Methodenartikel

Verwenden von Bildkorrelation Lokale Stämme auf Gefäßgewebeproben zu charakterisieren

DOI:

10.3791/53625

⸱

24. Januar 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, University of South Carolina, 2Department of Mechanical Engineering, University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben die Verwendung digitaler Bildkorrelation zur Charakterisierung des lokalen Oberflächendehnungsfeldes auf vaskulären Gewebeproben, die einem einachsigen Zugversuch unterzogen wurden. Diese Messungen ermöglichen eine präzise Quantifizierung der mechanischen Reaktion der Probe und die Generierung konstitutiver Spannungs-Dehnungs-Beziehungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Charakterisierung des mechanischen Verhaltens von biologischen und manipulierten Weichgeweben ist ein zentraler Bestandteil der biomedizinischen Grundlagenforschung und Produktentwicklung. Spannungs-Dehnungs-Beziehungen werden in der Regel aus mechanischen Prüfdaten abgeleitet, um eine vergleichende Bewertung zwischen Proben und in einigen Fällen die Identifizierung konstitutiver mechanischer Eigenschaften zu ermöglichen. Durch die Verwendung von durchschnittlichen Dehnungsmaßen können jedoch Fehler auftreten, da eine signifikante Heterogenität im Dehnungsfeld aus geometrischer Ungleichmäßigkeit der Probe und Spannungskonzentrationen resultieren kann, die durch das Anbringen/Greifen von Weichgeweben innerhalb des Prüfsystems induziert werden. Wenn die Heterogenität des Dehnungsfeldes signifikant ist, erfordert eine genaue Beurteilung der mechanischen Reaktion der Probe die Messung der lokalen Dehnungen. Diese Studie demonstriert ein neuartiges biomechanisches Prüfprotokoll zur Berechnung lokaler Oberflächendehnungen unter Verwendung eines mechanischen Prüfgeräts, das mit einer hochauflösenden Kamera und einer digitalen Bildkorrelationstechnik gekoppelt ist. Eine Reihe von Probenoberflächenbildern wird aufgenommen und dann analysiert, um die lokale Oberflächendehnung einer vaskulären Gewebeprobe zu quantifizieren, die einer rampierten einachsigen Belastung ausgesetzt ist. Dieser Ansatz kann die Genauigkeit in der experimentellen vaskulären Biomechanik verbessern und hat das Potenzial für einen breiteren Einsatz bei anderen nativen Weichgeweben, technischen Weichgeweben und weichen Hydrogel-/Polymermaterialien. In dem Video zeigen wir, wie die Systemkomponenten eingerichtet werden und führen ein vollständiges Experiment an nativem Gefäßgewebe durch.

Einleitung

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Eine reiche Geschichte der Forschung überspannt mehr als 50 Jahren hat sich auf die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von Gefäßgewebe konzentriert. Diese Untersuchungen ermöglichen es uns, sowohl die physiologische und pathologische Verhalten der Blutgefäße besser zu verstehen, eine Grundlage für die Bewertung der Wirksamkeit / Verträglichkeit der endovaskulären Prothesen und Hilfsmittel bei der Konstruktion und Herstellung von technischen Gefäßkonstrukte 1-6. Genaue Messung der mechanischen Reaktion des Weichgewebes und konstitutive Modellierung ihrer mechanischen Eigenschaften inhärent herausfordernd aufgrund der mechanischen Heterogenität Anisotropie und Nichtlinearität durch die meisten Gewebetypen zeigten. Außerdem sind experimentelle Messungen oft von lokalen Komplexität bei Probe Griff Schnittstellen im Verlauf der mechanischen Prüfung eingeführt (dh Biegung, Reibung, Spannungskonzentrationen, Reißen) und der unvermeidlichen Übergang der mechanischen Eigenschaften, wenn Gewebe von lebenden Tier herausgeschnitten verwechselt.

