Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren. Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.

Zusammenfassung

Die Dissoziation der Maushaut in eine Einzelzellsuspension ist essentiell für nachgelagerte zelluläre Analysen, wie z.B. die Charakterisierung von infiltrierenden Immunzellen in Nagetiermodellen für Hautentzündungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verdauung von Maushaut in einer nährstoffreichen Lösung mit Kollagenase D, gefolgt von der Trennung hämatopoetischer Zellen unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten. Die so gewonnenen Zellen können für In-vitro-Studien, In-vivo-Transfers und andere nachgelagerte zelluläre und molekulare Analysen einschließlich Durchflusszytometrie verwendet werden. Dieses Protokoll ist eine effektive und wirtschaftliche Alternative zu teuren mechanischen Dissoziatoren, spezialisierten Trennsäulen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Verdauungsmethoden, die die zelluläre Lebensfähigkeit oder Dichte von Oberflächenproteinen, die für die phänotypische Charakterisierung oder zelluläre Funktion relevant sind, beeinträchtigen können. Wie hier in unseren repräsentativen Daten gezeigt, produzierte dieses Protokoll hochlebensfähige Zellen, enthielt spezifische Immunzell-Untergruppen und hatte keinen Einfluss auf die Integrität gängiger Oberflächenmarkerproteine, die in der durchflusszytometrischen Analyse verwendet werden.

Einleitung

Hauterkrankungen, die von Kontaktdermatitis, Ekzem, Schuppenflechte, Zellulitis, Pilzinfektionen und Abszesse, um Nicht-Melanom-Hautkrebs wurden gefunden, um unter den 50 häufigsten Krankheiten weltweit zu sein, und die vierte weltweit führende Ursache für nicht-tödlichen Krankheiten im Jahr 2010 ^1. Dementsprechend ist die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen vielfältige Hautpathologien ist ein notwendiger und aktives Forschungsgebiet. Nagetiermodellen haben im Verständnis von entzündlichen Hautzuständen bemerkenswert nützlich gewesen wie atopische Dermatitis ^2, Psoriasis ^{3 oder} Staphylococcus aureus Infektion ^4. Kostengünstige, effiziente und einfache Protokolle für die enzymatische Verdauung von Maushautgewebe kann Zubereitungen von Zellen, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann, um die Pathophysiologie von Haut Krankheiten besser zu verstehen. Hier ist ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Mäusehaut beschriebenGewebe und die Isolierung von Haut infiltrierenden Leukozyten, die für die Zellkultur, in vivo adoptiven Transfer genutzt werden können, durchflusszytometrische Analyse und Sortierung oder Genexpressionsstudien. Das übergeordnete Ziel dieser Vorgehensweise ist, um eine Einzelzellsuspension aus haut infiltrieren Leukozyten mit hoher Zelllebensfähigkeit vorzubereiten, während die Kosten in der Regel mit eigenen Reagenzien-Kits und mechanische dissociators assoziiert zu minimieren.

Bestehende Hautgewebe Dissoziation Verfahren ^5-7 können in geringen Zelllebensfähigkeit und Oberflächenmarker Integrität führen oder erfordern kundenspezifische Enzym-Kits und teuer Gewebedissoziation Maschinen ^8-11. Während der Verdauung der Mausohr Hautgewebe ist recht verbreitet ^12-13, Verdauen stark verhornte Hautgewebe (zB von der Flanke) in Zellpräparaten mit großen Mengen an nicht-Zelltrümmer kontaminiert führen. In einer aktuellen Studie, Zaid und Kollegen verdaut Maus Flankenhaut für 90 Minuten in 2,5 mg / ml Dispase, Follovon 45 min in 3 mg / ml Kollagenase ⁷ vermählen. In einer anderen Studie verwendet diese Forscher mehreren Inkubationen mit einem kombinierten Aufschluss von 2,5 Stunden, einschließlich der Verwendung von Trypsin / EDTA, Collagenase III und Dispase ^5. Die Verwendung von Trypsin ist nicht für die enzymatische Verdauung Haut empfohlen, da die Behandlung mit Trypsin von verschiedenen Herstellern wurde gezeigt, meßbar beeinflussen die Integrität von Zelloberflächenproteinen auf Säugetierzellen ^14-15. Zusätzlich kann Dispase signifikante Wirkungen auf proliferative Fähigkeit der CD4 T-Zellen und CD8a auswirken und Oberflächenfluss von wenigstens 20 Molekülen, einschließlich der gemeinsamen T-Zellaktivierung Marker wie CD62L ^16. Andere Protokolle verwenden RPMI 1640 bei der Verdauung ^Medium 6. Jedoch kann die Anwesenheit von Mg ^{2+ und} Ca ^{2+ in} RPMI verursachen umfangreiche Zellaggregation ^17.

