessierenden Protein und der E. coli-DNA-Adenin-Methyltransferase, kann die Adeninbase in GATC-Motiven in der Nähe der Stellen der Protein-DNA-Wechselwirkungen methylieren. Adenin-methylierte DNA-Fragmente können dann spezifisch amplifiziert und nachgewiesen werden. Der ursprüngliche DamID-Assay detektiert die genomischen Positionen von methylierten DNA-Fragmenten durch Hybridisierung mit DNA-Microarrays, was durch die Verfügbarkeit von Microarrays und die Dichte vorgegebener Sonden begrenzt ist. In diesem Artikel berichten wir über das detaillierte Protokoll zur Integration der Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung in DamID (DamID-seq). Die große Anzahl von Short Reads, die aus DamID-seq generiert werden, ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen im gesamten Genom mit hoher Präzision und Sensitivität. Wir haben den DamID-seq-Assay verwendet, um Genom-Kern-Lamina-Interaktionen (NL) in Säugetierzellen zu untersuchen, und haben festgestellt, dass DamID-seq eine hohe Auflösung und einen großen dynamischen Bereich bei der Detektion von Genom-NL-Interaktionen bietet. Der DamID-seq-Ansatz ermöglicht die Untersuchung von NL-Assoziationen innerhalb von Genstrukturen und ermöglicht den Vergleich von Genom-NL-Interaktionskarten mit anderen funktionellen genomischen Daten, wie z.B. ChIP-seq und RNA-seq.

Einleitung

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DNA-Methyltransferase-Adenin-Identifikation (DAMiD) 1,2 ist eine Methode, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu detektieren und ist ein alternativer Ansatz zur Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) 3. Es verwendet eine relativ geringe Menge an Zellen und keine chemische Vernetzung des Proteins mit der DNA oder einem hochspezifischen Antikörpers erforderlich. Letzteres ist insbesondere dann hilfreich, wenn das Zielprotein ist lose oder indirekt mit DNA verbunden. DAMiD wurde erfolgreich verwendet, um die Bindungsstellen aus einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich Kernhüllenproteine ​​4-10, Chromatin-assoziierte Proteine ​​11-13, Chromatin modifizierender Enzyme 14, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren und 15-18 RNAi Maschinen 19 abzubilden. Das Verfahren ist in mehreren Organismen, einschließlich S. erhoben cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 sowie Maus und humanen Zelllinien 6,8,10,23,24.

Die Entwicklung des DAMiD Assay wurde auf den spezifischen Nachweis von Adenin-methylierten DNA-Fragmente in eukaryontischen Zellen, die endogene Adenin-Methylierung 2 fehlt basiert. Ein exprimiertes Fusionsprotein, bestehend aus der DNA-bindenden Proteins von Interesse und E. coli DNA-Adenin-methyltransferase (Dam), können die Adeninbase in GATC-Sequenzen, die in räumlicher Nähe befinden (am deutlichsten in 1 kb und bis zu etwa 5 kb) an die Bindungsstellen des Proteins in das Genom 2 methylieren. Die modifizierten DNA-Fragmenten, spezifisch amplifiziert und hybridisiert werden, um Mikroarrays, um die genomische Bindungsstellen des Proteins von Interesse 1,25,26 zu erfassen. Diese ursprüngliche DAMiD Verfahren wurde durch die Verfügbarkeit von Mikroarrays und der Dichte des vorbestimmten Sonden beschränkt. Daher haben wir in integrierten Hochdurchsatz-Sequenzierungum DAMiD 10 und bezeichnet das Verfahren, wie DAMiD-seq. Die große Anzahl von kurzen liest aus DAMiD-seq generiert ermöglicht eine präzise Lokalisierung von Protein-DNA-Interaktionen Genom-weiten. Wir fanden, dass DAMiD-seq vorgesehen eine höhere Auflösung und einen breiteren Dynamikbereich als DAMiD von Mikroarray für die Untersuchung genom Kernlamina (NL) 10 Verbände. Dieses verbesserte Verfahren ermöglicht Sondieren NL Assoziationen innerhalb Genstrukturen 10 und erleichtert den Vergleich mit anderen Hochdurchsatz-Daten, wie Chip-seq und RNA-seq.

