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Methodenartikel

Zeitraffer-Video-Mikroskopie für die Beurteilung der EYFP-Parkin Aggregation als Marker für Cellular Mitophagie

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DOI:

10.3791/53657

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4. Mai 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Thomas Jefferson University, SKCC, 2Department of Medical Oncology, Thomas Jefferson University, SKCC, 3Kazan Federal University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hierin beschreiben wir detailliert einen Zeitraffer-Videomikroskopie-Ansatz zur Messung der zeitlichen Rekrutierung von EYFP-Parkin während der selektiven Entfernung geschädigter Mitochondrien. Dieser dynamische Prozess der EYFP-Parkin-abhängigen Entfernung geschädigter Mitochondrien kann unter verschiedenen experimentellen Bedingungen als Indikator für die zelluläre Gesundheit verwendet werden.

Zusammenfassung

Zeitraffer-Videomikroskopie kann als Echtzeit-Bildgebung von lebenden Zellen definiert werden. Diese Technik beruht auf der Sammlung von Bildern zu verschiedenen Zeitpunkten. Zeitintervalle können über eine Computerschnittstelle eingestellt werden, die die in das Mikroskop integrierte Kamera steuert. Diese Art der Mikroskopie erfordert sowohl die Fähigkeit, sehr schnelle Ereignisse zu erfassen, als auch das Signal, das von der beobachteten Zellstruktur während dieser Ereignisse erzeugt wird. Nachdem die Bilder aufgenommen wurden, wird ein Film des gesamten Experiments zusammengesetzt, um die Dynamik der interessierenden molekularen Ereignisse zu zeigen. Die Zeitraffer-Videomikroskopie hat ein breites Anwendungsspektrum im Bereich der biomedizinischen Forschung und ist ein leistungsstarkes und einzigartiges Werkzeug, um die Dynamik des zellulären Geschehens in Echtzeit zu verfolgen. Mit dieser Technik können wir zelluläre Ereignisse wie Migration, Teilung, Signaltransduktion, Wachstum und Tod bewerten. Darüber hinaus sind wir mit fluoreszierenden molekularen Sonden in der Lage, spezifische Moleküle wie DNA, RNA oder Proteine zu markieren und sie auf ihren molekularen Wegen und Funktionen zu verfolgen. Die Zeitraffer-Videomikroskopie hat mehrere Vorteile, von denen der wichtigste die Möglichkeit ist, Daten auf Einzelzellebene zu sammeln, was sie zu einer einzigartigen Technologie für Untersuchungen im Bereich der Zellbiologie macht. Die Zeitraffer-Videomikroskopie hat jedoch Einschränkungen, die die Aufnahme hochwertiger Bilder beeinträchtigen können. Bilder können durch beide externen Faktoren beeinträchtigt werden. Temperaturschwankungen, Vibrationen, Feuchtigkeit und interne Faktoren; pH-Wert, Zellmotilität. Darin beschreiben wir ein Protokoll für den dynamischen Erwerb eines spezifischen Proteins, Parkin, das mit dem verstärkten gelb fluoreszierenden Protein (EYFP) fusioniert ist, um die selektive Entfernung geschädigter Mitochondrien unter Verwendung eines Zeitraffer-Videomikroskopie-Ansatzes zu verfolgen.

Einleitung

Makro-Autophagie ist ein intrazellulärer Prozess, der den katabolen Abbau von beschädigten und dysfunktionalen zellulären Komponenten wie Organellen und Proteinen zum Zwecke des Recyclings oder der Energieerzeugung beinhaltet. Um diesen Stoffwechselprozess in Gang zu setzen, verschlingt die Zelle die geschädigten zellulären Bestandteile in eine Doppelmembranstruktur, das sogenannte Autophagosom, das mit einem Lysosom verschmilzt und dessen Inhalt abgebaut und recycelt wird 1,2. Es gibt zwei Haupttypen der Autophagie, die nicht-selektive und die selektive. Der nicht-selektive Autophagie-Prozess tritt auf, wenn die Zelle unter Nährstoffmangelbedingungen steht und sowohl nach essentiellen Nährstoffen als auch nach Energie suchen muss. Die selektive Autophagie tritt jedoch auf, um die Entfernung sowohl dysfunktionaler/geschädigter Organellen als auch von Proteinen zu vermitteln, die sonst toxisch sein könnten. Einer der am besten untersuchten selektiven Autophagie-Prozesse ist die Entfernung von Mitochondrien, die als Mitophagie 1,3-5 bezeichnet wird.