Ein ideales Protokoll für Gewebedissoziation sollte für Hochzelllebensfähigkeit, geringe zielenEbenen der Zellaggregation und minimale Beschädigung Oberflächenproteine ​​zu Zelle. Hochwertige Lymphknoten Stromazellen Vorbereitungen mit Protokollen, die kürzer Enzyminkubationen, Ca ^{2+ und Mg 2+} freien Medien zu verwenden erreicht worden, und Trypsin zu vermeiden und Dispase ^18. Jedoch haben Protokolle dieser Art nicht für die Dissoziation von ganzen Mäusehaut nachgewiesen.

Hier wird ein Protokoll beschrieben zu distanzieren, zu isolieren und zu bereichern haut infiltrieren Leukozyten aus allergenfochten Maus Flanke Haut. Kurz gesagt, herausgeschnitten Haut in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fötalem Rinderserum für 1 Stunde vorinkubiert, um das Gewebe für die Verdauung zu erweichen und zu entfernen überschüssiges tote Haut oder Fettgewebe. Dies wird durch eine 30 min enzymatischen Aufschlußschritt mit 0,7 mg gefolgt / ml Kollagenase D. Kollagenase D hat minimale Auswirkungen auf Dichte der Zelloberflächenmarker und keine Wirkung auf die T-Zellproliferation in vitro ^16,18, so dass essehr gut geeignet für Anwendungen, die die Charakterisierung von Oberflächenproteinen. Folgende enzymatische Verdauung wurde diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Epithelzellen und Schmutz von der Einzelzellsuspension zu entfernen und anzureichern hämatopoetischen Zellen. Wichtiger ist, vermeidet dieses Verfahren teuer spaltenbasierten Magnetzellseparation Reagenzien und Gewebedissoziation Maschinen ^8-11 und können mit Geräten und Materialien in einem basischen biomedizinischen Forschungslabors gefunden geführt werden. Hier wurde dieses Protokoll verwendet, um Leukozyten aus Flankenhaut dreimal herausgefordert mit dem Hapten Oxazolon (Ox) bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse (ab 19 angepasst) zu isolieren. Zellen wurden unter Verwendung von Mehrparameter Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ergab eine Zellsuspension mit minimalem Rückstand und> 95% Lebensfähigkeit der isolierten Lymphozyten, die von Mehrparameter Flow-Zytometrie analysiert wurden, um die Infiltration von T-Lymphozyten und Neutrophilen in die betroffene sk messenim.

Protokoll

Hinweis: 8-12 Wochen alte weibliche ND4 Swiss Webster-Mäusen, konventionell mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht sind, wurden für diese Studien verwendet Das verwendete Experimentalprotokoll (B13S1) wurde vom Macalester College IACUC genehmigt..

1. Sensibilisierung und Herausforderung mit Oxazolon

1. Tag 0
   1. Bereiten Anästhesieraum durch Zugabe von 3 ml Isofluran auf saugfähige Handtücher unterhalb Masche am unteren Rand eines 4 L mit Deckel Glas platziert. Zur ND4 weiblichen Mäusen hier verwendete Zeit in der Kammer 30-60 sec, bis das Objekt ausreichend betäubt; Optimierung der Verabreichung des Anästhetikums für die Mausstamm verwendet wird.
   2. Rasur narkotisierten Maus hin und flankieren mit einem Tierhaarschneider.
2. Tag 1
   1. Einen 2% igen Lösung von 4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator.
   2. Kurz betäubenMäuse mit Isofluran-Narkose, wie in 1.1.1 beschrieben und anwenden 100 ul 2% Ox in mehreren Serienanwendungen von etwa 20 & mgr; l jeder der rasierten Rücken. Warten Sie 5-10 Sekunden zwischen seriellen Anwendungen für die Lösung zu trocknen.
   3. Achten Sie darauf, zu verschütten die 2% Ox-Lösung auf anderen als den Rücken Regionen, und warten auf die Lösung, um zwischen Anwendungen zu trocknen.
3. Tage 5-7
   1. Einen 1% igen Lösung (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator.
   2. Sanft, aber bestimmt die Maus zu immobilisieren am Genick und Schwanzbasis mit Leib nach oben und Hals leicht nach unten geneigt ist (ähnlich wie bei einem Halt für eine intraperitoneale Injektion) und anwenden 100 ul 1% Ox auf die rasierte Flanke in mehreren Serienanwendungen und sich die Zeit nehmen, um die Haut danach trocknen, wie oben beschrieben.
   3. Für Kontrollmäusen, gelten 100 ul absolutem Ethanol Fahrzeug auf die rasierte Flank.

