Methodenartikel

Synthese von Cd-frei InP / ZnS-Quantenpunkte Geeignet für biomedizinische Anwendungen

DOI:

10.3791/53684

⸱

6. Februar 2016

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1Department of Chemistry, Missouri State University, 2Center for Molecular Microscopy, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research

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Zusammenfassung

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In diesem Protokoll wird die Synthese von Cd-freien InP/ZnS-Quantenpunkten (QDs) detailliert beschrieben. InP-basierte QDs werden aufgrund der Toxizität von Cd2+-Ionen, die durch den Abbau von Nanopartikeln freigesetzt werden können, immer beliebter. Nach der Synthese werden QDs unter Verwendung eines amphiphilen Polymers in Wasser solubilisiert, um sie in biomedizinischen Anwendungen einzusetzen.

Zusammenfassung

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Fluoreszierende Nanokristalle, insbesondere Quantenpunkte, waren ein nützliches Werkzeug für viele biomedizinische Anwendungen. Für einen erfolgreichen Einsatz in biologischen Systemen sollten Quantenpunkte stark fluoreszierend und klein/monodispers groß sein. Während häufig verwendete Quantenpunkte auf Cadmiumbasis diese Eigenschaften besitzen, sind sie aufgrund der möglichen Freisetzung von Cd2+-Ionen durch den Abbau von Nanopartikeln potenziell toxisch. Indiumbasierte Quantenpunkte, insbesondere InP/ZnS, wurden kürzlich aufgrund ihrer relativ ähnlichen Fluoreszenzeigenschaften und -größe als praktikable Alternative zu cadmiumbasierten Quantenpunkten untersucht. Die hier vorgestellte Synthese verwendet Standard-Heißinjektionstechniken für ein effektives Nanopartikelwachstum; Die Eigenschaften von Nanopartikeln wie Größe, Emissionswellenlänge und Emissionsintensität können sich jedoch aufgrund kleiner Änderungen der Reaktionsbedingungen drastisch ändern. Daher sollten Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Reaktionsdauer und Vorläuferkonzentration genau beibehalten werden, um reproduzierbare Produkte zu erhalten. Da Quantenpunkte in wässrigen Lösungen nicht von Natur aus löslich sind, müssen sie auch einer Oberflächenmodifikation unterzogen werden, um ihre Löslichkeit in Wasser zu erhöhen. In diesem Protokoll wird ein amphiphiles Polymer verwendet, um sowohl mit hydrophoben Liganden auf der Quantenpunktoberfläche als auch mit Lösungsmittel-Wassermolekülen zu interagieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Synthese von hochfluoreszierenden InP/ZnS-Quantenpunkten bereitgestellt, die für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen geeignet sind.

Einleitung

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Quantum Dots (QD) sind halbleitende Nanokristalle, die fluoreszierende Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit Licht bestrahlt ein. Aufgrund ihrer geringen Größe (2-5 nm), die viele größere Biomoleküle ähnlich ist, und eine einfache Biofunktionalisierung, QD sind ein äußerst attraktives Werkzeug für biomedizinische Anwendungen. Sie haben Verwendung in der biologischen Kennzeichnung, Einzelmolekül-Lebendzell-Imaging, Arzneimittelabgabe, in-vivo-Bildgebung, Erregernachweis und Zellverfolgung, unter vielen anderen Anwendungen gefunden 08.02.

CD-basierten Quantenpunkte wurden am häufigsten in biomedizinischen Anwendungen verwendet, wegen ihrer intensiven Fluoreszenz und schmale Emissionspeakbreiten 9. Allerdings haben Bedenken wegen der möglichen Toxizität von Cadmium angehoben worden 2+ -Ionen 10, die durch den Abbau des Nanopartikel freigesetzt werden können. Vor kurzem InP-basierten Quantenpunkte wurden als Alternative zu CD-basierten Quantenpunkte untersucht, weil sie viele Fluoreszenzeigenschaften beibehaltenvon CD-basierten Quantenpunkte und kann biokompatibler 11 sein. CD-basierten Quantenpunkte wurden signifikant toxisch zu sein als InP-basierten Quantenpunkte in in vitro-Tests in Konzentrationen so niedrig wie 10 Uhr, nach nur 48 Stunden 11 gefunden.

