Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Etablierung von primären Fibroblasten/Myofibroblasten (MF)-Kulturen aus gefrorenen Magen-, kleinen Darm- und Dickdarmgewebe-liefernden Zellen mit einem MF-Phänotyp vorgestellt. Diese Zellen exprimieren CD90, α-SMA und Vimentin. MFs können für eine Vielzahl von funktionellen Assays verwendet werden, einschließlich enzymatischer Aktivität und Zytokinproduktion.

Zusammenfassung

Fibroblasten / Myofibroblasten (MFS) wurden immer mehr an Aufmerksamkeit für ihre Rolle in der Pathogenese und ihre Beiträge sowohl für die Wundheilung und die Förderung der Tumor-Mikroumgebung. Zwar gibt es derzeit viele Techniken zur Isolierung von Marktfaktoren von gastrointestinalen (GI) Gewebe, dieses Protokoll ein neues Element der Isolierung dieser Stromazellen aus gefrorenem Gewebe. Einfrieren GI Gewebeproben nicht erlaubt nur dem Forscher Proben aus weltweit Mitarbeiter, Biobanken und kommerziellen Anbietern zu erwerben, es erlaubt auch die verzögerte Bearbeitung von frischen Proben. Die beschriebenen Protokoll konsequent liefern charakteristische spindelförmige Zellen mit dem MF-Phänotyp, der die Marker CD90, α-SMA und Vimentin auszudrücken. Da diese Zellen aus Patientenproben abgeleitet ist, verleiht die Verwendung von primären Zellen auch den Vorteil der eng nachahmt MFs an Krankheitszuständen, nämlich Krebs und entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik hat been im Magen, Dünndarm und Dickdarm-MF Primärkulturerzeugung validiert. Primär MF Kulturen können in einer Vielzahl von Experimenten, über eine Anzahl von Durchgangs verwendet werden, und ihre Reinheit sowohl durch Immunzytochemie beurteilt und Durchflusszytometrie-Analyse.

Einleitung

Myofibroblasten / Fibroblasten (MFS) stellen eine reiche Population von Zellen in der gastrointestinalen (GI) Schleimhaut. Diese Stromazellen gerade unterhalb von Epithel und bilden ein miteinander verbundenes Netzwerk innerhalb Schleimhaut Lamina propria im Darm. MFs sind nicht nur für die Ablagerung der extrazellulären Matrix verantwortlich, sondern durch parakrine Regulation kann Elektrolyttransport, Rückgabe und Barrierefunktion der benachbarten Epithel ^{1, 2} beeinflussen. Weiterhin haben MFs gezeigt, dass eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Gewebe spielen Umbau ^{3, 4.} Myofibroblasten sind ein kritischer Teil der Tumor-Mikroumgebung, wo sie auch als Krebs assoziierten Fibroblasten bekannt, und dazu beitragen, die das Tumorzellwachstum und dienen als Nische für Krebsstammzellen ^3. Schwellen Daten legt nahe, dass Marktfaktoren können auch als lokale Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Zusätzlich MFs Funktion als wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort, producing eine Vielzahl von Cytokinen und ^{Wachstumsfaktoren. 5}

Bei gesunden Menschen werden MFs Zellen vermutlich aus mesenchymalen Stammzellen zu differenzieren und Express auf ihrer Zelloberfläche, die mesenchymalen Marker CD90 ^{3, 5.} Diese Zellen sind auch positiv für Vimentin, aber negativ für Epithelzellen und hämatopoetischen Zellmarker EpCAM und CD45 , beziehungsweise. Myofibroblasten werden vorgeschlagen, um eine aktivierte Form von Fibroblasten und kann aus nicht-aktivierten Fibroblasten durch die Expression von α-SMA ⁵ unterscheiden.

Im Laufe des letzten Jahrzehnts mehrere Ansätze zur Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Darmschleimhaut wurden veröffentlicht, meist auf der ursprünglich von Mahida et al. ^5-8 beschrieben berechnet. Während einzelne Studien berichten Isolierungsverfahren aus verschiedenen Darmschleimhaut, kein universelles Protokoll für die Isolierung von Marktfaktoren aus mehreren Bereichen des GI-Trakts (dh Magen, kleine und large Darmschleimhaut) ist erschienen. Die hierin enthaltenen Protokoll wurde getestet und für alle drei Gewebetyp oben erwähnt erfolgreich eingesetzt. . Darüber hinaus wurden Verfahren zur Isolierung von Marktfaktoren aus gefrorenen GI-Schleimhaut nicht berichtet worden.

