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Methodenartikel

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

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DOI:

10.3791/53673

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26. Februar 2016

 ,  , 
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Supraspinale Projektionen sind wichtig für die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen, und serotonerge Fasern sind eines dieser Fasersysteme. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Anwendung des kombinierten CLARITY/CUBIC-Protokolls auf das Rückenmark der Maus, um die Terminierung dieser serotonergen Fasern zu untersuchen.

Zusammenfassung

Langabsteigenden Fasern auf das Rückenmark sind für die Fortbewegung, die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen. Die Faserabschlußmuster im Rückenmark der Mehrheit dieser Fasersysteme wurden nicht gründlich in einer beliebigen Spezies untersucht. Serotonergen Fasern, die an das Rückenmark projizieren, wurden in Ratten und opossums auf histologischen Schnitten und ihre funktionelle Bedeutung abgeleitet wurde im Rückenmark auf ihre Faserabschlußmuster untersucht basiert. Mit der Entwicklung der Klarheit und kubischem Techniken ist es möglich, dieses Fasersystem und seiner Verteilung in das Rückenmark zu untersuchen, die bisher unbekannte Eigenschaften von serotonergen supraspinal Wege aufzuzeigen wahrscheinlich ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus die kombinierte CLARITY und CUBIC Techniken. Das Verfahren beinhaltet die Perfusion einer Maus mit einem Hydrogel-Lösung und Klärung des Gewebes mit einer combination Reagenzien zu löschen. Rückenmarksgewebe wurde in knapp zwei Wochen und die anschließende Immunfluoreszenzanfärbung gegen Serotonin gelöscht wurde in weniger als zehn Tagen abgeschlossen. Mit einem Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskop wurde das Gewebe abgetastet und ein 3D-Bild rekonstruiert wurde Osirix Software.

Einleitung

Supraspinale Projektionen sind verantwortlich für die Modulation verschiedener Verhaltensweisen wie z.B. der Schmerzwahrnehmung. Eine der Projektionen, die nozizeptive Informationen tragen, enthält serotoninerge Fasern, die aus der Raphe des Hinterhirns und den angrenzenden retikulären Kernenstammen 1,2. Physiologische und pharmakologische Studien haben eine vermehrte Freisetzung von Serotonin im Hinterhorn des Rückenmarks nach elektrischer Stimulation der Raphe-Kerne im Hinterhirnnachgewiesen 3-5. Bei der Ratte und dem Opossum haben die serotonergen raphespinalen Fasern dichte Endendigungen, nicht nur im Hinterhorn6-8, sondern auch in der Zwischenzone7,9,10, im Bauchhorn7,11 und sogar in der Lamina 1012,13. Es gibt keine ähnlichen Studien an der Maus. Ziel der vorliegenden Studie war es, das Terminationsmuster serotonerger Fasern, die aus den Raphe-Kernen des Hinterhirns und ihren angrenzenden retikulären Kernen im Rückenmark der Maus entstehen, unter Verwendung der kürzlich veröffentlichten CLARITY14-Methode und ihrer Modifikation - CUBIC15 - zu kartieren.

Die konventionelle Fluoreszenz- oder Peroxidase-Immunhistochemie des Rückenmarks zeigt deutlich die Verteilung der serotonergen Fasern in der grauen Substanz des Rückenmarks in 30-40 μm dicken Querschnitten. Dieser Ansatz zeigt jedoch nicht die Kontinuität der serotonergen Faserbahnen in der weißen Substanz und ihrer Kollateralen in der grauen Substanz. Obwohl die 3D-Rekonstruktion histologischer Schnitte unser Wissen über Faserbahnen erweitert hat, bleibt es für Histologen und Anatomen eine Herausforderung, einen einzelnen Trakt zu verfolgen, da durch das Schneiden kleine Verzerrungen im Gewebe verursacht werden. Um dieses Hindernis zu umgehen, haben eine Reihe von Forschern verschiedene Protokolle entwickelt, um die gesamte Gewebestruktur transparent zu machen und ein Bild von unverändertem Gewebe in einer einzigen Videodatei zu sammeln17-21. Bisher sind die klare, lipidausgetauschte, Acrylamid-hybridisierte starre, Bildgebungs-/Immunfärbungs-kompatible Gewebe-Hydrogel-Technik (CLARITY), die von Deisseroths Gruppe14,15 entwickelt wurde, sowie CUBIC, entwickelt von Susaki et al.16, am erfolgreichsten. Seit der Veröffentlichung der Protokolle haben viele Forscher begonnen, diese Techniken zu nutzen, um verschiedene Aspekte biologischer Gewebe zu untersuchen, darunter nicht nur das Gehirn22-25, sondern auch das Herz, die Nieren, den Darm und die Lunge26,27.