Die Fluoreszenzemissionsfarbe von QD ist größen abstimmbaren 1. Das heißt, wenn die Größe der QD zunimmt, nimmt die Fluoreszenzemission der roten verschoben. Die Größe und Größen Dispersität der QD-Produkte können durch Ändern der Temperatur, Reaktionsdauer, oder Vorläuferkonzentrationsbedingungen während der Reaktion 12 modifiziert werden. Während die Emissionsspitze von InP QD ist typischerweise breiter und weniger intensiv als CD-basierte QD, InP Quantenpunkte können in einer Vielzahl von Farben hergestellt werden entworfen spektrale Überlappung zu vermeiden, und 12 für die meisten Anwendungen ausreichend intensiven biomedizinischen sind. Die Synthese in diesem Protokoll detailliert ergibt QD mit einer roten Emissionsspitze bei 600 nm zentriert ist.

Sind mehrere Schritte af genommenter Synthese der QD-Kerne, die optische Integrität der Quantenpunkte zu erhalten und sie für biologische Anwendungen kompatibel zu machen. Die Oberfläche des Kern QD müssen vor Oxidation oder Oberflächenfehler geschützt werden, die dazu führen können Abschrecken; Daher wird ein ZnS Schale über den Kern beschichtet InP / ZnS (core / shell) QDS 13 zu erzeugen. Diese Beschichtung wurde die Photolumineszenz des QD Produkt zu schützen gezeigt. Die Gegenwart von Zinkionen während InP QD-Synthese wurde 12 gezeigt, um Oberflächenfehler zu begrenzen, sowie Abnahme Größenverteilung. Selbst bei der Anwesenheit von Zn 2+ in dem Reaktionsmedium, Synthese von InZnP sind höchst unwahrscheinlich 12. Nach der Beschichtung, was InP / ZnS-QDs in hydrophoben Liganden, wie Trioctylphosphinoxid (TOPO) oder Oleylamin 12,14 beschichtet. Ein amphiphiles Polymer mit hydrophoben Liganden auf der Oberfläche QD sowie Schüttwassermolekülen interagieren, um Wasserlöslichkeit 15 verleihen. Amphiphile Polymere mit carboxylate chemischen Gruppen können als "chemische Griffe" verwendet werden, um die QD funktionalisieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Funktionalisierung von wasserlöslichen InP / ZnS QD mit sehr intensiven Fluoreszenzemission und relativ geringe Größe-Dispersität. Diese Quantenpunkte sind möglicherweise weniger toxisch als häufig verwendete CdSe / ZnS-Quantenpunkte. Hierin stellt die Synthese von InP / ZnS-QDs eine praktische Alternative zum CD-basierten Quantenpunkte für biomedizinische Anwendungen.

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Protokoll

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1. Synthese von Indium-Phosphid / Zinksulfid (InP / ZnS) Quantum Dots