Wir stellen hier ein optimiertes Verfahren, die auf enzymatische Verdauung basiert, und gleichzeitig ermöglicht die Isolierung menschlicher Darmschleimhaut MFs für Kultur und Durchflusszytometrie-Analyse in frisch gespalten, einzelne Zelle, Schleimhaut Zubereitungen. Diese Technik zuverlässig liefert Primärkulturen mit einem MF-Phänotyp. Darüber hinaus können die gleichen Methoden verwendet, um die MFS an der gefrorenen Proben von Magen und Dünndarm-Gewebe zu isolieren, als auch werden. Isolierung von Myofibroblasten aus frischem Gewebe GI zuvor beschrieben wurde; jedoch die Verwendung von gefrorenen Proben stellt viele Vorteile. Das heißt, die Forscher würden von einer beliebigen Anzahl von Mitarbeitern auf der ganzen Welt, die die Capabi müssen in der Lage, sammeln und speichern Gewebenkeit auf den eingefrorenen Gewebeproben zu versenden. Darüber hinaus können die Forscher die Sammlung von gebrauchten Gewebe aus dem Operationssaal und / oder Endoskopie-Suite und sofortige Bearbeitung des Gewebes für die Isolierung, um Konflikte mit ihren aktuellen Experimente Plan zu finden. Auch aufgrund der Unvorhersehbarkeit der Chirurgie, Gewebeentnahme kann sehr spät in den Tag kommen, was die Zeit für die Verarbeitung Gewebe links begrenzen. Einfrieren Gewebe für die spätere Verarbeitung werden diese Herausforderungen zu verbessern.

Schließlich sind diese Verfahren wurden erfolgreich bei der Isolierung von Kolon, Magen und Dünndarm Myofibroblasten bei Krankheitszuständen, wie beispielsweise Dickdarmkrebs und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt.

Protokoll

Das Protokoll für den Erhalt verworfen menschlichem Gewebe von chirurgischen Patienten und die Einrichtung von Primärkulturen wurde von der University of Texas Medical Branch and University of New Mexico Institutional Review Boards genehmigt. Die allgemeinen Anforderungen an die Beschaffung menschlicher Gewebeproben ist unten beschrieben. Beachten Sie, dass seit dem Marktfaktoren können von gefrorenem Gewebe, Biobanken und kommerziellen Anbietern isoliert werden auch praktikable Möglichkeiten.

1. Besorgen Menschliches Gewebe

1. Ein Protokoll zum menschlichen Dickdarmgewebe in die Ethikkommission für die Zulassung zu erhalten.
2. Stellen Sie die Zusammenarbeit mit allgemeine Chirurgen und / oder kolorektalen Chirurgen, um menschliches Gewebe für die Forschung zu erhalten. Die Zusammenarbeit mit der Pathologie-Abteilung ist ebenfalls obligatorisch, da sie wird die Bestimmung der Gewebe, die nicht für die Diagnose erforderlich ist, und kann für die Forschung bezeichnet werden.
3. Dabei muss der Pathologe die Gewebe aus der Neubildung bereitzustellen und dann Grossly normale Schleimhaut von mindestens 5 cm von dem Tumor. Ab sofort legen Sie die Proben in eiskaltem Waschmedien und auf Eis. Der Pathologe die Menge des Gewebes, die sicher für die Forschung gegeben werden kann, zu bestimmen. Die für die MF Isolierung benötigt minimale Gewebe ist ^1,5 mm 2.
4. Verwenden Sie die erhaltenen Gewebe entweder sofort, um die Primärkulturen oder gefrier Ort und bei -80 ° C für die zukünftige Trennung zu etablieren.
   1. Wenn das Einfrieren für spätere Trennung, schneiden das Gewebe in etwa 1-2 mm ^{2 Stück,} legen Sie in eine Tieftemperatur-Schlauch mit 1 ml Gefriermedium (siehe unten), und bei -80 ° C. Hinweis: Unter Verwendung dieses Protokolls hat erfolgreiche Isolierung von Marktfaktoren aus Gewebe seit über 4 Jahren eingefroren wurde beobachtet.