Durch Fixieren des Rückenmarks der Maus mit der Hydrogellösung (CLARITY) und Reinigen mit den CUBIC-Reagenzien (was eine viel schnellere Methode ist als die im ursprünglichen CLARITY-Protokollbeschrieben 14,15), wurde ein Rückenmarksgewebeblock von 2-3 mm Länge innerhalb von zwei Wochen beseitigt und die Immunfluoreszenzfärbung für Serotonin in acht Tagen abgeschlossen. Mit nur einer Kombination chemischer Wirkstoffe kann die konventionelle Immunhistochemie verwendet werden, um in etwa einem Monat ein Bild einzelner Faserbahnen in einer 3D-Videodatei zu erstellen.

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Protokoll

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) an der University of New South Wales (die zugelassene ACEC Nummer 14 / 94A).

1. Herstellung des Transparent-Maus Spinal Cord

  1. Herstellung von Ice Cold Hydrogellösung
    1. Herstellung von 16% Paraformaldehyd-Lösung (PFA)
      1. In 16 g Paraformaldehydpulver in 70 ml vorgewärmten destilliertem Wasser (50-55 ° C) und unter Rühren auf einem beheizten Magnetrührer bis Paraformaldehyd gelöst ist. Hinweis: Nicht in die Lösung über 55 ° C zu erwärmen und sich bewusst sein, dass Paraformaldehyd toxisch ist.
      2. Übertragen Sie die Paraformaldehydlösung zu einem Zylinder und mit destilliertem Wasser auf 100 ml. Kühlen Sie die Paraformaldehydlösung eine 4 ° C Kühlschrank mit.
    2. Man löst 125 mg VA-044-Initiator in 26,25 ml destilliertem Wasser und kühlt die Lösung in einem 4° C Kühlschrank.
    3. Cool 5 ml Acrylamidlösung (40%), 1,25 ml Bis-Lösung (2%) (ACHTUNG: Bis und Acrylamid-Lösungen sind giftig, können genetische Defekte oder Krebs verursachen), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA-Lösung und die VA-044 Initiatorlösung auf Eis.
    4. Mischen Sie die oben genannten Lösungen auf Eis.
      Bemerkung: das Gesamtvolumen 50 ml beträgt.
  2. Perfusions und Sammlung der Maus Spinal Cord
    1. Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und xyzaline (5 mg / kg) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Die Dosierung für die Maus kann für Ratten als niedriger sein.
    2. Auf einem geeigneten Kunststoffoberfläche in einer Abzugshaube, befestigen Sie die Schenkel der Maus vom Körper weg (Klebeband ist wirksam), sobald die Maus auf eine Prise seiner Haut des Fußes reagiert nicht.
    3. Schneiden Sie die Maus Haut über der Brust und dann die Knochen Brust das Herz mit einer Schere zu belichten.
    4. Mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit einer 25 G Nadel befestigt Atee Ende des Schlauchs, legen Sie die Nadel in den linken Ventrikel des Herzens, schnippeln in den rechten Vorhof ein Ausgangspunkt für das Blut zu schaffen und dann mit 40 ml 0,9% physiologischer Kochsalzlösung mit einer Rate von etwa 10 ml / min beginnen Waschen.
    5. Wenn Sie fertig sind, perfuse die Maus mit 35 ml eiskaltem Hydrogel-Lösung.
      Anmerkung: mit einer Geschwindigkeit von 10 ml perfundieren / min Quellung des Nervengewebes zu vermeiden.
    6. Inzision in die Haut über den Rücken mit einem Messer und dann die Muskeln entfernen neben dem wirbel. der Wirbelbögen, auf der einen Seite nach dem Schneiden und sie auf die andere Seite, nehmen Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule mit einer feinen Schere Spiegeln.
  3. Löschen der Maus Spinal Cord