  1. Synthese von Indiumphosphid (InP) Quantum Dot Cores
    1. Setzen Sie einen 100 ml Rundkolben, 3-Hals-Kolben mit einem 12-Zoll-Kondensator. Mit einem Vakuum für 1 Stunde 30 ml Oleylamin (OLA), 0,398 g Indium (III) chlorid (InCl 3), 0,245 g Zink (II) chlorid (ZnCl 2) und rühren während bei RT zu evakuieren. Die Lösung sollte mit einem weißen Niederschlag farblos erscheinen.
    2. Unter Verwendung eines Heizmantels mit einem Thermoelement und proportional-integral-derivative (PID) Temperaturregler, erhöhen die Temperatur der Lösung auf 120 ° C. Evakuieren die Lösung unter Vakuum für 20 min mit niedrigem Siedepunkt, um Verunreinigungen zu entfernen, die Kernwachstum auswirken können.
      Anmerkung: Es ist zwar möglich, ein Sandbad und Thermometer zu verwenden, unter Verwendung eines Heizmantels und PID erhöht die Homogenität und Reproduzierbarkeit der Reaktionsprodukte.
    3. Unter Schutzgas (zB, N 2), die Lösung unter Rückfluss und die Temperatur auf 220 ° C für 15 min erhöhen. Die InCl 3 und ZnCl 2 vollständig aufzulösen, wodurch eine blassgelbe Lösung. Lassen Sie die Temperatur für 10 min zu stabilisieren.
    4. Spülen Sie eine Einweg, 3 ml Kunststoffspritze und 4 Zoll, 22 G-Nadel mit Stickstoffgas. Unter Verwendung der Spritze, liefern schnell 0,5 ml Tris (dimethylamino) phosphin (TDMAP) an die InCl & sub3; -Lösung. Die Temperatur der Lösung sinkt leicht und kehrt zu 220 ° C. Die Lösung ändert sich von transparent, hellgelb bis opak, schwarz.
    5. Nach 9,5 min, der Reaktionskolben aus dem Heizmantel entfernen, bis die Temperatur unter 200 ° C sinkt. Um die Integrität der InP-Kerne schützen, gehen direkt an die ZnS-Beschichtung in Schritt 1.2.1.
  2. Synthese von Zinksulfid (ZnS) Quantum Dot Shells
    1. Setzen Sie den Reaktionskolben aus Schritt 1.1.5 auf einem Heizpilz und stabilisieren die temperatur bei 200 ° C. Langsam 3,58 g Dodecanthiol (DDT) im Verlauf von 15 sec auf die Lösung, die InP-Quantenpunkte hinzuzufügen. Lassen Sie die Lösung für 1 Stunde zu reagieren.
      Anmerkung: ZnS Schalendicke kann durch Erhöhen oder Verringern der Menge an Zinkstearat in Schritt 1.2.4 hinzugefügt variiert werden. Die Veränderung der Menge an ZnCl 2 oder Dodecanthiol in Schritten 1.1.1 und 1.2.1 kann erheblich die Qualität der Quantenpunkte beeinflussen, indem sie die Reaktionskinetik zu ändern.
      1. Danach entfernen die Reaktionskolben aus dem Heizmantel und die Lösung auf etwa 60 ° C zu kühlen.
    2. Sobald die InP / ZnS Lösung erreicht ~ 60 ° C, 10 ml Hexan und übertragen die gesamte Lösung von etwa 45 ml bis 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe (3.000 × g für 10 min) nicht umgesetzten festen Vorläufer zu entfernen.
    3. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein 250-ml-Polypropylen-Zentrifugenflasche, 200 ml Aceton und Zentrifuge die Lösung (3.000 xg für 10 min) InP / ZnS QDs auszufällen. Dieses Volumen kann auch gleichmäßig in vier 50-ml-Röhrchen für die Zentrifugation aufgespalten werden, wenn eine Zentrifuge mit den notwendigen Rotor / Zubehör, das nicht zur Verfügung steht. Dekantieren des Überstandes und trocknen Sie die QD Pellet gründlich mit Stickstoffgas Aceton zu entfernen.
    4. Resuspendieren der Quantenpunkte in 20 ml OLA Beschallung verwenden, übertragen auf einen 50 ml Rundboden, 3-Hals-Kolben mit 0,474 g Zinkstearat und umrühren. Evakuieren die Lösung unter Vakuum für 20 min bei RT.
    5. Unter Stickstoffgas, die Temperatur auf 180 ° C erhöht und damit die Reaktion 3 Stunden ablaufen. Zwar gibt es keine merklichen visuellen Änderungen zu der Reaktionslösung, die bei dieser Reaktion auftreten, erhöht Dicke ZnS Schale Zinkstearat Hinzufügen somit QY Erhöhung durch Oberflächenpassivierung QD 12 zu verbessern. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, die Kolben aus dem Heizmantel entfernen und die Lösung auf etwa 60 ° C zu kühlen.
    6. Sobald die InP / ZnS solutiauf Lauf ~ 60 ° C, in den ein 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen 20 ml Hexan und übertragen. Zentrifugieren Sie die Probe (3.000 × g für 10 min) auf nicht umgesetzte Zinkstearat entfernen.
    7. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein 250-ml-Polypropylen-Zentrifugenflasche, 200 ml Aceton und Zentrifuge die Lösung (3000 g für 10 min) InP / ZnS-QDs zu fällen. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und gründlich mit Stickstoffgas trocken Aceton zu entfernen.
    8. Man löst den InP / ZnS QD Pellet in 30 ml Hexan. Vortex und beschallen die Lösung kurz vollständige Dispersion zu gewährleisten.
    9. Wiederholen Reinigungsschritte 1.2.6-1.2.8 zwei weitere Male gründliche Entfernung von überschüssigem organischen Liganden zu gewährleisten. Wechselwirkungen zwischen dem amphiphilen Polymer und dem QD in Schritt 1.2 kann in Gegenwart von überschüssigem Liganden beeinträchtigt werden.
    10. Mit Berechnungen von Xie detailliert, et al. 16, bestimmen die Größe und Konzentration der synthetisierten InP / ZnS-QDs mit UV-Vis-Spektroskopie.
      Anmerkung: Die wichtige spektrale Charakteristik für diese Analyse ist die Schulter des Absorptionspeaks. Die Wellenlänge und Absorptionswert des Maximums dieser Schulter dient dazu, die Größe und die Konzentration der Quantenpunkte zu berechnen, respectively. Diese Reaktion ergibt typischerweise etwa 5 & mgr; mol QD mit einem Emissionspeak bei 600 nm. Bis QD der verschiedenen Farben synthetisieren, die Dauer und / oder Temperatur der Reaktion kann geändert werden. Eine längere Reaktionszeit und / oder höhere Temperatur der Lösung führt zu einer Rotverschiebung Emissionspeak. Zum Beispiel, Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 240 ° C und Aufrechterhalten Reaktionszeit von 10 min wird in QD mit einem 680 nm höchstens Emissionen Spitze führen. Ebenso reduziert die Reaktionszeit auf 2 Minuten und verwendet Zinkchlorid Verdoppelung in QD mit einem 470 nm maximale Emissionsspitze führen. Diese InP / ZnS-QDs sind stabil für mindestens einen Monat bei 4 ° C im Dunkeln unter Schutzgas.