2. Flank Haut Ernte

1. Euthanize Mäusen unter Verwendung von Kohlendioxid Einatmen, Verschlucken und vorsichtig herauszuschneiden den gewünschten Bereich der Flankenhaut (~ 25 mm x 25 mm der Haut) mit 10 cm chirurgische Scheren.
2. Mit einem sauberen, scharfen chirurgischen Klinge, kratzen Sie das überschüssige Fett und Bindegewebe von der Flanke Haut.
3. Platzieren 3 Stück Flanke Haut von 3 Mäusen in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS RT [mit Phenolrot, ohne Calcium oder Magnesium, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1- piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 10% fötalem Rinderserum (FBS)].

3. Pre-Verdauung Tissue Wasch

1. Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
2. Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit.
3. Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 & mgr; mSchmutzfänger, um den Waschpuffer verwerfen und sammeln das Gewebe. Ein einzelnes Sieb kann während des gesamten Verfahrens in einer biologischen Behandlungsgruppe wiederverwendet werden.
4. Verwendung eines Paars von Zangen, übertragen die Flankenhaut von dem Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen, die 10 ml frisches, RT HBSS Medium (enthaltend EDTA, HEPES und FBS, wie oben beschrieben).
5. Mit einer 12,5 cm Paar chirurgische Dissektion in das Rohr eingetaucht ist, Hackfleisch jedes Stück Flanke Haut, so dass die mittlere Gewebestück ist etwa 2,2 mm x 2,2 mm in der Umgebung.
6. Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
7. Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit

4. Kollagenaseverdau der Haut

1. Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 & mgr; m Sieb, sammeln und übertragen Sie die Flankenhautstücke in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml fresh, RT HBSS Medium mit 0,7 mg ergänzt / ml D. Kollagenase
2. Das Röhrchen enthaltenden Digestionsmedium und Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
3. Wirbel Inhalt Rohr kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit.
4. Filterinhalt des Rohres durch ein 70 um Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen; halten den Durchfluss mit dem verdauten Gewebe und entsorgen Sie das Sieb und flankieren Haut Schutt.
5. Die Durchströmungswäsche in 50 ml HBSS Medium, Zentrifuge für 5 Minuten bei 350 g, und dekantiert den Überstand.

5. Dichte-Zentrifugation

1. Verwendung einer serologischen Pipette 3 ml 67% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein neues 15 ml konischen Röhrchen für jede Probe.
2. Zellpellet in 5 ml 44% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in HBSS mit Phenolrot.
3. Gently Schicht 5 ml des 44% Dichtegradientenzentrifugation Medium, das die Zellen auf der Oberseite des 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien Probe unter Verwendung einer serologischen Pipette. Achten Sie auf die Pipette auf die langsamste Geschwindigkeit eingestellt, und legen Sie die Pipette entlang der Wand des konischen Rohrs. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zittern, zu stören oder zu invertieren die Steigung.
4. Beschleunigung auf die niedrigste Einstellung, löst die Bremse, und Zentrifuge die Gradienten bei 931 × g für 20 min bei RT, sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausgeglichen ist.
5. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Gradienten aus der Zentrifuge und schonend zu transportieren, um die Laborbank hält das Rohr aufrecht. Unter Verwendung einer 5 ml-Plastiktransferpipette Entfernen der Zellschicht an der Grenzfläche der 44% und 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien und in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Wenn die Schnittstelle nicht angezeigt wird, entfernen Sie einfach etwa 2 ml Flüssigkeit an der 67% -44% Grenze.
6. Füllen Sie das konische Röhrchen mit Zellen aus der inten-Schnittstelle mit 2% FBS in 1X eiskaltem PBS, Zentrifuge Zellen für 5 Minuten bei 350 · g, und dekantieren Sie den Überstand.
   Anmerkung: Dies ist das erste Mal, dass die Zellen abgekühlt werden / kalt gehalten, da Aufschlussschritte werden bei 37 ° C und Dichtegradientenzentrifugation Medien Schritte sind bei RT. Die Zellen können in einem 1 resuspendiert werden: 1 Trypanblau Verdünnung und zählt und Lebensfähigkeit Information kann an dieser Stelle erreicht werden.

6. Sperren und Färbung für Analyse über Durchflusszytometrie

1. Block FcyRII / III-Rezeptoren auf Zellen, die nicht-spezifische Antikörperfärbung zu verhindern. Für die hier beschriebenen Experimente machen Antikörper Mastermixe in PBS mit 2% FBS, das 1: 100-Verdünnung von unkonjugiertem Antikörper gegen CD16 / 32 (2.4G2) zu binden und zu blockieren FcyRII / III-Rezeptoren.
2. Blockiert Inkubieren Zellen mit entsprechenden Mastermixen von Antikörpern gegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) und Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) sowie Brilliant Violet 510 lebend / tot-Färbung, um tote Zellen zu identifizieren. Verwenden Sie alle Antikörper entweder an der Verdünnung durch Hersteller empfohlen oder zuvor von Forschern optimiert. Für die hier beschriebenen Experimente verwenden alle Antikörper bei 1: 100 Verdünnung.
3. Waschen und resuspendieren Zellen in 50 ul 1X PBS Färbepuffer mit 2% FBS. Halten auf Eis bis Fluoreszenzdaten auf einem Durchflusszytometer erfasst werden.
   Anmerkung: Es ist wichtig, dass Kompensationsparameter mit einer lymphatischen Gewebe und einen gemeinsamen Zelloberflächenantigen (wie CD4 oder CD8) vor dem Erwerb von Fluoreszenzdaten voroptimierte.
4. Um die Anzahl der Zellen, die für Downstream-Durchflusszytometrie zu erhöhen, Daten zu erfassen vom gesamten Proben von gefärbten Zellen.

