Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige BrdU-ChIP-Slot-Western-Technik, um Proteine und Histonmodifikationen zu untersuchen, die mit neu synthetisierter oder entstehender DNA assoziiert sind.

Zusammenfassung

Histondeacetylasen 1 und 2 (HDAC1,2) lokalisieren zu den Stellen der DNA-Replikation. In der früheren Studie, unter Verwendung eines selektiven Inhibitors und eines genetischen Zuschlagssystem zeigten wir neuartige Funktionen HDAC1,2 in Replikationsgabel Progression und naszierenden Chromatin Wartung in Säugerzellen. Zusätzlich verwendeten wir eine BrdU-chip-Slot-westliche Technik, die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) von Brom-Desoxyuridin (BrdU) -markierten DNA kombiniert mit Slot-Blot und Western-Analysen zur quantitativen Messung von Proteinen oder Histon-Modifikation mit naszierenden DNA verbunden.

Sich aktiv teilenden Zellen wurden mit HDAC1,2 selektiver Inhibitor behandelt oder mit siRNAs gegen HDAC1 und HDAC2 transfiziert und dann wurde neu synthetisierte DNA mit dem Thymidin analoge Bromdesoxyuridin (BrdU) gekennzeichnet. Die BrdU-Markierung wurde zu einem Zeitpunkt durch den Verlust von HDAC1,2 Funktionen gemacht, wenn es keinen signifikanten Zellzyklusarrest oder Apoptose. Nach lAbeling von Zellen mit BrdU, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) der Histon-Acetylierung Marken oder das Chromatin-remodeler wurde mit spezifischen Antikörpern durchgeführt wird. BrdU-markierte DNA-Eingang und der immunpräzipitiert (oder Mit Chip) DNA wurde dann auf eine Membran mit der Slot Blot Technik aufgetragen und immobilisiert durch UV. Die Menge an naszierenden DNA in jedem Schlitz wurde dann mit Hilfe der Western-Analyse mit einem anti-BrdU-Antikörpers bewertet. Die Wirkung des Verlustes HDAC1,2 Funktionen auf der Ebene der neu synthetisierten DNA-assoziierten Histonacetylierung Markierungen und Chromatin remodeler wurde dann durch Normalisieren der BrdU-Chip-Signal von der behandelten Proben mit den Kontrollproben erhalten wurde, bestimmt.

Einleitung

Defekten DNA-Reparatur und / oder die DNA-Replikation sind eine Hauptursache von Genominstabilität, die Zelltod auslösen können. Eine einzige nicht reparierten Doppelstrangbruch reicht aus, um den Zelltod ¹ verursachen. Chromatinorganisation vorübergehend sowohl während der Replikation Veränderung und Reparatur ^2,3, und die Nicht epigenetische Information zu erhalten während dieser Prozesse werden in einer Bedrohung führen, um die Integrität Genom. Verlust von HDAC3 oder HDAC1,2 Funktion behindert S-Phasen-Progression, die DNA-Replikation und Reparatur, die zu genotoxischen Stress (DNA-Schaden) und Zelltod ^4-9. Es ist daher eine praktische Strategie zur selektiven HDAC-Inhibitoren zu verwenden, um die Replikation, Reparatur und Chromatin in Krebszellen zu stören und DNA-Schäden, die wiederum das Wachstum zu stoppen und Zelltod selektiv in schnell wachsenden Krebszellen verursachen.

Während der DNA-Replikation, wird Chromatin schnell zerlegt und wieder zusammengebaut folgende DNA-Vervielfältigung. Neu synthesized Histon H4 an K5 und K12 Reste (H4K5K12ac) und im Anschluss an die Abscheidung auf Chromatin acetyliert sind, werden sie schnell durch Histon-Deacetylasen (HDACs) ^10,11 deacetyliert. Versagen der Zellen, entstehende Chromatin Integrität durch Histondeacetylierung pflegen können, um Gabelzusammenbruchs, die wiederum in der DNA-Schädigung und Zelltod führen führen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass selektive Hemmung der Histon-Acetylierung erhöht HDAC1,2 (H4K5ac, H4K12ac und H4K16ac) und hemmt SMARCA5 Chromatin remodeler aktiv am Entstehen begriffenen Chromatin, die mit reduzierten Replikationsgabel Progression korreliert, erhöhte Gabel Zusammenbruch und erhöhte Replikation Stress-induzierten DNA-Schäden ⁶ . Somit kann HDAC-Hemmer naszierenden Chromatinstruktur zu verändern, um DNA-Schädigung und Tod sehr schnell in Krebszellen schnell auslösen, da diese Zellen Zyklus und geben viele Male durch die S-Phase. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie HDACs dienen, Histonacetylierung und Protein bindi regulierenng an DNA-Replikation in Säugetierzellen zu erhalten.