Einachsiges -Zugversuch gehört zu den einfachsten mechanischen Tests, die an einer Probe aus einem festen Material durchgeführt werden können, und wird oft verwendet, um die mechanische Antwort des vaskulären Gewebes zu bewerten. Ergebnisse dieser Experimente liefern nützliche Vorabinformationen zu den beiden einheimischen und konstruiert Gewebequellen, und kann verwendet werden, um die Auswirkungen von bestimmten Behandlungen, Krankheitszuständen oder pharmakologische Verbindungen auf das mechanische Verhalten der Gefäßwand 7-11 vergleichen.

Einachsige mechanische Prüfung von Weichteilen wird in der Regel anhand von Proben mit relativ einheitliche Geometrien, die am häufigsten Hundeknochens oder ringförmigen 7,8,12-14 ausgeführt. Jedoch können deutliche Abkehr von diesen idealisierten Geometrien aufgrund Herausforderungen Gewebedissektion, Isolierung und Klemm innerhalb des Testsystems zugeordnet sind kommen. Jede Ungleichförmigkeit in der Geometrie wird letztlich führen zu heterogen Spannung und DehnungFelder, wenn die Probe auf uniaxiale Dehnung unterworfen wird, wobei der Grad der Heterogenität unabhängig von der tatsächlichen Probenform sowie Probengröße (bezogen auf den Griff) und die mechanischen Eigenschaften des Materials 9,15,16. Wenn Feld Heterogenitäten sind signifikant, Probe-Stamm-Berechnungen auf der Grundlage der relativen Griffpositionen sind ungenau und somit eine unzureichende Grundlage für die Beurteilung mechanische Verhalten.

Video-Analyse-Systeme sind weit verbreitet für Dehnungsmessungen der Weichteile verwendet, die oft mit hohem Kontrast zur Probenoberfläche aufgebracht 17,18 Farbstoffmarker. Digitale Bildkorrelation, einem optischen metrologischen Technik, die Vollfeld Oberflächenbelastung, die durch den Vergleich Graustufenintensitätswerte auf der Probenoberfläche vor und nach der Verformung misst, in Verbindung mit Video verwendet Analysen der Weichteile 19-21. Es gibt mehrere Vorteile der digitalen Bildkorrelation verglichen mit interferometrIC-Methoden, die für die Messungen eingesetzt werden können. Erstens als berührungslose Messverfahren minimiert er die verwirrende Wirkungen der Änderung von Stoffeigenschaften aufgrund der Art, in der das Meßsystem beeinflußt die Probe. Zweitens erfordert es eine viel weniger strengen Messumgebung und hat einen breiteren Bereich von Empfindlichkeit und Auflösung als andere Methoden. Drittens, mit der Fähigkeit zur Erfassung einer vollständigen Gesichtsfeld ausgestattet ist, kann diese Technik sowohl den Durchschnitt und die lokalen mechanischen Reaktionen zu charakterisieren. Ausführliche Erläuterung des Verfahrens werden die Leser aufgefordert, das Buch von Sutton 22 zu sehen.

Zu Spannungsfeldern auf der Probenoberfläche zu erhalten, kann eine zweidimensionale digitale Bildkorrelationstechnik (2D-DIC) eingesetzt werden. Kurz gesagt, werden die Bilder der Probe bei unbelastetem und verschiedene geladene Zustände erfasst. Das erste Bild wird in kleine Quadrate genannt Teilmengen (M × M Pixel), die ein Gitter für nachfolgende Berechnung bilden geteilt2D Spannungsfelder. Die Position jedes Quadrat in den verformten Probe wird unter Verwendung eines Bildabgleichalgorithmus erhalten. Die Bewegung jedes Quadrates wird dann verfolgt, Bild-für-Bild, wodurch Verschiebungsfelder, die dann verwendet werden kann, um eine Verformung Gradienten und Spannungen über eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Polynomanpassung oder Finite-Elemente-Interpolation abgeleitet werden. In dem vorliegenden Manuskript, bieten wir eine detaillierte Methodik für die Bewertung der Oberflächenspannungsfelder auf nativen Gefäßgewebe über Integration von einachsigen Zugversuch und 2D-DIC.

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Protokoll

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HINWEIS: Die nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden im Rahmen eines Protokolls von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of South Carolina in Columbia, South Carolina genehmigt durchgeführt.