2. Bereiten Reagenzien

1. Für Kollagenase Lösung: Bereiten Sie 100 U / ml Collagenase I, II und IV in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit ^Ca 2+ / ^Mg 2+ (siehe Materialien Tabelle ). ACHTUNG: Kollagenase aktive Einheit Konzentration und Reinheit kann von Hersteller zu Hersteller, was den Wirkungsgrad des Gewebes die Verdauung und / oder Erhaltung des Epitops auf der Schleimhautzelloberfläche behindern, kann variiert. Um diese mögliche Fallstricke zu vermeiden, verwenden Kollagenase mit höchstem Reinheitsgrad (≥95%) und bereiten die Stammlösung auf der Basis der aktiven Einheiten Konzentration.
2. Bereiten Sie auf Wasserbasis DNase Stammlösung bei 10 mg / ml (3,55 UA / mg).
3. Bereiten Wash Medien: (MEM: 89 ml, Antibiotikum-Antimykotikum, 100x: 1 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 10 ml)
4. Bereiten Fibroblasten-Wachstumsmedium: MEM: 500 ml Flasche; L-Glutamin (200 mM): 5 ml; MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100x Lösung: 5 ml; Ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 & mgr; l; Antibiotikum-Antimykotikum, 100x-Lösung: 10 ml; Natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 50 ml
5. Bereiten Freeze-Medien: Fibroblasten-Wachstumsmedium (Reagenz 2.4) mit dem Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), dann filtern-sterilize mit einem 0,22 um-Filter.

3. Enzymatisch Digest Menschliches Gewebe

1. Wenn das Gewebe wurde in gefrier Medien, Ort Kryoröhrchen in warmen (~ 37 ° C) Wasser eingefroren, bis Gewebe und Medien wird aufgetaut.
2. Für 4-5 von ² mm 2 Gewebestücke, Wäsche Gewebe zweimal mit 10 ml HBSS ohne ^Ca 2+ / Mg ^2+.
3. Sobald Gewebe durch die Schwerkraft angesiedelt, vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne Spinnen Probe.
4. 10 ml Kollagenase-Lösung der Probe und gibt das Gewebe-Lösungsgemisch in einen sterilen, DNase / RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren zur Proben Dissoziation. Verwenden Kollagenase an die extrazelluläre Matrix, die die basale Aspekt Epithelzellen umgibt und bildet den nicht-zellulären Fraktion der mukosalen Lamina propria dissoziieren.
5. Dicht zu schließen Rohr und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des Dissociator (zB gentleMACS). Wenn das Labor nicht über die Zugang zu ter erwähnte Anlage, die Dauer jedes Verdauungsschritt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, zu erhöhen.
6. Führen Sie das Programm h_tumor_01, enthalten eine voreingestellte Profil mit der Maschine (Gesamtlaufzeit von 36 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 268 Schuss pro Lauf).
7. Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator.
8. Inkubieren Probe für 45 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute. Anmerkung: Für verschiedene Mengen von Gewebeproben, die Zeit kann der Verdauung proportional reduziert oder erhöht werden kann (dh, größere Mengen von Gewebe können zusätzliche Zeit erfordern).
9. Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator.
10. Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_02 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 235 Schuss pro Lauf).
11. Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator.
12. In 50 ul DNase-Stammlösung. Verwenden DNAse zu distanzieren / entfernen abgestorbene Zellen und DNA-Fraktion von Zelltrümmern, die Verklumpung Zelle führt.
13. Inkubieren Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler mit 60 UpM.
14. Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator erneut.
15. Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_03 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 168 Schuss pro Lauf).
    Hinweis: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut, Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C, Überstand verwerfen, resuspendieren in 2 ml Zelldissoziationslösung und Inkubation bei RT für 10 min.
16. Übergeben Sie die Zellsuspension durch sterile 70 um Zellsieb.
17. Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C. Überstand wird abgesaugt komplett.
18. Wash Zellpellet zweimal mit 25 ml HBSS ohne ^Ca 2+ / ^Mg 2+ und den Überstand verwerfen.
19. Vor dem letzten warh, zählen Zellzahl unter Verwendung eines automatisierten Zellzählung System zur Verfügung im Labor oder manuell mit Zählkammer. Für MF Primärkultur Generation gehen zum Schritt 3.19.1, für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie gehen für Schritt 3.19.2.
    1. Für die Isolierung und das Wachstum der reinen MF Kultur (Abbildung 1), den Überstand verwerfen von den letzten Zentrifugation resuspendieren Zellpellet in der entsprechenden Menge an Fibroblasten-Isolationsmedien benötigt, um den 4 x ¹⁰ 6 Zellen Saatgut in 3 ml des Mediums pro Vertiefung in 6 gut, Zellkultur-behandelten Platten. Fahren Sie mit Schritt 3.20.
    2. Für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie, legen Sie bis zu 2 x 10 ⁶ in 2 ml Fibroblasten Isolationsmedien in 24-Well, Low-Bindungsplatte und Inkubation O / N bei 37 ° C mit _5% CO 2. Dies ist auf die Zelloberfläche Epitope, die durch die enzymatische Verfahren betroffen sein können, wiederherzustellen. Dann sammeln Zellsuspension und zählen gewonnenen Zellen und fahrenfür die Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse ^8.
20. Wachsen Zellen bei 37 ° C mit 5% _CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage, bis die Bildung von ~ 80% konfluent MF Monoschicht (1D-E).
21. Passage-Zellen in T25-Kolben mit 6-Well-Platte in einem Verhältnis von 1: 1 und das Wachstum für ~ 10 bis 100% Konfluenz - 14 Tagen in Fibroblastenwachstumsmedium bis 80 zu erzielen.
22. Erweitern Kultur durch Passagieren Zellen von T25 bis T75 Zellen in einem Verhältnis 1: 2. Sobald Zellen Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine Flasche für die Analyse von isolierten MF Reinheit unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie zuvor ⁵ beschrieben. Einfrieren oder einen anderen Durchgang T75-Kolben von MF Kultur bei Verhältnis 1: 3.
    Hinweis: Wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert, wird erwartet, dass Darmschleimhäute stromal MF mesenchymalen Ursprungs bei Wachstum in Kultur werden folgenden Phänotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin ^+, α-SMA ^+, CD90 ^+.