Zur quantitativen Messung der Menge an Histon-Acetylierung und SMARCA5 Chromatin remodeler mit naszierenden DNA während der DNA-Replikation verbunden ist, entwickelten wir eine modifizierte ChIP Assay genannt BrdU-chip-Slot-westliche Technik. Folgende Chromatinimmunpräzipitation (Chip) eines gewünschten Proteins oder Histonmodifikation die Menge an naszierenden DNA (markiert mit Thymidin-Analogon, BrdU) in die Chipprobe kann unter Verwendung von Western-Analyse von BrdU-markierten ChIP DNA nachgewiesen werden unter Verwendung eines Schlitzes übertragen auf eine Membran Blot-Apparatur. Mit dieser Technik haben wir gezeigt, dass H4K16ac (eine Marke in Chromatin Verpackungen beteiligt) und die ISWI Familienmitglied SMARCA5 (SWI / SNF bezogene Matrix-assoziierten Aktin-abhängige Regel von Chromatin) Chromatin remodeler sind mit im Entstehen begriffenen DNA in die S-Phase Zellen assoziiert ^6. Wir fanden auch, dass die im Entstehen begriffenen H4K16ac Markierung durch HDAC1,2 während der DNA-Replikation ⁶ deacetyliert. H4K16ac hemmtChromatin remodeler Aktivität des ISWI Familienmitglied SMARCA5 ^12. Daher mit der BrdU-CHIP-Slot-westliche Technik konnten wir die Funktionen für HDAC1,2 bei der Regulierung der Chromatin-Remodeling während der DNA-Replikation zu verbinden. Daher ist die BrdU-chip-Slot-Western Blot Technik ein leistungsfähiges Konzept für die Assoziation und Dissoziation Dynamik von Proteinen oder deren post-translationale Modifikationen, die im Entstehen begriffenen DNA gebunden sind, quantitativ zu messen.