1. Tissue Erwerb und Dissection

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeugen vor Gewebedissektion. Autoklaven chirurgische Scheren und Feinstandardzangen sowie chirurgische Klingen unter einem Druck von 15 psi und einer Temperatur von 121 ° C für 15 min.
  2. Erwerben Sie einen Satz frischer Schweine (7 Monate alten Landrasse Männlich, 60-70 kg) die Nieren mit intakter Aorta von einem lokalen Schlachthof. Transportgewebe zurück zum Labor in Eiswasser 1% phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  3. Unmittelbar nach der Ankunft, zu isolieren, die Bauchaorta vom umgebenden Gewebe mit chirurgischen Schere und Pinzette.
  4. Waschen des Gefäßes dreimal mit einer 50 ml Spritze, die mit PBS (pH 7,2) gefüllt. Mit Hilfe der Schere und Pinzette, entfernen Sie so viel perivaskuläre Gewebe possIVK, ohne die Integrität der Probe.
  5. Vertikal positionieren einer scharfen Rasierklinge auf den Mittelteil des Schiffes und sicherzustellen, dass sie senkrecht zur Gefäßlängsachse ist. Schaffen zwei Ringproben mit jeweils einer Breite von etwa 20 mm durch Anwendung von drei aufeinanderfolgenden Umfangseinschnitte mit der Rasierklinge.
  6. Vertikale Positionierung einer scharfen Rasierklinge auf eine Ringprobe, so dass die Klinge in der Radialrichtung orientiert ist. Tragen Sie eine akute Kraft, um eine Radialschnitt, der in einem streifenförmigen Probe für einachsige mechanischen Testergebnisse zu erhalten. Legen Sie die Probe in einem 100 mm Glaspetrischale und tauchen in PBS, bis die Anwendung von Oberflächenrauschen. Wiederholen Sie dies für den zweiten Ring Probe.

2. Erstellung von Oberflächen Speckle Pattern

  1. Schließen Sie die Airbrush, um das Druckventil.
  2. Stellen Sie den Düsendurchmesser der Airbrush, um Flecken von 60-100 & mgr; m zu ergeben (geeigneten Bereich für die Düsendurchmesser sollvon den ersten Studien bestimmt werden).
  3. Gießen Sie ungefähr 2 ml schwarz Gewebemarkierungsfarbstoff in die Schwerkraftzuführung des Airbrush.
  4. Legen Sie die Spritzpistole ca. 0,5 m entfernt von der Probe.
  5. Entfernen Sie die Probe aus der Petrischale. Spray Gewebemarkierungs Farbstoff auf der intimalen Oberfläche der Probe für etwa 5 s unter einem Spritzdruck von 100 psi. Dreimal wiederholen, um sicherzustellen, dass das Speckle-Muster einheitlich die Probenoberfläche umfasst.