Mitochondrien sind die zentralen Organellen für den Zellstoffwechsel und die Hauptquelle für Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung durch die Elektronentransportkette, die Fettsäureoxidation und den Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus. Darüber hinaus regulieren Mitochondrien die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und setzen Proteine frei, die an den Zelltodwegen beteiligt sind 6-8.

PTEN-induzierte putative Kinase 1 (PINK1) und Parkin RBR E3 Ubiquitin-Ligase (Parkin) sind die Schlüsselproteine, die am Mitophagie-Prozess beteiligt sind. Parkin kann vor dem Zelltod schützen, indem es die Zelle durch mitochondriale Qualitätskontrolle gesund hält9. Nach Verlust des mitochondrialen Membranpotentials wird zytosolisches Parkin von PINK1 in die Mitochondrien rekrutiert. Diese Rekrutierung löst die sequentiellen Ereignisse der Mitophagie aus 10. Es gibt eine breite Palette von Hinweisen darauf, dass die Mitophagie ein grundlegender Prozess der Qualitätskontrolle der Mitochondrien ist und Anomalien in diesem Prozess die Krankheit vorantreiben 7. Zum Beispiel wurde die autosomal-rezessive Parkinson-Krankheit mit Mutationen in den Genen in Verbindung gebracht, die für Parkin und PINK1 kodieren (PARK2 bzw. PINK1) 11. Die Qualitätskontrolle der mitochondrialen Gesundheit ist essentiell für die Entfernung von Mitochondrien, die zur Akkumulation von ROS12 beitragen. Ein übermäßiges Vorhandensein von intrazellulärer ROS kann zu einer Schädigung sowohl der nukleären als auch der mitochondrialen DNA (DNA bzw. mt-DNA) führen.

Hierin zeigen wir einen Zeitraffer-Videomikroskopie-Ansatz, um die Aggregation von Parkin nach der Induktion von Parkin-vermittelter Mitophagie in immortalisierten embryonalen Fibroblasten der Maus durch in vitro Verabreichung von Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP), einem Entkopplungsmittel, zu verfolgen. FCCP stört die ATP-Synthese, indem es Protonen durch die äußere Mitochondrienmembran kurzschließt und somit die oxidative Phosphorylierung von der Elektronentransportkette entkoppelt 13. Das Auslösen der Depolarisation der Mitochondrienmembran führt zur Störung der Mitochondrien und zur selektiven Parkin-abhängigen Entfernung. Daher kann die Transfektion der interessierenden Zellen mit einem Expressionsvektor, der für Parkin kodiert, mit einem Fluoreszenzmarker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) fusioniert, als Fluoreszenzmarkierung verwendet werden, um die Rekrutierung von Parkin während des mitophagischen Prozesses zu verfolgen. Um die Mitochondrien sichtbar zu machen, haben wir pDsRed2-Mito co-transfiziert, das für das rot fluoreszierende Protein (DsRed2) kodiert, das eine mitochondriale Targeting-Sequenz der Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit VIII (Mito) enthält. pDsRed2-Mito ist für die Fluoreszenzmarkierung von Mitochondrien14 konzipiert. Die Zeit, die für die Translokation von Parkin in die Mitochondrienmembran benötigt wird, kann gemessen werden und gibt ein indirektes Maß für die Zellgesundheit. Zum Beispiel können wir sagen, dass, wenn eine Zelllinie, die für ein bestimmtes Gen von Interesse ausgeschaltet wurde, nach der Induktion der Mitophagie durch FCCP entweder eine schnellere oder eine langsamere Rekrutierung von Parkin zeigt, dieses Genprodukt ein Schlüsselspieler wäre, um die Stoffwechselraten der Zelle auf dem physiologischen Status zu halten und die Entwicklung von Krankheiten zu verhindern. Daher bietet die Zeitraffer-Videomikroskopie ein sehr leistungsfähiges Werkzeug sowohl für die Grundlagen- als auch für klinische Forschungsanwendungen, um die Dynamik markierter Proteine während ihrer molekularen Prozesse zu verfolgen und zu verstehen, wie diese Prozesse während eines pathologischen Zustands beeinflusst werden.