2. WasserSolubilisierung von InP / ZnS-Quantenpunkte unter Verwendung eines amphiphilen Polymers

  1. Wasser Solubilisierungsmethode
    1. Unter Verwendung der InP / ZnS QD aus Schritt 1.2.10, verdünnte einen Teil der Quantenpunkte mit Hexan von 1 uM QD zu erhalten 1 ml.
      1. In einem Zentrifugenröhrchen, übertragen 0,25 ml InP / ZnS-QDs in jedes Röhrchen. 1 ml Aceton oder Methanol zu dem Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge (3.000 × g für 10 min). Den Überstand sorgfältig entfernen und jeder Niederschlag in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) lösen.
      2. Übertragen Sie die InP / ZnS-QDs in THF in einen 100-ml-Rundkolben und verdünnt mit 16 ml THF. Um die Anzahl der Aggregate in der Lösung reduzieren, beschallen die Quantenpunkte für 5-10 min.
    2. Man löst 30 mg Poly (Maleinsäureanhydrid andhydride- alt -1-Octadecen), 3- (Dimethylamino) -1-propylamin (pMAL-d) in 10 ml Molekularreinem Wasser. Wasserbad Beschallung oder leichtem Rühren, bis die Lösung durchscheinend ist ausreichend, um das Polymer vollständig aufzulösen. DasVerwendung von Wirbel oder kräftigem Rühren kann viele Blasen erzeugen, die Wechselwirkung des Polymers mit dem QD behindert. In den 10 ml Polymerlösung auf den 100-ml-Rundkolben, der InP / ZnS-QDs in THF.
    3. Verdampfen THF aus dem QD / Polymerlösung mit einem Rotationsverdampfer. Der Kolben wird in einem Eisbad während Eindampfen der Wechselwirkung zwischen dem Polymer und QD zu erleichtern. Je nach Stärke des Vakuums wird das meiste THF nach 10 min verdampft und die Lösung wird trüb.
      1. Sobald die Lösung auf 10 ml eingedampft wird, der Kolben vom Rotationsverdampfer entfernen und 30 ml molekularen Grad Wasser. Bringen Sie den Kolben am Rotationsverdampfer und weiter bis 2 ml zu verdampfen. Dieser letzte Verdampfungsschritt kann viele Stunden dauern; sicherzustellen, das Eisbad aufrechterhalten wird.
    4. Entfernen Sie die wasserlöslichen InP / ZnS-QDs aus dem Rundkolben mit einer Pipette. Filtern Sie die QD-Lösung mit einer 3 ml-Kunststoffspritze an einem 0,1 um Nylon syringe filtriert in ein 5 ml Zentrifugenröhrchen.
    5. Legen Sie die Quantenpunkte in einer 20.000 MWCO-Membran Dialysestation und Dialyse gegen 0,05 M Boratpuffer pH 8,5, um überschüssige Polymer entfernen. (Langsam 0,05 M Natriumtetraborat-Decahydrat und 0,05 M Borsäure, unter starkem Rühren, bis der pH 8.5 ist diese Boratpufferlösung zu machen.) Einen Vakuumkonzentrator Verwendung konzentrieren sich die Quantenpunkte in Boratpuffer auf 1 ml.
    6. Für die Lagerung, Säuberung der Lösung mit Stickstoffgas vor mit Parafilm versiegelt. Die wasserlöslichen InP / ZnS QD sind stabil für mindestens 4 Monate bei 4 ° C im Dunkeln.