Ergebnisse

Mit diesen enzymatischen Verdau Protokoll Hintergrund haben wir in der Lage gewesen, zu isolieren und zu wachsen MF Bevölkerung gut CD90 ⁺ Schleimhaut Stromazellen aus GI chirurgischen Proben und Biopsien (Abbildung 1). 5 nach dem Aussäen mononuklearen Zellsuspensionen in 6-Well-Platten (1A-B) - Sichtbare MF Kolonie Proliferation konnte am Tag 2 beobachtet werden. Die MF Primärkulturen zu erreichen ~ 50-70% Konfluenz für Tag 7 bis 11 (...

Diskussion

Während dieses Protokoll wurde für das Forschungsanwendung nur dann entwickelt, unter Berücksichtigung der wachsenden Bedeutung der kritischen Stromazellen als potentielle Krebsprognostische Biomarker und therapeutisches Ziel, die Fähigkeit, "funktional" Gewebeproben für eine spätere Verwendung gefrier bietet einen signifikanten Vorteil. Dies stellt einen einzigartigen Vorteil für die Erstellung von klinischen Biobanken, die dazu dient, die Entwicklung der personalisierten Medizin ^{10, 11} voran als z...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MEM, 1x	Corning	MT-10-010-CV
Hanks' Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H6648
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	S8636
Antibiotikum-Antimykotikum, 100x	Gibco	15240-062
Ciprofloxacin HCl	Corning	61-277-RF
L-Glutamin, 100x	Corning	25-005-CI
MEM Nichtessentielle Aminosäuren	Corning	25-025-CI
Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Dithiothreitol Lösung (DTT)	Sigma-Aldrich	646563
0,5 M EDTA, pH 8,0	Cellgro	46-034-CI
DNAse	Worthington	LS002139
Kollagenase aus  Clostridium histolyticum, Typ I	Sigma-Aldrich	C1639
Kollagenase aus  Clostridium histolyticum, Typ II	Sigma-Aldrich	C1764
Kollagenase aus Clostridium histolyticum, Typ IV	Sigma-Aldrich	C5138
Accumax Zelldissoziationslösung	Sigma-Aldrich	A7089
gentleMACS C Röhrchen	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Dissoziator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Zellsieb (70 &Mikro; m)	Corning	352350
PE Maus Anti-Human-Vimentin	BD Biosciences	562337	Klon RV202
FITC Monoklonales Anti-Aktin, α-Glatte Muskulatur	Sigma-Aldrich	F3777	Klon 1A4
APC Maus Anti-Human-CD90	BD Biosciences	559869	Klon 5E10