Die hier beschriebene DAMiD-seq-Protokoll wurde ursprünglich für Mapping-Genom-NL Verbände 10 entwickelt. Wir erzielten ein Fusionsprotein angebunden Maus oder Mensch Lamin B1 bis E. coli DNA-Adenin-Methyltransferase und getestet, das Protokoll in 3T3 embryonalen Maus-Fibroblasten, Myoblasten C2C12 Maus 10 und IMR90 menschlichen fötalen Lungenfibroblasten (Daten nicht veröffentlicht). In diesem Protokoll, beginnen wir mit constructing Vektoren und ausdrücken Dam-gebundenen Fusionsproteine ​​durch lentivirale Infektion in Säugetierzellen 24. Als nächstes beschreiben wir die ausführliche Protokolle zum Verstärken Adenin-methylierten DNA-Fragmente und Sequenzierung vorbereitet Bibliotheken, die in anderen Organismen anwendbar sein sollte.

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Protokoll

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1. Erzeugung und Expression von Fusionsproteinen und Free Dam Proteine

  1. Klon Protein von Interesse in das DAMiD Vektor.
    1. Amplifizieren cDNA des Proteins von Interesse (POI) mit dem gewünschten High Fidelity DNA-Polymerase und geeignete Primer gemäß dem Protokoll des Herstellers. Optimale Verstärkung Bedingungen experimentell zu bestimmen, um eine ordnungsgemäße Verstärkung der Einsätze zu gewährleisten.
    2. Führen Sie ein Agarose-Gel und zu reinigen, amplifizierte cDNA der POI von der Gelextraktionskit nach dem Protokoll des Herstellers.
    3. Clone cDNA des POI in die pDONR201 Vektor unter Verwendung BP Clonase II nach dem Protokoll des Herstellers.
    4. Klonen Sie die cDNA von POI aus dem Donor-Vektor in die PLGW-RFC1-V5-EcoDam Zielvektor oder der PLGW-EcoDam-V5-RFC1 Zielvektor 27 mit LR Clonase II nach dem Protokoll des Herstellers, abhängig von der gewünschten Richtung der Verschmelzung POI an den N-Terminus oder the C-Terminus des E. coli DNA-Adenin-Methyltransferase (EcoDam) 27.
    5. Überprüfen, die durch Sequenzierung der klonierten cDNA hat einen richtigen Reihenfolge und Formen in-frame Fusion an EcoDam.
  2. Generieren lentiviralen Aktien.
    1. Generieren lentiviralen Aktien zum Ausdruck Dam-V5-POI und V5-Dam (vom PLGW-V5-EcoDam Vektor 27) unter Verwendung von lentiviralen Expressionssysteme. Verwenden Sie den Vorwärts Transfektionsverfahren nach dem Protokoll des Herstellers.
      1. Verwenden 293T Zellen und Lipofektion lentivirale Bestände nach dem Protokoll des Herstellers für die Transfektion zu erzeugen.
      2. Fügen Sie die 0,45 um PVDF Filterstufe.
  3. Infizieren Zellen mit Lentivirus.
    1. Am Tag vor der Infektion (Tag 0), vorbei an adhärenten Zellen in geeigneten Nährmedien kultiviert diesen Zelltyp zu einer 6-Well-Gewebekulturplatte unter Verwendung der gleichen Wachstumsmedium ohne Antibiotikaerreichen 50% Konfluenz am Tag der Infektion. Ortszellen in einem 37 ° C Inkubator.
    2. Am Tag der Infektion (Tag 1), entfernen 2 Kryoröhrchen von dem Dam-V5-POI und V5-Dam lentiviralen Stände aus einem -80 ° C Gefrierschrank und in einem 37 ° C Wasserbad auftauen.
      1. Entfernen Wachstumsmedien von Zellen und ersetzen Sie sie durch 0,5 ml frisches Wachstumsmedium ohne Antibiotika.
      2. 1 ml der aufgetauten Lentivirus in jede Vertiefung (2 Wells mit V5-Dam und 2 Brunnen mit Dam-V5-POI). 1 ml Wachstumsmedium ohne Antibiotika auf die verbleibenden 2 Vertiefungen-Dies wird als Negativkontrolle zu dienen. Schütteln Sie die Platte mit 6 Vertiefungen zu mischen und platzieren Sie zurück in einem 37 ° C Inkubator O / N.
    3. Der Tag nach der Infektion (Tag 2), entfernen Sie Virus-Suspensionen von Zellen und ersetzen mit 2 ml Wachstumsmedium ohne Antibiotika. Ortszellen wieder in einem 37 ° C Inkubator für 48 Stunden.