    1. Legen Sie das Rückenmark in 15 ml Hydrogel-Lösung über Nacht bei 4 ° C.
    2. Entfernen Sie 10 ml des Hydrogels Lösung und gießen Sie den Rest der Lösung mit den Rückenmarksegmente zu einem 5-ml-Tube. Füllen Sie das 5-ml-Röhrchen mit dem Hydrogel-Lösung, bis er vollständig gefüllt ist.
    3. Strecken Sie ein kleines Stück Parafilm über den oberen Teil der 5-ml-Tube und dann wickeln Parafilm um den Hals des Rohres. Hinweis: Achten Sie darauf, die Kontakte Parafilm das Hydrogel-Lösung und es gibt keine Blasen zwischen dem Hydrogel-Lösung und der Parafilm.
    4. Setzen Sie die 5-ml-Röhrchen in einem 37   Ofen über Nacht ° C. Beachten Sie die Hydrogel-Lösung, bis es ein Gel wird.
    5. Nehmen Sie die 5-ml-Röhrchen aus dem Ofen heraus und entfernen Sie das Gel aus der Tube mit einem Schraubenschlüssel (wie ein geschaufelt 1 ml Pipettenspitze). Entfernen Sie das Gel aus dem Rückenmarksgewebe durch das grobe Gewebe auf das Gel kleben und dann die groben Gewebe entfernt (das Gel mit dem Gewebe haften und wird daher von dem Gewebe entfernt werden).
    6. das Gel aus dem Rückenmarksgewebe, waschen das Rückenmark 4-mal mit 1x PBS (pH 7,4) für 24 Stunden auf einem Schüttler Nach dem Entfernen.
    7. Bereiten Sie die CUBIC Clearing-Lösung durch Auflösen von 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N ', N'-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml destilliertem Wasser.
      Hinweis: Ein heißer Rührer verwendet wird. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und kühlt auf Raumtemperatur.
      Hinweis: 10 g dieser drei Chemikalien sind für eine Maus.
    8. Schneiden Sie das Rückenmark der Maus koronalen in 2-3 mm lange Segmente mit einer Rasierklinge und steckte sie in 5 ml der obigen CUBIC Clearing-Lösung. Platzieren auf einem Schüttler in dem Ofen bei 37   ° C für 3 Tage.
    9. Drei Tage später, ändern Sie die Clearing-Lösung auf ein frisches. Anmerkung: Die obige Lösung wird vor der Verwendung hergestellt.
    10. Zwei bis drei Tage später nach der CUBIC Clearing-Lösung erfrischend, überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes gegen ein Papier mit Schrift 8 Buchstaben. Wenn es transparent ist, können die Buchstaben durch die gelöscht Gewebe zu sehen. Entfernen Sie die Clearing-Lösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) das Gewebe 4-mal pro Tag (alle 6 Stunden) zu waschen.

2. Immunfluoreszenzanfärbung

  1. Inkubieren der Rückenmarksegmente in der primären Antikörperlösung (anti-Serotonin, in rabbit angehoben, verdünnt 1: 100 in PBST) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C.
  2. Entfernen Sie die Antikörperlösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), um die Rückenmarksegmente 4 mal pro Tag (alle 6 Stunden) in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen.
  3. Entfernen Sie die PBST-Lösung und fügen Sie den sekundären Antikörper-Lösung (594 konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, 1: 100 verdünnt in PBST), um das Gewebe für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C Ofen inkubiert.
  4. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und 4 ml PBST Rückenmark Segmente 4-mal täglich zu waschen (alle 6 Stunden) auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. Am nächsten Tag ist das Gewebe für die Bildgebung bereit.