3. Durchführung von Experimenten

  1. Befestigen jedes Endes der Probe auf einen Kunststoffstreifen (1 cm Breite x 1 cm Länge x 0,5 cm Dicke) unter Verwendung eines Gewebeklebers. Legen Sie die Probe auf einer Gewebeschneidebrett. Positionieren Sie die Probe, so dass sie flach liegt und messen ihren Dimensionen mit Hilfe eines digitalen Messschieber.
  2. Initiieren Sie Systemsteuerungen für die mechanische Prüfung. Auf das System Home-Bildschirm steuert, wählen Sie "Waveform" auf der Taskleiste auf der Registerkarte "Setup" befindet.
  3. Anzeigenur die Position der Obergriff des mechanischen Tester -4 mm (4 mm Erweiterung relativ zu dem bezeichneten Ausgangsposition in dem System). Sichern Sie vorsichtig einen Kunststoffstreifen (nach dem Muster in 3.1 im Anhang) in die obere Griff der mechanischen Tester und damit die Probe frei hängen. Den digitalen Sattel zu gewährleisten, dass der Abstand zwischen der Probe und dem Obergriff von weniger als 2 mm ist.
  4. Die Position des Untergriffs manuell einzustellen, so daß das freie Ende der Probe ohne Erweiterung gesichert werden. Sichern Sie vorsichtig die Kunststoffstreifen mit dem freien Ende der Probe in den unteren Griff der mechanischen Tester befestigt.
    1. Den digitalen Sattel zu gewährleisten, dass der Abstand zwischen der Probe und den unteren Griff weniger als 2 mm ist. Null das System Wägezelle. Messen Sie die Länge der Probe und dies als die Referenzlänge für die Berechnung des Gesamtumfangs Stämme.
  5. Geben Sie den mechanischen Testprotokoll. Die in t verwendete Protokollseine Vorführung mit 4 uniaxialen Verschiebungszyklen, die die Länge der Probe bei einer Verschiebungsgeschwindigkeit von 0,01 mm / s um 18% zu verlängern.
  6. Intermittierend zu sprühen PBS auf die Probe während des gesamten restlichen Testprotokoll, um sicherzustellen, dass sie hydratisiert bleibt.
  7. Montieren Sie die Kamera (5 Megapixel-Kamera, 100-mm-Objektiv, Pixelgröße von 3,49 & mgr; m) auf einem Stativ, das positioniert ist 1,5 m von der Laderahmen. Achten Sie darauf, die Kamera und der Probenoberfläche durch Einstellen der Kamera auf den niedrigsten verfügbaren Bereich der Tiefe und Manipulieren von seiner Ausrichtung, so dass das gesamte Sichtfeld im Fokus ist senkrecht.
  8. Öffnen Sie das Bild-Capture-Software.
  9. Wählen Sie "PGR-2" in der Option "System wählen".
  10. Wählen Sie den Projektpfad, um die Bilder zu speichern, um zu analysieren.
  11. Klicken Sie auf das Symbol "Time Square" und geben Sie das Erfassungsintervall als 5 Sek.
  12. Stellen Sie die Belichtung, numerische Apertur und Fokus des Objektivs, um so eine klare Sicht auf die Probe zu erhalten.
  13. Stellen Sie die Position der LED, um eine ausreichende Beleuchtung der Probe bereitzustellen.
  14. Klicken Sie auf das Symbol "Start" in der Bild-Capture-Software, um ein Bild der Probenoberfläche zu erhalten.
  15. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
  16. Importieren Sie das erhaltene Bild. Zoom auf einen einzelnen Tupfen, und dann zählen Anzahl von Pixeln innerhalb dieser einzelnen Speckle.
    Hinweis: Finden Sie einen Vertreter schwarzen Flecken. Definieren die Fleckengröße als die lineare Entfernung zwischen den Bildpunkten auf beiden Seiten des Flecken ähnlich hohe Werte haben. Für eine akzeptable Fleckengröße, sollte die Anzahl der Pixel über die Breite eines typischen Speckle größer als 3 Pixel betragen. Verbessert die räumliche Auflösung der Messungen sollten die meisten Flecken nicht mehr als 5-7 Pixel über die Breite des Speckle zu haben, wann immer möglich. Somit würde eine typische Speckle für diesen Fall zwischen 10 & mgr; m am kleinsten und 23 um auf der größten linearen Abmessung in reichen. Um festzustellen, eine entsprechende TeilmengeGröße, sollte eine typische Teilmenge mindestens 3 weißen und 3 schwarzen Sprenkeln über seine Breite haben. Wenn ein typisches Speckle ist 5 Pixel in der linearen Dimension, dann würde jede 31x31 Teilmenge mindestens 105 & mgr; m in der linearen Dimension sein. Der Abstand zwischen den Teilstellen sollte mindestens 1/6 der linearen Dimension sein. Somit wird für einen 31x31 Subsetgröße ist der Abstand 5 Pixeln, die 18 um in der linearen Entfernung darstellt.
  17. Nach Überprüfung der Qualität der Speckle-Muster, gleichzeitig auf das Symbol "Ausführen" im System und Symbol "Start" in der Bild-Capture-Software, um den Test zu starten.
  18. Erfassen Sie eine Reihe von Bildern während des Tests unter Verwendung der Kamera und Bildaufnahmesoftware.