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Protokoll

1. Elektroporation von Fibroblast mit beiden Expressionsvektoren EYFP-Parkin und pDsRed2-Mito

  1. Wachsen die immortalisierten embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen auf 10 cm-Gewebekulturplatte unter Verwendung von DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C.
    1. Bei 80% Zellkonfluenz, verwerfen die komplette DMEM - Medium durch sterile Absaug- und 10 ml sterile 1x Phosphatpufferlösung (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH hinzufügen 2 PO 4 und 1 l destilliertes H 2 O, pH - Wert: 7,4).
    2. Entsorgen Sie die PBS durch sterile Absaug- und 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Die Platte bei 37 ° C, bis die Zellen abgelöst werden (2 - 3 min). In 4 ml komplettem DMEM-Medium, Resuspendieren der Zellen und nehmen 10 _6; l der Zellsuspension für die Zählkammer Zählen.
      HINWEIS: Die Hämozytometer so ausgelegt ist, dass die Anzahl der Zellen in einem Satz von 16 Eckquadrate der Anzahl der Zellen entspricht x 10 4 / ml.
  2. Seed 1 x 10 6 Zellen auf 10 cm - Gewebekulturschalen 24 Stunden vor der Elektroporation.
  3. Entsorgen Sie das komplette DMEM-Medium durch sterile Absaug- und 10 ml sterilem PBS. Entsorgen Sie die PBS durch sterile Absaug- und 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Die Platte bei 37 ° C, bis die Zellen abgelöst werden (2 - 3 min). In 4 ml komplettem DMEM-Medium und Resuspendieren der Zellen in einem 15-ml-Tube.
  4. Dreh die Zellen nach unten bei 250 xg für 5 min unter Verwendung einer Kühlzentrifuge (4ºC). Überstand verwerfen durch sterile Absaug- und das Pellet in 1 ml sterilem PBS. Dreh die Zellen nach unten bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C.
  5. Überstand verwerfen durch sterile abgesaugt und mit 100 & mgr; l of Lösung Mix für die Elektroporation (82 & mgr; l der Elektroporation Lösung V + 18 & mgr; l Zusatzlösung 1) an die Zellpellet und resuspendieren sanft das Pellet durch Pipettieren (Weitere Informationen finden Sie im Benutzerhandbuch). In 2 ug EYFP-Parkin (Anregung / Emission 514/527) und 1 & mgr; g pDsRed2-Mito (Anregung / Emission 565/620) an der Zellsuspension.
  6. Die Lösung wird in der sterilen Küvette eine Einweg-pasteur mit (beide Werkzeuge sind mit dem Kit zur Verfügung gestellt) und Elektroporation den voreingestellten Programm NIH / 3T3-U-030 (Single Impuls mit, Spannung 200 V, Kapazität 960 uF, Pulszeit von 20 Millisekunden , Pulszahl: 1).
  7. Unmittelbar nach der Elektroporation, 500 & mgr; l frisches vorgewärmtes komplettes DMEM - Medium und der Zelle auf einer 6 cm - Gewebekulturplatte Live-imaging-grade Saatgut und inkubieren sie in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Stunden.