3. Imaging

  1. Entfernen Sie die PBST-Lösung und 4 ml 85% Glycerin auch den Brechungsindex des Gewebes zu machen.
  2. Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald klar in etwa 1 Stunde, legte das Gewebe, auf einem großen, dünnen Glasträger, die den Halterahmen des Multi Foto Fluoreszenzmikroskop passt.
  3. Ein paar Tropfen von 85% Glycerin neben dem Rückenmarksgewebe und das Deckglas mit einem 22 x 50 mm 2 Deckglas.
    Hinweis: Die Ausrichtung des Rückenmarks entscheidet, wie das Bild aussieht.
  4. Setzen Sie den Glasobjektträger auf den Halterahmen des Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskop und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen.
  5. Wählen Sie den Helium-Neon-Laser-Linie 594 nm und stellen Sie die Intensität des Lasers auf das optimale Niveau, indem die Helligkeit des positiven Signals im Livebild zu überprüfen.
  6. Wählen Sie den Scanbereich des Rückenmarksgewebe das 20x-Objektiv mit (in Wasser, NA 0,7) und bereiten Sie einen Z-Stapel zu schaffen, und die Tiefe jeder Schritt auf 3 & mgr; m.
  7. Scannen Sie das Gewebe von oben nach unten in der z-Stapel unter dem 20X objective und 63X Ziel dann (in Öl, NA 1,4) (Schrittweite betrug 1 & mgr; m) sind. Rekonstruieren von 3D - Videos mit einer 3D - Software - 28.

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Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse von Serotonin-Antikörper-Färbung in der transparenten Rückenmark der Maus eine Kombination aus der CLARITY und CUBIC-Protokolle. Wir zeigen , dass serotonerge Fasern in allen Schichten des Rückenmarks vorhanden sind , mit einer Vorherrschaft im ventralen Teil des ventralen Horn (Abbildung 1, siehe auch Video 1). Das Kontrollgewebe hatte keine positive Fasern (Ergebnis nicht gezeigt). Im ventralen Horn, dicht gepackte...

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Diskussion

Das Protokoll beschrieben zeigt, wie auf Bild serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus mit dem kombinierten CLARITY und CUBIC Techniken. Es wird ein schneller Clearing - Prozess im Vergleich zum passiven Clearing - Protokoll von Cheung et al. Entwickelte 14 und Tomer et al. 15 und ermöglicht es dem Rückenmarksgewebe gut durch das Hydrogel während Clearing unterstützt werden.

Ein wichtiger Schritt bei der Fixierung der Rückenmark der Maus, wie von Che...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), ein NHMRC-Projektstipendium (#1086643). Prof. George Paxinos wird durch ein Senior Principal Research Fellow NHMRC Stipendium (#1043626) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Photoinitiator VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40%ige AcrylamidlösungBio Rad161-0140http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2%ige Bis-LösungBio Rad161-0142http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
ParaformaldehydSigma158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
HarnstoffMerck Millipore66612http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N',N'-Tetrakis (2-Hydroxypropyl)-ethylendiaminMerck Millipore821940http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamin-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100Merck Millipore648462http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
SaccharoseSigmaS0389http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
Serotonin-AntikörperMerck MilliporeAB938http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor® 594-KonjugatLife Technologies  A-11012https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
MultiphotonenmikroskopLeicaLeica TCS SP5 MP STEDhttp://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

Referenzen

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CLARITY TechnikGewebekl rungimmunfluoreszenzmarkierungMultiphotonenmikroskopie3D BildrekonstruktionHydrogel PerfusionAntik rperf rbung
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