  4. Isolieren gDNA.
    1. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung und detach Zellen unter Verwendung von 250 ul 0,05% Trypsin-EDTA. Inkubieren bei 37 ° C für 2 min.
    2. Wash-Zellen von der Platte mit 1 ml Wachstumsmedium und Pipetten Zellen aus jedem Well in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei RT.
    3. Waschen pelletierten Zellen mit 500 ul PBS und Zentrifugation bei 200 × g für 2 min bei RT.
    4. Sedimentierte Zellen in 200 ul PBS.
    5. Isolieren gDNA von Blut und Gewebe-Kit nach Vorschrift des Herstellers. Eluieren gDNA in 200 ul Puffer AE und bestimmen die Konzentration durch Messung der OD 260 unter Verwendung eines Spektrophotometers.
      Hinweis: gDNA von nicht infizierten oder mock-infizierten Zellen können als negative Kontrollen isoliert werden. Auszufällen gDNA zu höheren Konzentrationen für langfristige Lagerung.
      1. Werden 3 Volumina 100% Ethanol und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und durch Umschütteln Rohre 4-6 mal.
      2. Lagerung bei -20 ° CO / N.
      3. Zentrifuge bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
      4. Den Überstand vorsichtig entfernen. Waschen Pellets mit 70% (Volumen / Volumen) Ethanol und Zentrifugieren bei 16.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
      5. Ethanol Entfernen Sie vorsichtig und lassen Pellets an der Luft trocknen für 3 min bei RT.
      6. Aufzulösen gDNA in T 10 E 0,1 (pH 7,5) auf ungefähr 1 ug / ul. Pool gDNA aus jeder Versuchsprobe oder der negativen Kontrolle und Messung der Konzentration. Lagerung bei -20 ° C.

2. Amplify Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

  1. Digest gDNA mit DpnI, die nur schneidet Adenin-methylierten GATCs.
    1. Eine Reaktion auf Eis mit 2,5 ug gDNA, 1 ul 10x-Puffer, 0,5 & mgr; l DpnI (20 U / ul) und Fülleigenschaften mit H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 10 ul. Für jede Probe gDNA, bereiten drei Reaktionen - eine ohne DpnI ("no DpnI", ersetzen Sie DpnI mit 0,5 & mgr; l H 2 O) und zwei with DpnI ("mit DpnI").
    2. Digest O / N bei 37 ° C inaktiviert DpnI bei 80 ° C für 20 min.
  2. Ligieren DAMiD Adapter.
    1. Bereiten DAMiD Adapter.
      1. Resuspendieren jeder der beiden DAMiD Adapter Oligos 24 in H 2 O zu einer Endkonzentration von 100 uM.
      2. Kombinieren Sie gleiche Volumina der beiden DAMiD Adapter Oligos, mischen und in einem dicht geschlossenen Rohr. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm, sitzen in einem Gestell und in ein Becherglas mit Wasser bei 90 ° C gefüllt. Halten der Wasserstand unter dem Deckel des Rohres (Wasser vermeidet, in der Röhre), aber über der Oberfläche der Oligo-Mix.
      3. Lassen Sie das Wasser auf RT abkühlen, so dass die Adapter Glühen langsam.
      4. Aliquot der geglühten Adaptern (50 uM) und bei -20 ° C.
    2. Eine Reaktion auf Eis gesetzt. In jedes Röhrchen aus 2.1.2, fügen 6,2 & mgr; l H 2 O, 2 ul 10x Ligationspuffer, 0,8 ul 50 uM DAMiD adaptors (auf Eis aufgetaut) und 1 ul T4 DNA Ligase (5 U / ul). Das Gesamtvolumen beträgt 20 & mgr; l. In einem der beiden "mit DpnI" Rohre ersetzen Ligase mit 1 & mgr; l H 2 O ("no-Ligase") Beachten Sie, dass jedes gDNA Probe hat zwei negative Kontrollen -. "Keine DpnI" und "nicht-Ligase".
    3. Ligat O / N bei 16 ° C und inaktivieren Ligase bei 65 ° C für 10 min.
  3. Digest-DNA mit DpnII um Fragmente, die nicht methylierten GATCs enthalten zerstören.
    1. Eine Reaktion auf Eis gesetzt. In jeder Röhre von 2.2.3, fügen 24 ul H & sub2; O, 5 ul 10x DpnII-Puffer und 1 ul DpnII (10 U / ul). Das Gesamtvolumen beträgt 50 & mgr; l.