2. Zeitraffervideomikroskopie

  1. Stellen Sie die Temperatur der Kammer des Mikroskops bei 37 ° C vor der Verwendung.
  2. An dieser Stelle bereiten eine bestimmte Live-Abbildungsmedium mit dem Versuchsprotokoll, um fortzufahren. Bereiten Sie die Live-Abbildungsmedium wie folgt; mischen DMEM phenolfrei mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mmol / l L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin. Pre-warm das Live-Imaging-Medium bei 37 ° C in einem Wasserbad.
  3. Entsorgen Sie das Medium der elektroporierten Zellen durch sterile Absaug- und 1 ml vorgewärmtes Live-Abbildungsmedium, ein P1000-Pipette und die Platte Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
  4. Während der Platte Inkubationszeit Zustrom 5% CO 2 in die Kammer des Mikroskop bereits bei einer stabilen Temperatur von 37 ° C.
  5. Legen Sie die Platte mit den elektroporierten Zellen in die Kammer des Mikroskops zu vermeiden großen Bewegungen oder Schwingungen.
  6. Mit Hilfe der Software-Schnittstelle, setzen Sie das Mikroskop, um sowohl die fluore zu erkennenscence Signale von den Fusionsproteinen durch die cotransfiziert Vektoren codiert, EYFP-Parkin (Anregungsbereich von 495 bis 510 nm und Emissionsbereich von 520 bis 550 nm, grün) und die pDsRed2-Mito (Erregungs maximal 558 nm und Emissionsmaximum 583 nm, rot).
    1. Öffnen Sie die Zeitraffer-Video-Mikroskopie-Software. Im oberen Menü wählen Sie die FITC für EYFP-Parkin und Rhodamin für pDsRed2-Mito. Im oberen Menü wählen Sie die Vergrößerung (20X).
  7. Mit Hilfe der Software-Schnittstelle, sucht die einzelne Zelle beide cotransfiziert Vektoren exprimieren, und die Position zu registrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis ein Minimum von 10 Zellen für jede experimentelle Bedingung (Versuchsgruppe) gesammelt wird.
    1. Wählen Sie das Menü "Apps" und klicken Sie auf Multi Dimensional Acquisition. In der Multi-Dimensional Acquisition Fenster wählen Sie die benötigten Parameter, wie etwa die Anzahl von Akquisitionen, der Zeitintervall zwischen jeder Aufnahme und die Position der aufgenommenen Zelle. Klicken Sie auf "Acquire", Um den Akquisitionsprozess zu starten.
  8. Starten Sie den basalen Erwerb von sowohl EYFP-Parkin und DsRed2-Mito Fluoreszenzsignal Bilder alle 5 min für einen Gesamtintervall von 15 Minuten zu sammeln.
  9. Bereiten vorgewärmten Live Bilderzeugungsmedium mit einer Konzentration von FCCP zweimal höher als die endgültige Arbeitskonzentration (0,1 bis 10 uM, zelltypabhängig).
  10. Unterbrechen Sie den Erfassungsprozess und fügen Sie vorsichtig 1 ml vorgewärmtes Live-Abbildungsmedium mit FCCP in die Platte im Inneren der Kammer des Mikroskops ein P1000-Pipette.
  11. Starten Sie den Akquisitionsprozess, wie zuvor beschrieben, für eine Gesamtdauer von 3 Stunden, die aufgezeichneten Position mit. Speichern Sie alle aufgenommenen Bilder, um sie zu analysieren und ein Video von der mitophagic Prozess erstellen, wenn der Erwerb vorbei ist.