Protokoll

1. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) folgenden BrdU Labeling

1. Kultur NIH3T3-Zellen in Gegenwart entweder von DMSO oder HDAC1,2-selektive Inhibitoren, wie ^{zuvor. 6 beschrieben}
2. Nach der Behandlung mit DMSO oder HDAC1,2 selektive Inhibitoren, fügen BrdU zu den Zellen in einem sterilen Gewebekulturhaube. Inkubieren 2 x 10 ⁶ NIH3T3-Zellen in 10 ml NIH3T3 Medien mit 20 & mgr; M Endkonzentration von Bromdesoxyuridin (BrdU) für 60 Minuten in einem sterilen 37 ° C Gewebekulturinkubator plattiert.
3. Vernetzungsintrazellulären Proteinen, DNA durch Zugabe von Formaldehyd direkt in das Kulturmedium in einer Endkonzentration von 1%. Inkubieren 2 x 10 ⁶ NIH3T3-Zellen mit Formaldehyd bei RT für 10 min auf einem Schüttler.
4. Quenche die Vernetzung durch die Zugabe von Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM. Inkubation bei RT für 5 min auf einem Schüttler.
5. Die Datenträgern und sammle die Zellen in PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Spin cells bei 956 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Zweimaliges Waschen des Zellpellets mit eiskaltem PBS. Entfernen PBS aus dem Röhrchen. Bewahren Sie die vernetzte Zellpellet ohne PBS (der Überstand) bei -80 ° C bis zur Verwendung.
6. Vorbereitung des Lysats aus dem vernetzten Zellpellet durch Zugabe von 500 ul FA140-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) mit Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt.
7. Scheren die Chromatin durch Beschallung der Proben fünfmal bei 35% Leistung und mit einer 15 Sek Puls, 0,9 sec an und 0,1 s aus Einstellung. Halten die Röhrchen auf Eis nach jeder Runde der Beschallung zu einer Erwärmung der Proben zu vermeiden.
   1. Überprüfen Sie die Scher auf einem DNA-Gel als die Schereffizienz wird zwischen verschiedenen Beschaller variieren. Beschallung überprüfen, Reverse Vernetzung durch Zugabe von NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M und führen Sie die Schritte 1.17.1. - 1.22. Run eluiert 10 ul DNA auf einem 1,5% Agarose-Gel, um zu überprüfen, ob die Scher istzwischen 300 - 700 bp mit einer durchschnittlichen Intensität von 500 bp.
8. Folgende Beschallung Zentrifuge Proben für 10 min bei 17.949 × g bei 4 ° C und den Überstand in ein neues Röhrchen.
   1. Zuführen Proteinschätzung unter Verwendung des kommerziellen Protein-Assay-Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie die gleiche Menge Lysat für die Chip-Steuerung und experimentellen Proben. Im Allgemeinen verwenden 1 mg Gesamt-Lysat pro Chip Reaktion.
9. Vorbereitung 50% igen Aufschlämmung von Protein-A-Agarose unter Verwendung FA140 Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail. Hinzufügen von 1/10 Volumen der Protease-Inhibitor-Cocktail. Berechnen des Volumens der Kügelchen benötigt, basierend auf der Anzahl von Proben insgesamt.
   1. Wash Protein A-Agarose-Kügelchen mit FA140 Puffer zweimal, um den Speicherpuffer zu entfernen und dasselbe Volumen an FA140 Puffer an die Perlen zu 50% Aufschlämmung herzustellen.
   2. Auf Proteine, die unspezifisch an die Beads zu entfernen, Zugabe von 50 ul 50% igen Aufschlämmung von Protein-A-Agarose undcubate die Proben bei 4 ° C mit konstanter End-Over-End-Rotation in einem Drehspießmischer für 30 min.
10. Dreh die Proben bei 956 × g bei 4 ° C für eine Minute. Die überstehende Flüssigkeit und führen Immunpräzipitation entweder durch Zugabe von 8 ul H4K16ac Antikörper oder 5 ul (5 ug) von 1 mg / ml SMARCA5 Antikörper zu dem Überstand. Inkubieren bei 4 ° CO / N mit konstanter End-over-End-Rotation in einem Drehspießmischer.
11. Speichern 1/10 des Extraktes für 'Eingangskontrolle und der Einstellung als beiseite bei -20 ° C. Die Eingangs muss rückwärts zusammen mit der IP-Proben vernetzt sein.
12. Verwenden gleiche Menge an Kaninchen-IgG (5 ul 1 mg / ml) als Negativkontrolle Immunpräzipitation Probe.
13. Am nächsten Tag werden 50 & mgr; l 50% Protein A-Agarose-Aufschlämmung in dem Extrakt und Inkubation für 1 h bei 4 ° C unter Rotation.
14. Pellet Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 956 × g für 2 min bei 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wash die Perlen mit den folgenden Puffern sequentiell. In Puffermittel, fügen Sie Protease-Inhibitoren Recht vor Gebrauch.
    1. Wäscht mit wenig Salz Immunkomplex-Waschpuffer (FA140; Endkonzentration von 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) zum 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation.
    2. Wäscht mit High Salt Immunkomplex-Waschpuffer (FA500; Endkonzentration von 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 und 0,1% Natriumdesoxycholat) zum 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation.
    3. Mit LiCl Immunkomplex-Waschpuffer (Endkonzentration 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 und 0,5% Natriumdesoxycholat) für 5 min bei 4 ° C mit end-over-end-Rotation zu waschen.
15. Folgende Waschschritte, wie oben beschrieben, 200 & mgr; l Elutionslösung (Endkonzentration von 1% SDS und 100 mM Natriumbicarbonat) und INCUBATe bei RT für 15 Minuten mit End-over-End-Rotation bei RT.
16. Drehen Sie die Proben bei 956 × g bei RT und übertragen Sie das Eluat in ein neues 1,5-ml-Tube. Wiederholen Sie Schritt 1.15 mit zusätzlichen 200 & mgr; l Elutionslösung.
17. Zu 400 ul des Eluats, fügen NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M und gut mischen.
    1. Darüber hinaus fügen Sie 400 ul Elutionslösung bis 10 & mgr; l-Eingang, die Aufhebung wurde (Schritt 1.11) und fügen NaCl auf eine Konzentration von 0,16 M zu vernetzen Eingangsabtastwerten und umzukehren. Reverse Vernetzung der Proben durch Inkubation in 65 ° C Wasserbad für 5 Stunden.
18. 1 ml 100% EtOH zu dem Umkehrnetzten Eluat. Gut mischen und Inkubation bei -80 ° C für 2-3 Stunden oder bei -20 ° CO / N. Drehen Sie die Proben bei 17.949 · g für 15 Minuten und entsorgen Ethanol.
19. Zugabe von 800 ul 70% Ethanol, um das Pellet zu waschen. Schleudern bei 17.949 xg für 15 min bei 4 ° C und entsorgen Ethanol. Spin kurz um das restliche Ethanol zu entfernen. Der Luft trocknen die Proben bei 37 ° C für 10 min, um restliche Ethanol zu entfernen.
20. Man löst DNA in 90 ul RNase und DNase frei Wasser und fügen Sie 2 ul 10 mg / ml RNase bei einer 0,2 mg / ml Endkonzentration. Inkubieren bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.
21. Zugabe von 10 ul 10fach Proteinase K-Puffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS). Gut mischen und fügen 1 ul Proteinase K Inkubation bei 42 ° C für 1 Stunde.
22. Reinige Eingang und Chip-DNA unter Verwendung von kommerziellen PCR-Reinigungs-Kits nach Herstellerprotokoll und Eluieren der DNA in 50 ul Wasser. DNA bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.