    2. Verdau bei 37 ° C für 2-3 h, und inaktivieren DpnII bei 65 ° C für 20 min.
  4. Verstärken Adenin-methylierten DNA-Fragmente.
    1. Einrichten einer Reaktions auf Eis mit 5 ul DpnII von 2.3.2, 5 μ verdauenl 10x PCR-Puffer, 12,5 ul 5 uM DAMiD PCR-Primer 24, 4 & mgr; l 10 mM dNTP Mix, 1 ul 50x Polymerase-Mix und 22,5 & mgr; l H 2 O. Das Gesamtvolumen beträgt 50 & mgr; l.
    2. Führen Sie die PCR wie folgt: 68 ° C für 10 min; 94 ° C für 1 min, 65 ° C für 5 min, 68 ° C für 15 min; 4 Zyklen bei 94 ° C für 1 min, 65ºC für 1 min, 68 ° C für 10 min; 17 Zyklen von 94ºC für 1 min, 65ºC für 1 min, 68 ° C für 2 min.
    3. Analyse 5 & mgr; l PCR-Produkte aus jeder Reaktion auf einem 1% Agarosegel. PCR-Produkte sollten als Abstrich von 0,2 bis 2 kb (Abbildung 2) angezeigt. Die "no DpnI" und "nein Ligase" Kontrollen sollten keine oder deutlich weniger Verstärkung.
    4. Wenn das Ergebnis aus Schritt 2.4.3 zufriedenstellend ist, wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.3 mit zwei oder drei Reaktionen für die Versuchsprobe und eine Reaktion für jede der beiden negativen Kontrollen.
    5. Pool und Reinigung PCR Produkte aus derselbenVersuchsprobe unter Verwendung der PCR-Reinigungs-Kits oder festen Phase reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers. Reinigen Sie nicht "keine DpnI" oder "nein Ligase" Kontrollen. Eluieren der DNA mit Puffer EB.
    6. Messung der Konzentration der gereinigten DNA durch Messung der OD 260 unter Verwendung eines Spektrophotometers, das etwa 0,1 ug / ul oder höher sein sollte. Sammeln von mindestens 10 & mgr; g DNA für jede Probe. Bei der Verwendung von PCR-Reinigungs-Kits, reinigen, je 50 & mgr; l PCR-Produkte mit einer Säule, eluiert in 30 ul Puffer EB und Pool der Eluate.
  5. Digest-DNA mit DpnII zu DAMiD PCR-Primer aus sequenziert verhindern.
    1. Bis eine Reaktion auf Eis mit 5 ug gereinigte DNA von 2.4.6, 5 ul 10x DpnII Puffer, 1 ul DpnII (10 U / ul) und Fülleigenschaften mit H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 ul. Vorbereitung zwei oder drei Reaktionen für jede Probe.
    2. Verdauen bei 37 ° C für 2-3 Stdund inaktivieren DpnII bei 65 ° C für 20 min.
    3. Pool und Reinigung der Verdaus aus der gleichen Probe mit der PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA mit Puffer EB.
    4. Messung der Konzentration der gereinigten DNA, das um 0,06 & mgr; g / & mgr; l oder höher sein sollte. Sammeln von mindestens 6 & mgr; g DNA für jede Probe. Bei der Verwendung von PCR-Reinigungs-Kits, reinigen jeweils 50 ul mit einer Spalte zu verdauen, zu eluieren in 30 ul Puffer EB und Pool der Eluate.

3. Bibliothek Vorbereitung zum Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. DNA-Fragment,
    1. Experimentell die geeignete Aufschlusszeit für jede neue Charge von dsDNA Fragmentase. Da die Enzymaktivität über die Zeit zu verringern, wiederholen Sie den Test, bevor Sie ein neues Experiment. DNA von 2.5.4 für die tatsächliche Fragmentierung zu speichern, verwenden gereinigte Methyl PCR-Produkte von 2.4.6 oder zusätzliche DNA aus früheren Experiments bei diesem Schritt.
      1. Einen Master-Mix mit 6 ug DNA, 12 ul 10x Fragmentase Puffersatz füllen und mit H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 114 & mgr; l.
      2. Vortex die Fragmentase Vorratsröhrchen für 3 Sekunden, fügen Sie 6 & mgr; l in die Master-Mix und Vortex den Master-Mix für 3 Sekunden. Das Gesamtvolumen beträgt 120 ul.