4. Aufräumverfahren nach dem Experiment

  1. Legen Sie die Probe verworfen in biohazard Beutel und schließen Sie die Tasche. Rufen Sie das Department of Environmental Health and Safety (EHS) an der Universität von South Carolina für die ordnungsgemäße Entsorgung.
  2. Bereiten Sie eine Phosphat-Desinfektionsmittel-Lösung mit einem 1:64 Verdünnungsverhältnis von Reinigungsmittel Desinfektionsmittel, um destilliertes Wasser. Einweichen der chirurgischen Werkzeuge in dieser Lösung für 20 min.
  3. Die in 4.2 mit destilliertem Wasser beschriebenen Produkte gründlich ausspülen. Trocknen Sie die Werkzeuge mit einem Papiertuch und dann sprühen sie mit einer 70% igen Ethanollösung. Wieder einmal die chirurgische Instrumente mit einem Papiertuch trocknen und setzen Sie diese wieder in der chirurgischen Werkzeugkasten.

5. Bildanalyse, um die lokale Spannungsfeld Messen

  1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
  2. Klicken Sie auf die Registerkarte "Speckle-Bilder", wählen Sie alle Bilder, die analysiert werden müssen.
  3. Klicken Sie auf das Rechteck-Werkzeug und wählen Sie den Bereich von Interesse in dem ersten Bild.
  4. Geben Teil Größe 41 × 41 Pixeln und Schrittweite 5 Pixel.
  5. Klicken Sie auf Starten Analyse Registerkarte in der Software, wählen Sie die Interpolation optimierten 8-Falle; wählen Sie das Kriterium als Null normalisiert quadrierten Differenzen und Teilgewichte Option Gaussian.
  6. Stellen Sie die Schwelle Optionen als Standard in der Software.
  7. Klicken Sie auf das Post-Processing-Unterregisterkarte in Startanalyse Registerkarte. Klicken Sie auf Option Stamm Berechnung und verlassen Filtergröße und Filtertyp als Standard in der Software. Wählen Tensor geben Lagrange.
  8. Wählen Sie Daten Registerkarte und wählen Sie ein beliebiges Bild analysiert dann zur Visualisierung der Oberflächenspannungsfeld.

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Ergebnisse

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Die von einem Rampen einachsigen Verlängerungstest an vaskuläres Gewebe erfasst mechanischen Daten aus Last gegenüber angewandt Probenverdrängungs Beziehungen zu einem bestimmten Verschiebungsrate. In dieser Studie, 2D-DIC in Verbindung mit einachsigen mechanischen Prüfung wird verwendet, um die Oberflächenspannungsfelder der Probe in orthogonalen Richtungen an verschiedenen verformten Zuständen zu messen. Die viskoelastische Natur des vaskulären Gewebes wird durch den bemerkenswerten Gr...

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Diskussion

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Obwohl frühere Studien haben eine breite Palette von Farbstoff-Tracking-Video-Methoden zur Probendehnungs 18,20,21,23,24 zu bewerten, ist unser gegenwärtiges Ziel, eine umfassende Methodik zur Kopplung einachsigen Zugversuch mit 2D-DIC für die Bewertung liefern Oberflächen Belastungen für vaskuläre Gewebeproben. Mit einer hochauflösenden Kamera und Inhouse-Bildanalyse-Software kann das Spannungsfeld innerhalb eines vorbestimmten Oberflächenbereich gemessen werden, wenn die Probe erfährt einachsiger Belastung....

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Die Software und technische Unterstützung wurden mit freundlicher Genehmigung von Correlated Lösungen Incorporated (www.correlatedsolutions.com).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Einachsiges mechanisches ZugprüfgerätEnduratec3230 AT/HR
Blaues Gewebemarkierungsfarbmittelhttp://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696
SprühgerätAnest-iwataCM-BCustom Micron
BKamerapunkt GrauGS2-GE-50S5M-C
LinseTokinaAT-X M100
GefäßgewebeCaughman Inc
0,9 % Natriumchlorid-Injektion PBSBAXTER HEALTHCARE CORP.
Vic_snapKorrelierte Lösungen
Vic_2DKorrelierte Lösungen
Wintest 4.1Bose ElectroForce
Tissue-Klebstoff 3M Vetbond 1469SB
Desinfektionsmittel Fisher Scientific04-355-13Decon BDD Bacdown Reinigungsmittel Desinfektionsmittel

Referenzen

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