2. Slot-Blot-Analyse von Chip-DNA

1. Messung der Ausbeute von Eingangs- und ChIP DNA in 50 ul Wasser eluiert, wie in Schritt 1.22 unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 280 nm gemäß dem Protokoll des Herstellers beschrieben.
2. Nehmen gleiche Volumina (50 ul) von Eingabe- oder immunpräzipitierten DNA, die innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises sind.
   1. Zum Beispiel, wenn EingangsDNA-Ausbeute beträgt 1,5 ng / & mgr; l, dann nehmen Sie 30 ul (oder 45 ng Gesamt-DNA) und stellen Sie Volumen auf 50 ul mit Wasser. Für Faktor-Chip, nehmen Sie die gesamte 50 ul Eluat aus Schritt 2.1 und fahren Sie mit Schritt 2.3.
3. Denaturierung 50 ul Eingang oder immunpräzipitierten DNA durch Zugabe von 2,5 Volumina 0,4 N NaOH, Vortexen und Zentrifuge 956 × g für 10 sec, und Inkubation bei RT für 30 min.
4. Neutralisierung der denaturierten DNA durch Zugabe von 175 ul 1 M Tris-HCl, pH 6,8, Vortex-Zentrifuge 956 × g für 10 sec und legen Sie die Proben auf Eis.
5. Vorbereitung einer Reihenverdünnung von Eingangs- und immunpräzipitierten DNA für die Slot-Blot-Test, wie nachstehend beschrieben.
   1. Folgen Schritte 2,3-2,4 um eine Gesamtprobenvolumen von 350 ul zu erhalten (das heißt, 50 & mgr; Input / ChIP DNA, 125 & mgr; l 0,4 N NaOH, 175 ul 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Hinweis: Für das Beispiel oben angegeben, werden 45 ng Eingangs DNA am Ende als 0.129 ng / ul.
   2. Für die Eingabe DNA, zu kennzeichnen drei Rohrs wie 100, 50 und 25 und 100 ul, 50 ul und 25 ul des denaturierten und neutralisierte DNA Probe. Machen Sie das Endvolumen auf 100 ul mit Nuklease-freies Wasser. Für Chip DNA, Etiketten drei Rohre 200, 100 und 50 und 200 ul, 100 ul und 50 ul des denaturierten und neutralisierte DNA Probe. Machen Endvolumen auf 200 ul mit Nuclease freies Wasser.
6. Schneiden Sie die Membran auf die Größe des Slot-Blot-Apparatur. Vorbefeuchtende die Membran und Löscharbeiten in 20x SSC vor und vor der Zugabe von DNA. Fügt sie in die Slot Blot Vorrichtung gemäß dem Protokoll des Herstellers.
7. Pipettieren von DNA aus Schritt 2.5.2 in die entsprechenden Slots. Vakuum ziehen langsam, um die DNA auf die Zeta-Probe-Membran zu ziehen. Stoppen Vakuum nach alle Proben durch die Apparatur geleitet.
   1. Demontieren Sie das Gerät sofort zu immobilisieren, die DNA auf die Membran unter Verwendung eines UV-Vernetzer. Haben Sie die DNA-Seite nach oben in der UV-Vernetzer und verwenden Sie die Au-tocrosslink Einstellung im Vernetzer. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
8. Detect BrdU auf der Slot-Blot, indem Western-Blot.
   1. Blockieren der Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST) für 1 h bei RT, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an die Membran zu verhindern.
   2. Hinzufügen primären anti-BrdU-Antikörper (1: 500 Verdünnung) in 1% fettfreier Trockenmilch in PBST verdünnt und Inkubieren des Blots mit dem primären Antikörper während 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Nach der primären Antikörper-Inkubation Waschen der Membran mit PBST dreimal.
   3. Hinzufügen HRP-konjugiertem anti-Maus Sekundär-Antikörper auf dem Blot (1: 5000 Verdünnung) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Std. Nach dem sekundären Antikörper Inkubation die Membran mit PBST dreimal.
      HINWEIS: genügend Volumen der Antikörper an die Membran während der primären und sekundären Antikörper-Inkubationen vollständig bedecken.
9. Bereiten Sie die ECL-Mix und es dem Blot ac hinzufügenchend dem Protokoll des Herstellers. Inkubieren der Membran mit ECL Mischung für 5 min bei RT.
   1. Legen Sie die Membran in einer Röntgenkassette, setzen die Membran an dem Röntgenfilm und die Entwicklung der Blot unter Verwendung des Protokolls des Herstellers.
   2. Zu quantifizieren, die für die Eingabe und Mit Chip DNA nach dem Scannen der Blots unter Verwendung der Bild J Software gemäß dem Protokoll des Herstellers erhaltene Signal. Zur Quantifizierung Verwenden des Signals, das innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises, um die Genauigkeit der Messung zu gewährleisten.