      3. Aliquot 20 ul des Master-Mix zu jedem der 5 neuen Röhren. Alle 6-Röhrchen bei 37 ° C für 5 bis 55 min bei einer Schrittweite von 10 min inkubiert. Werden 5 ul 0,5 M EDTA zum Stoppen der Reaktion.
      4. Analyse 12,5 ul verdauen (0,5 ug DNA) jeder Reaktion sowie 0,5 ug unverdaute DNA auf einem Agarosegel (Abbildung 3). Bestimmen Sie die minimale Zeit (T 0.2kb) benötigt, um den Großteil der Abstrich auf etwa 0,2 kb zu verdauen. Wählen Sie 6 Zeitdauern zwischen 5 min und T 0.2kb (einschließlich 5 min und T 0.2kb) mit gleichen Schritten für die tatsächliche Fragmentierung.
    2. Richten Sie die tatsächlichen Fragmentierungtation wie in 3.1.1.1-3.1.1.3 beschrieben. Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C für die Zeitdauern in 3.1.1.4 ermittelt.
    3. Pool 6 Reaktionen und Reinigung der Verdauungsprodukte mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 51 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 50 & mgr; l.
  2. Reparatur endet der fragmentierte DNA
    1. Eine Reaktion auf Eis mit dem Eluat aus 3.1.3, 25 & mgr; l H 2 O eingestellt, 10 ul 10x T4 DNA-Ligase-Puffer mit 10 mM ATP, 4 ul 10 mM dNTP-Mix, 5 ul T4-DNA-Polymerase (3 U / ul) 1 ul Klenow-DNA-Polymerase (5 U / ul) und 5 ul T4-Polynukleotid-Kinase. Das Gesamtvolumen beträgt 100 ul. Gut mischen mit Pipette. Schaum und Blasen vermeiden.
    2. Inkubieren bei 20 ° C für 30 min.
    3. Reinigen der DNA mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 33 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 32 & #181; l.
  3. In "A" Überhänge
    1. Bis eine Reaktion auf Eis mit dem Eluat aus 3.2.3 5 ul 10x Klenow-Puffer, 10 ul 1 mM dNTP, und 3 & mgr; l Klenow (3 '→ 5'-Exo-) (5 U / ul) eingestellt. Das Gesamtvolumen beträgt 50 & mgr; l. Gut mischen mit Pipette. Schaum und Blasen vermeiden.
    2. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min.
    3. Reinigen der DNA mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 22 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 21 & mgr; l.
  4. Ligat Sequenzierung Adapter
    1. Bereiten Sequenzierung Adapter 28.
      1. Resuspendieren jeden Adapter Oligo auf eine Konzentration von 100 uM in 10 mM Tris-Cl (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) und 50 mM NaCl.
      2. Mischen Sie gleiche Volumina der Universal-Adapter 28 und einem indizierten Adapter 28.
      3. Annealing der Adapter in einem Thermocycler mit folgendemProgramm: 95 ° C für 2 min; 140 Zyklen für 30 Sekunden beginnend bei 95 ° C und verringert sich um 0,5 ° C pro Zyklus; Halten bei 4 ° C.
      4. Aliquot Adaptern und bei -20 ° C.
    2. Eine Reaktion auf Eis mit dem Eluat aus 3.3.3, 25 ul 2x Ligationspuffer, 1,5 ul 50 uM geglüht Sequenzierung Adaptern (auf Eis aufgetaut) von 3.4.1.4 und 2,5 ul T4 DNA-Ligase gesetzt. Gut mischen mit Pipette. Schaum und Blasen vermeiden. Wenn Multiplex-Sequenzierung gewünscht wird, verwenden Sie einen anderen indizierten Adapter für jede Probe.
    3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Std.
    4. Reinigen der DNA mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 24 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 23 & mgr; l.
  5. Konvertieren Y-Adapter, um dsDNA genau zu aktivieren Bestimmung DNA-Fragment, NG 28
    1. Einrichten einer Reaktions auf Eis mit dem Eluat aus 3.4.4, 12,5 ul H 2 O, 1 ul 25 uM Primer 1 28, 1 ul 25 uM Primer 2 28, 1,5 ul 10 mM dNTP, 10 ul 5x PCR-Puffer und 1 ul DNA-Polymerase (1 U / ul).