3. Analyse

  1. Sammeln Sie alle aufgenommenen Bilder in "Tiff" Format auf einem PC
  2. Öffnen Sie die Bilder mit einer Grafik weichenware und definieren aufgetreten den zeitlichen Abstand von der mitochondrialen induzierte Depolarisation mit FCCP zum ersten Bild die Rekrutierung von Parkin in der mitochondrialen Membran zeigt (Bilder alle 5 min erworben werden). Wiederholen Sie diese Analyse für jede Zelle in der experimentellen Gruppe.
  3. Beschriften Sie die erste Zelle der Spalte auf einer Kalkulationstabelle mit dem experimentellen Gruppennamen. Für jede Versuchsgruppe, messen die zeitlichen Intervalle für Parkin Rekrutierung von mindestens 10 Zellen. Machen Sie einen Mittelwert der berechneten zeitlichen Intervalle für Parkin Rekrutierung und definieren die Standardabweichung für jede Versuchsgruppe (Mittelwert ± SD, N = 10).
    1. Organisieren Sie in Spalten die einzelnen berechneten zeitlichen Abständen. Jede Spalte enthält die n = 10 Messungen der Versuchsgruppe.
    2. Wählen Sie die Funktion "Mittelwert" aus der Formel-Generator-Menü. Wählen Sie die Daten in der Spalte. Wählen Sie die Funktion "Standardabweichung" aus der Formel-Generator-Menü. Select die Daten in der Spalte.
  4. Verwendung eines statistischen Ansatzes, zu vergleichen, um die experimentellen Gruppen die entsprechende Statistik, um die Anwendung einen signifikanten Unterschied in der Dynamik der Mitophagie zwischen den Versuchsgruppen zu definieren. (Zum Beispiel können zwei Gruppen = Student-t-Test, drei oder mehr Gruppen = ANOVA plus eine post-hoc - Test)

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Ergebnisse

Hier zeigen wir, wie Zeitraffer-Video-Mikroskopie eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden können molekulare Ereignisse von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in einer einzigen Zelle zu folgen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen auch, wie diese Technik für den Erwerb von Bildern hoher Qualität ermöglicht. Wenn Bilder des molekularen Verfahren, erhalten werden, haben wir die Möglichkeit, sie auf unterschiedliche Weise zu analysieren. Hier analysieren wir das Zeitintervall zwisc...

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Diskussion

Zeitraffer-Mikroskopie kann als Technik definiert werden, die auf die Beobachtung der Zelldynamik über lange Zeiträume in der Zeit lebenden Zellen aus einer einzigen Beobachtung erstreckt. Diese Methode unterscheidet sich von einer einfachen konfokalen oder Live-Zellmikroskopie, weil es dem Betrachter ermöglicht, in Echtzeit eine einzige fluoreszierende-markierten Protein und folgen Sie den dynamischen innerhalb einer einzelnen lebenden Zellen zu identifizieren. In der Tat identifiziert die konfokale Mikroskopie kann le...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-Zuschüsse (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 an R.G.P.), den Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core Grant P30CA056036 (R.G.P.), einen Zuschuss der Breast Cancer Research Foundation, großzügige Zuschüsse des Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) und einen Zuschuss des Pennsylvania Department of Health (R.G.P.) unterstützt. Zum Teil wurde diese Arbeit durch ein Postdoktorandenstipendium (G.D.) der American Italian Cancer Foundation und Bioimaging Shared Resource des Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30, CA-56036) unterstützt. Das Ministerium lehnt ausdrücklich die Verantwortung für eine Analyse, Interpretationen oder Schlussfolgerungen ab. Es gibt keine Interessenkonflikte, die mit diesem Manuskript verbunden sind.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMCorning Life Science10-013-CVVorwärmen bei 37 ° C vor Gebrauch
Phenolfrei DMEMCorning Life Science17-205-CVVorwärmen bei 37 ° C vor Gebrauch
Fötales RinderserumSigma-AldrichF2442Vorwärmen bei 37 ° C vor Gebrauch
L-GlutaminGibco25030Vorwärmen bei 37 ° C vor Gebrauch
Penicillin/StreptomycinCorning Life Science30-002-CIVorwärmen bei 37 ° C vor Gebrauch
EYFP-PARKIN ExpressionsvektorAddgene23955
pDsRed2-Mito ExpressionsvektorClontech632421
Nucleofector 2B GerätLONZAAAD-1001S
Nukleofector für Kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverses MikroskopCARL ZEISS
Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Referenzen

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