Ergebnisse

Um die Spezifität der HDAC1,2-selektive Inhibitoren zu bestimmen, wurden Hdac1,2 ^{FL / FL und} HDAC3 ^{FL / FL-Fibrosarkom-Zellen} verwendet. Adenovirus enthaltenden Cre-Rekombinase (Ad-Cre) wurde verwendet, um Hdac1,2 und HDAC3 in diesen Zellen zu löschen. Nach der Ad-Cre Infektion Hdac1,2 ^{FL / FL} Zellen, eine stabile Zunahme H4K5ac beobachtet. Behandlung Hdac1,2 Knockout-Zellen mit 2...

Diskussion

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll ist eine relativ schnelle Methode, um das Vorhandensein von Proteinen oder deren posttranslational modifizierte Formen auf neu repliziert oder im Entstehen begriffenen DNA zu demonstrieren. Zusätzlich ermöglicht diese Technik eine um die Assoziations Dissoziationskinetik eines Proteins oder seiner modifizierten Form mit naszierenden DNA zu messen. Diese Technik ist komplementär zu der eleganten iPOND Technik ^13. Im iPOND Technologie wird neu synthetisierte DNA...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-BrdU (Western)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membran	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyd	Fisher	BP531-500
Protein A Agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106
Glycin	Sigma	G7403
Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Kaninchen IgG& nbsp;	Millipore	12-370
HEPES		Sigma H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Natriumdesoxycholat	Sigma	D6750
Natriumbicarbonat	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-behandeltes Wasser	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Natriumhydroxid	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
Fettfreie Trockenmilch	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
Röntgenfilm	Genesee Sci	30-101
Entwickler	Konica Minolta	SRX-101A
UV-Vernetzer	Stratagene	XLE-1000
Ultraschallgerät	Branson Sonifikator   Digitaler Ultraschall-Zelldisruptor	Modell: 450
Zentrifuge	Eppendorf	Modell: 5810R
Wasserbad	Fisher Scientific Isotemp	Modell: 2322
NanoDrop 1000 Spektralphotometer	ThermoScientific	Modell: 1000
Slot Blot Gerät	Schleicher & Schuell Minifold II	44-27570
Gewebekultur-Inkubator	Thermo Scientific	Serie II 3110 CO2-Inkubatoren

mit Wassermantel