    2. Führen Sie die PCR wie folgt: 95 ° C für 3 min; 5 Zyklen von 98 ° C für 15 sec, 63 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec; 72 ° C für 1 min; 4 ° C gehalten.
    3. Reinigen der DNA mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 11 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 10 & mgr; l.
  6. Größe wählen Sie die Bibliothek
    1. Vorbereitung einer 2% Agarose-Gel mit 1 x TAE-Puffer. Hinzufügen Ethidiumbromid (Vorsicht!) Zu einer Endkonzentration von 500 ng / ml, wenn das geschmolzene TAE-Agarose-Lösung wurde gekühlt, um die Inhalation von Ethidiumbromid zu vermeiden. Stellen Sie sicher, genügend Fahrspuren für alle Proben, DNA-Leiter und leere Gassen haben.
    2. Hinzufügen 8 ul 6x Ladefarbstoff zu dem Eluat aus 3.5.3.
    3. Vorbereiten DNA-Leiter durch Mischen von 1 kb DNA-Leiter und (1,0 ug / ul), 6x Ladefarbstoff und H 2 O in einem Verhältnis von 1: 1: 4.
    4. Last 6 & mgr; l DNA-Leiter, die Proben aus 3.6.2 und weitere 6 & mgr; l DNA-Leiter, die jeweils in einer separaten Spur und mit mindestens einer leeren Spur von den benachbarten Proben / Leitern.
    5. Führen Sie das Gel bei 120 V für 60 min.
    6. Sehen Sie das Gel auf einem UV-Transilluminator (minimieren, die Belichtungszeit auf UV). Eine Schutzbrille und einen Gesichtsschutz. So dass sie mindestens eines der DNA-Leitern mit den entsprechenden Abstand (genug zum Ausschneiden 3 Gelscheiben) zwischen 300 bp und 400 bp Banden gut laufen. Schmalabstand erhöht die Schwierigkeiten bei der Herausschneiden mehrerer Gelscheiben, während weiten Abstand erhöht das Volumen der ausgeschnitten Gelscheiben.
    7. Verwenden Sie ein neues Skalpell oder einer Rasierklinge für jede Spur. Verbrauch drei dünne Gelscheiben zwischen 300 und 400 bp von jeder Spur (Abbildung 4) und legen Sie sie jeweils in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Lautstärke der einzelnen Gel sLäuse möglichst gering (<100 & mgr; l).
    8. Messen Sie die Lautstärke der einzelnen Gelstück (1 ul Gel wiegt etwa 1 mg), fügen 6x Mengen QG-Puffer und Inkubation bei 50 ° C.
    9. Mischen Sie den QG-Gel-Mischung alle 2-3 Minuten, bis das Gelstück vollständig gelöst hat. In 2x Gel Volumina Isopropanol und mischen.
    10. Von diesem Schritt folgen das Protokoll von Gel Extraction Kits. Eluieren der DNA in 51 ul Puffer EB. Der letzte Eluat ~ 50 & mgr; l.
  7. Bereichern Sequenzierung Adapter modifizierten DNA-Fragmente
    1. Optimieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen 29.
      1. Eine Reaktion auf Eis mit 1 ul Eluat von 3.6.10, 1 ul 25 uM Primer 1 28, 1 ul 25 uM Primer 2 28, 7 & mgr; l H 2 O und 10 ul SYBR Green Supermix eingestellt. Das Gesamtvolumen beträgt 20 & mgr; l.
      2. Führen Sie die qPCR wie folgt: 95 ° C für 3 min; 20 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 63 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, gelesen Platte.
      3. Analyse von Daten unter Verwendung eines qPCR-Analyse-Software und bestimmen die Quantifizierung Zyklus (CC) oder Schwellenzyklus (Ct) für jede Probe unter Verwendung des Protokolls des Herstellers. Fahren Sie mit den Proben, die Cq / Ct ≤ 14. Verwenden Sie haben die maximale Cq (CQ 0) minus 1 (bis auf die nächsthöhere ganze Zahl gerundet) als die endgültige PCR-Zyklenzahl (N PCR).