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Ergebnisse

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Die unbeschichteten InP Kerne zeigen keinen wesentlichen sichtbare Fluoreszenz mit dem Auge. Allerdings InP / ZnS (core / shell) Quantenpunkte erscheinen hell unter UV-Bestrahlung von Auge zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz von InP / ZnS-QDs wurde mit Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert. Das Fluoreszenzspektrum von QD in Hexanen (Abbildung 1) bei 533 nm angeregt wird mit einer Halbwertsbreite (FWHM) von 73 nm bei 600 nm zentriert einen Hauptpeak zeigt. Während Extin...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt die Synthese hochFluoreszenz InP / ZnS QD, die in vielen biologischen Systemen verwendet werden können. Die QD-Produkte hier synthetisiert zeigte einen einzelnen Peak Fluoreszenzemission bei 600 nm mit einer FWHM von 73 nm (Abbildung 1) zentriert ist, die zu anderen zuvor beschriebenen Synthesen 12 vergleichbar ist. Die Reaktionszeit und Reaktionstemperatur sind sehr wichtige Schritte wegen ihrer tiefgreifende Wirkung auf QD Synthesequalität und Reproduzierbarkeit....

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Institut für Chemie und das Graduiertenkolleg in Missouri State University für ihre Unterstützung dieses Projektes. Wir erkennen auch die Elektronenmikroskopie-Labor an der Friedrich National Laboratory for Cancer Research für die Nutzung ihrer Transmissionselektronenmikroskop und kohlenstoffbeschichtetes Gitter.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
OleylaminAcros129540010
Zink(II)-chloridSigma030-003-00-2
Indium(III)-chloridChem-Impex24560
Tris(dimethylamino)phosphinEncompass50-901-10500
1-DodecanthiolAcros117625000
Hexane Fisher SciH292-4
AcetonTransChemicalUN 1090
ZinkstearatAldrich Chem307564-1KG
TetrahydrofuranAcros34845-0010
Molecular WaterFisher SciBP2470-1
Poly(maleic anhyrdride-alt-1-tetradecen), 3-(Dimethylamino)-1-propylaminderivatSigma90771-1G
BorsäureFisher SciBP168-500
Natriumtetraborat-DecahydratFisher SciBP175-500
Rhodamin BAldrich ChemR95-3
StickstoffgasAirgasUN1066
TrypanblauThermo SciSV30084.01
3 ml Luer-Lock-Spritze aus KunststoffBD309657
Luer-Lock-NadelAir-Tite83000144714 Zoll, 22 Gauge
50 ml Polypropyen-ZentrifugenröhrchenFalcon352098
250 ml ZentrifugenflascheThermo Sci05-562-23Nalgene PPCO
5 ml ZentrifugenröhrchenArgos-TechT2076
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenBio Plas4150
0,1 μ m SpritzenvorsatzfilterWhatman6786-1301Puradisc 13 mm Nylonfilter
Slide-A-Lyzer MINI DialysegerätThermo Sci6959020.000 MWCO
RotationsverdampferHeidolph
Centrifuge 5072EppendorfSchwingschaufel mit 50  ml Tube Adapter
Lambda 650 UV/VIS SpektrometerPerkin ElmerUV-Vis Spektralphotometer
LS 55 FluoreszenzspektrometerPerkin ElmerFluorometer
Axio Observer.A1ZeissEpifluoreszenzmikroskop
AxioCam MRmZeissCCD Kamera
Tecnai TF20 MikroskopFEITransmisison Electron Miscroscope
TEM Eagle CCDFEITEM CCD Kamera
NanoBrook Omni DLSBrookhavenDynamisches Lichtstreuinstrument

Referenzen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 2/29/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:

Katye M. Fichter

from:

Kathryn M. Fichter

Schlagwörter

Quantenpunkt SyntheseHot Injection VerfahrenOberfl chenmodifikationWasserl slichkeitUV Vis SpektroskopieTransmissionselektronenmikroskopieZellviabilit tsassayFluoreszenzspektroskopie

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