7. Analysieren Sie Flow Cytometry Daten mit Standardmethoden, um die unten aufgeführten Schritten Accomplish

1. Ersten Gate auf die Lymphozyten Bereich der Vorwärtsstreuung(Fläche), die durch Seitenstreuung (Bereich) Plot.
2. Wählen Sie dann einzelne Zellen mit Hilfe der Vorwärtsstreuung (Breite) durch Seitenstreuung (Breite), um zu vermeiden, die Analyse Dubletten. Dies kann auch mit einem Vorwärtsstreuhöhe von Seitenstreuhöhe Grundstück durchgeführt werden.
3. Dann Tor auf Linie (CD11b, CD11c und CD45R / B220) -negativen und CD3-positive Ereignisse, die auszuschließen sind Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen sind und beschränken Analysen der T-Zelle Fach, wenn das Ziel ist, wie es hier ist, um zu beurteilen infiltrierenden T-Zellen.
4. Nächstes Tor auf lebende Zellen, die das Live / Dead-Färbung auszuschließen.
5. Schließlich Tor auf der Zellpopulation von Interesse (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt).

Ergebnisse

Kollagenase D behandelten Splenozyten zeigen ähnliche Niveaus von CD4- und CD8-α auf T-Zellen im Vergleich zu Medien behandelten Kontrollen
Zunächst wurden die möglichen Auswirkungen Kollagenase D von der Frequenz und Oberflächen Fülle von Abstammung und Aktivierungsmarkern auf T-Zell-Untergruppen mit sekundären lymphatischen Gewebe als Kontrolle bewertet. Eine Suspension von Splenocyten aus Mäusen erhalten ND4 und für 1 Stunde mit ...

Diskussion

Charakterisierung von Veränderungen der Hautansässigen Leukozyten in Nagetiermodellen von Hauterkrankungen wie Neurodermitis oder Psoriasis ist wichtig für das Verständnis der mechanistischen Zusammenhänge zwischen entzündlichen Zell Zustrom und Krankheitspathologie. Hier beschreiben wir eine wirtschaftliche Technik, um Leukozyten aus Hautgewebe mit Grundausstattung in den meisten biomedizinischen Forschungslabors gefunden zu isolieren. Diese relativ schnelle Technik vermeidet die Verwendung von teuren Gewebedissoziatio...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HBSS mit Phenolrot, ohne Calcium, ohne Magnesium, flüssig	Sigma Aldrich	55021C	zum Tag der Anwendung steril halten.
HEPES, ≥ 99,5 % (Titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA Dinatriumsalzlösung	Sigma Aldrich	E7889	zum Tag der Anwendung steril halten.
Fötales Rinderserum, USDA, hitzeinaktiviert, Premium Select	MidSci	S01520HI	Bis zum Tag der Anwendung steril halten.
Percoll, pH 8,5-9,5 (25°; C)	Sigma Aldrich	P1644	Steril halten. Percoll muss vor der Verwendung isotonisch mit sterilem 10X PBS gemacht werden.
Trimmer-Combo-Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Verwenden Sie den größeren Trimmer, um die Flanke und den Rücken zu rasieren.
4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on	Sigma Aldrich	E0753-10G	Lösen Sie sich in 100% EtOH bei 50 ΰ auf; C 15 Minuten lang auf einer rotierenden Platte ziehen.
Gereinigter Anti-Maus-CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antikörper zur Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung während der Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie
Anti-CD3ε-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antikörper zur Färbung von Zellen für den Durchfluss
anti-CD8α-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
Anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viabilitätsfarbstoff für die Durchflusszytometrie
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Zellanalysator (18 Parameter)
Kollagenase D aus Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilisiertes Enzym bei 5 mg/ml in HBSS mit Phenolrot, ohne Calcium und ohne Magnesium in 1 mL Aliquots. Sofort bei -20° lagern; C für bis zu sechs Monate.
ND4 Schweizer weibliche Mäuse	Harlan	0-32	8-12 Wochen alt; konventionell untergebracht mit freiem Zugang zu Futter und Wasser und gemäß den IACUC-Richtlinien des Macalester College verwendet.