      4. Einstellen der Mengen an DNA-Matrizen, so dass verschiedene Proben werden nach der Ausführung die gleiche Anzahl von PCR-Zyklen auf etwa gleiche Mengen amplifiziert werden. Verwenden 8 ul template für die Probe mit der höchsten Cq (Cq 0), und die Berechnung der Vorlage Lautstärke anderer Proben mit der folgenden Formel:
        Vol i = 8 x 1,8 Cq i -cq 0
    2. 1 ul 25 uM Primer 1 28, 1 ul 25 uM Primer 2 28, 1,5: bis PCR-Reaktionen mit den von 3.7.1.4 berechneten Vorlage Volumes auf Eisul 10 mM dNTP, 10 ul 5x Puffer, 1 ul DNA-Polymerase (1 E / ul) und füllen sich mit H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 ul.
    3. Führen Sie die PCR wie folgt: 95 ° C für 45 sec; N PCR Zyklen (in 3.7.1.3 bestimmt) von 98 ° C für 15 sec, 63 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec; 72 ° C für 1 min; 4 ° C gehalten.
    4. Analyse 5 & mgr; l PCR-Produkte in einem 2% igen Agarosegel (5A). Ein klares "single" Band zeigt, dass die amplifizierte DNA-Fragmente sind in einem engen Längenbereich und dass die DNA-Bibliothek kann vorbehaltlich weiterer Analysen sein.
    5. Wiederholen einer Reaktion für ausgewählte Proben mit Schwimmbad Das amplifizierte DNA-Bibliotheken, die aus der gleichen Probe.
    6. Reinige ausgewählten DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung.
      1. Wenn Primer / Adapter Dimere sind in 3.7.4 sichtbar reinigen DNA-Bibliotheken mit PCR-Reinigungs-Kits oder SPRI Perlen nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren der DNA in 21 ul Puffer EB. dasAbschluss Eluat ~ 20 & mgr; l. Wenn Sequenzierung Anlage des Benutzers hat spezifische Anweisungen auf dem Elutionspuffer, der endgültige Volumen etc., bereiten Proben entsprechend.
      2. Wenn Primer / Adapter Dimere sind deutlich in 3.7.4 sichtbar, reinigen Bibliotheken wie folgt.
        1. Last DNA aus 3.7.5 und DNA Ladder in einer 2% Fertig Agarosegel. Proben können wie in 3.7.6.1 beschrieben, um das Volumen zu reduzieren oder sie können in mehreren Mulden eingelegt werden, gereinigt werden. Legen Sie die Agarose-Gel in eine geeignete Stromsystem. Lassen Sie das Gel für 15 Minuten laufen.
        2. Mit Hilfe eines geeigneten Transilluminator, schneiden Sie den gewünschten Wellenbereich mit einem sauberen Skalpell / razor für jede Probe und legen Sie das Gelstück in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
        3. Isolieren Sie DNA Gelextraktionskits nach dem Protokoll des Herstellers mit zwei Modifikationen: inkubieren Puffers QG-Gel-Mischung in einem Thermomixer bei 37 ° C und 1000 rpm für 30 min, und fügen 2x Gelvolumen Isopropanol.
  8. Senden gereinigten DNA-Bibliotheken, um eine Sequenzierung Möglichkeiten. Befolgen Sie alle Anlage-Richtlinien.
    Hinweis: Ein Qualitätsanalyse von einem Bioanalyzer (5B) sollte vor der Sequenzierung, um die genaue Größenbereich und die Konzentration einer DNA-Bibliothek bestimmen, durchgeführt werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dam-V5-LmnB1 Fusionsprotein wurde überprüft, um mit dem endogenen Lamin B-Protein durch Immunfluoreszenzfärbung (Abbildung 1) co-lokalisiert werden.

Die erfolgreiche PCR-Amplifikation von Adenin-methylierten DNA-Fragmente ist ein wichtiger Schritt für DAMiD-seq. Die Versuchsproben sollten einen Abstrich von 0,2 zu verstärken - 2 kb, während der Negativkontrollen (ohne DpnI ohne Ligase oder ohne PCR-Vorlage) so...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ob Dam-markierte Proteine die Funktionen endogener Proteine behalten, sollte vor einem DamID-seq-Experiment untersucht werden. Die subzelluläre Lokalisation von Dam-tagged nuclear envelope proteinen sollte immer bestimmt und mit der der endogenen Proteine verglichen werden. Für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren wird vorgeschlagen zu untersuchen, ob das Dam-Fusion-Protein die Funktionen des endogenen Proteins bei der Regulierung der Genexpression retten kann. Dieser Funktionstest kann in Organismen durchgeführt ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Bas van Steensel für die Bereitstellung der DamID-Expressionsvektoren für Säugetiere. Wir danken dem Yale Center for Genome Analysis und dem Genomics Core im Yale Stem Cell Center für die Beratung bei der Erstellung von NGS-Bibliotheken und der Implementierung von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung. Diese Arbeit wurde durch die Startfinanzierung der Yale School of Medicine, einen Scientist Development Grant der American Heart Association (12SDG11630031) und einen Seed Grant von Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ViraPower Lentivirale ExpressionssystemeLife TechnologiesK4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 und K371-20
Gateway BP Clonase II EnzymmischungLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II EnzymmischungLife Technologies11791-020
DNeasy Blut & Taschentuch-Set (250)QIAGEN69506 oder 69504   
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T ZellenAmerican Type Culture CollectionCRL-11268<
a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotLife Technologies25300-054
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatLife Technologies11995-065
Fötales RinderserumSigmaF4135
TrisMarke nicht kritisch
EDTAMarke nicht kritisch
200 Proof EtOHMarke nicht kritisch
IsopropanolMarke nicht kritisch
NatriumacetatMarke nicht kritisch
DpnINew England BiolabsR0176wird mit
Puffer-DamID-Adaptern "AdRt" und "AdRb"geliefert. Sequenzen der integrierten DNA-Technologiensind in Ref. 24 erhältlich; keine Phosphorylierung des 5'- oder 3'-Endes, um eine Selbstligation zu verhindern.
T4 DNA LigaseRoche Life Science10481220001geliefert mit Puffer
DpnIINew England BiolabsR0543geliefert mit Puffer
DamID PCR Primer "AdR_PCR"Integrierte DNA TechnologiesSequenzen erhältlich in Ref. 24
Desoxynukleotid (dNTP) Solution SetNew England BiolabsN0446100 mM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
Vorteil 2  Polymerase-MixClontech639201mit Puffer
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 & micro; g/µ l
QIAquick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28104 oder 28106
MinElute PCR-AufreinigungskitQIAGEN28004 oder 28006für ein Elutionsvolumen von weniger als 30 μm; l
SPRI-Kügelchen / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880sorgen für zusätzliches Mischen und mehr Elutionszeit, wenn weniger als 40 & Mikro; l Elutionspuffer wird verwendet
Puffer EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA-FragmentaseNew England BiolabsM0348geliefert mit Puffer
T4 DNA Ligase ReaktionspufferNew England BiolabsB0202
T4 DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0203
DNA-Polymerase I, großes (Klenow) FragmentNew England BiolabsM0210
T4 PolynuleotidkinaseNew England BiolabsM0201
Klenow-Fragment (3' → 5' exo-)New England BiolabsM0212mit
PuffersequenzierungsadapternIntegrierte DNA-Technologien-Sequenzenerhältlich in Ref. 28
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200verwendet in 3.4.3; Lieferung mit Quick Ligation Reaction Buffer und Quick T4 DNA Ligase
Sequenzierung Primer 1 und 2Integrated DNA TechnologiesSequenzen erhältlich in Ref. 28
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKK2101 oder KK2102geliefert mit KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer und 10 mM dNTP Mix
AgaroseSigma AldrichA4679
EthidiumbromidSigma AldrichE1510-10ML10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704 oder 28706
iTaq Universal SYBR GreenSupermix Bio-Rad Laboratories1725121 oder 1725122
SpektralphotometerMarke nicht kritisch
0,45 μ m PVDF FilterMarke nicht kritisch
25 ml SeringeMarke nicht kritisch
10 cm GewebekulturplattenMarke nicht kritisch
6-Well-GewebekulturplattenMarke nicht
kritisch S1000 ThermocyclerBio-Rad Laboratories
C1000 Touch ThermocyclerBio-Rad Laboratoriesfür qPCR
Vortex MixerMarke nicht kritisch
Dry Block Heater oder ThermomixerMarke nicht kritisch
Mikrozentrifugenmarkenicht kritisch
Gelelektrophoresesystem mit NetzteilMarke nicht kritisch
Magnetständerzur Aufreinigung von DNA mit SPRI-Kügelchen; sollte 1,5-2 ml Röhrchen aufnehmen; Marke nicht kritisch
Marke UV-TransilluminatorMarke nicht kritisch
E-Gel-ElektrophoresesystemLife TechnologiesG6400, G6500, G6512ST
je

Referenzen

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Interaktionen der Kernlaminalentiviraler ExpressionssistemaDNA FragmentierungGelelektrophoreseBioanalyzer Analyse

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