Name: Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von CD90+ Myofibroblasten und Fibroblasten aus gefrorenen humanen Gastrointestinalproben. Diese Methode ermöglicht funktionelle Assays zur Erforschung von Gewebereparatur und Fibrose.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) und dem Institute for Translational Sciences an der University of Texas Medical Branch unterstützt und erhielt einen Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Das Protokoll für den Erhalt verworfen menschlichem Gewebe von chirurgischen Patienten und die Einrichtung von Primärkulturen wurde von der University of Texas Medical Branch and University of New Mexico Institutional Review Boards genehmigt. Die allgemeinen Anforderungen an die Beschaffung menschlicher Gewebeproben ist unten beschrieben. Beachten Sie, dass seit dem Marktfaktoren können von gefrorenem Gewebe, Biobanken und kommerziellen Anbietern isoliert werden auch praktikable Möglichkeiten. 1. Besorgen Menschliches Gewebe <ol><li> Ein Protokoll zum menschlichen Dickdarmgewebe in die Ethikkommission für die Zulassung zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Zusammenarbeit mit allgemeine Chirurgen und / oder kolorektalen Chirurgen, um menschliches Gewebe für die Forschung zu erhalten. Die Zusammenarbeit mit der Pathologie-Abteilung ist ebenfalls obligatorisch, da sie wird die Bestimmung der Gewebe, die nicht für die Diagnose erforderlich ist, und kann für die Forschung bezeichnet werden. </li><li> Dabei muss der Pathologe die Gewebe aus der Neubildung bereitzustellen und dann Grossly normale Schleimhaut von mindestens 5 cm von dem Tumor. Ab sofort legen Sie die Proben in eiskaltem Waschmedien und auf Eis. Der Pathologe die Menge des Gewebes, die sicher für die Forschung gegeben werden kann, zu bestimmen. Die für die MF Isolierung benötigt minimale Gewebe ist 1,5 mm 2. </li><li> Verwenden Sie die erhaltenen Gewebe entweder sofort, um die Primärkulturen oder gefrier Ort und bei -80 ° C für die zukünftige Trennung zu etablieren. <ol><li> Wenn das Einfrieren für spätere Trennung, schneiden das Gewebe in etwa 1-2 mm 2 Stück, legen Sie in eine Tieftemperatur-Schlauch mit 1 ml Gefriermedium (siehe unten), und bei -80 ° C. Hinweis: Unter Verwendung dieses Protokolls hat erfolgreiche Isolierung von Marktfaktoren aus Gewebe seit über 4 Jahren eingefroren wurde beobachtet. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Reagenzien <ol><li> Für Kollagenase Lösung: Bereiten Sie 100 U / ml Collagenase I, II und IV in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ / Mg 2+ (siehe Materialien Tabelle </strong&gt;). ACHTUNG: Kollagenase aktive Einheit Konzentration und Reinheit kann von Hersteller zu Hersteller, was den Wirkungsgrad des Gewebes die Verdauung und / oder Erhaltung des Epitops auf der Schleimhautzelloberfläche behindern, kann variiert. Um diese mögliche Fallstricke zu vermeiden, verwenden Kollagenase mit höchstem Reinheitsgrad (≥95%) und bereiten die Stammlösung auf der Basis der aktiven Einheiten Konzentration. </li><li> Bereiten Sie auf Wasserbasis DNase Stammlösung bei 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Bereiten Wash Medien: (MEM: 89 ml, Antibiotikum-Antimykotikum, 100x: 1 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 10 ml) </li><li> Bereiten Fibroblasten-Wachstumsmedium: MEM: 500 ml Flasche; L-Glutamin (200 mM): 5 ml; MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100x Lösung: 5 ml; Ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 &amp; mgr; l; Antibiotikum-Antimykotikum, 100x-Lösung: 10 ml; Natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 50 ml </li><li> Bereiten Freeze-Medien: Fibroblasten-Wachstumsmedium (Reagenz 2.4) mit dem Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), dann filtern-sterilize mit einem 0,22 um-Filter. </li></ol> 3. Enzymatisch Digest Menschliches Gewebe <ol><li> Wenn das Gewebe wurde in gefrier Medien, Ort Kryoröhrchen in warmen (~ 37 ° C) Wasser eingefroren, bis Gewebe und Medien wird aufgetaut. </li><li> Für 4-5 von 2 mm 2 Gewebestücke, Wäsche Gewebe zweimal mit 10 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+. </li><li> Sobald Gewebe durch die Schwerkraft angesiedelt, vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne Spinnen Probe. </li><li> 10 ml Kollagenase-Lösung der Probe und gibt das Gewebe-Lösungsgemisch in einen sterilen, DNase / RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren zur Proben Dissoziation. Verwenden Kollagenase an die extrazelluläre Matrix, die die basale Aspekt Epithelzellen umgibt und bildet den nicht-zellulären Fraktion der mukosalen Lamina propria dissoziieren. </li><li> Dicht zu schließen Rohr und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des Dissociator (zB gentleMACS). Wenn das Labor nicht über die Zugang zu ter erwähnte Anlage, die Dauer jedes Verdauungsschritt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, zu erhöhen. </li><li> Führen Sie das Programm h_tumor_01, enthalten eine voreingestellte Profil mit der Maschine (Gesamtlaufzeit von 36 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 268 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> Inkubieren Probe für 45 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute. Anmerkung: Für verschiedene Mengen von Gewebeproben, die Zeit kann der Verdauung proportional reduziert oder erhöht werden kann (dh, größere Mengen von Gewebe können zusätzliche Zeit erfordern). </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_02 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 235 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> In 50 ul DNase-Stammlösung. Verwenden DNAse zu distanzieren / entfernen abgestorbene Zellen und DNA-Fraktion von Zelltrümmern, die Verklumpung Zelle führt. </li><li> Inkubieren Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler mit 60 UpM. </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator erneut. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_03 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 168 Schuss pro Lauf). Hinweis: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut, Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C, Überstand verwerfen, resuspendieren in 2 ml Zelldissoziationslösung und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch sterile 70 um Zellsieb. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C. Überstand wird abgesaugt komplett. </li><li> Wash Zellpellet zweimal mit 25 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+ und den Überstand verwerfen. </li><li> Vor dem letzten warh, zählen Zellzahl unter Verwendung eines automatisierten Zellzählung System zur Verfügung im Labor oder manuell mit Zählkammer. Für MF Primärkultur Generation gehen zum Schritt 3.19.1, für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie gehen für Schritt 3.19.2. <ol><li> Für die Isolierung und das Wachstum der reinen MF Kultur (Abbildung 1), den Überstand verwerfen von den letzten Zentrifugation resuspendieren Zellpellet in der entsprechenden Menge an Fibroblasten-Isolationsmedien benötigt, um den 4 x 10 6 Zellen Saatgut in 3 ml des Mediums pro Vertiefung in 6 gut, Zellkultur-behandelten Platten. Fahren Sie mit Schritt 3.20. </li><li> Für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie, legen Sie bis zu 2 x 10 6 in 2 ml Fibroblasten Isolationsmedien in 24-Well, Low-Bindungsplatte und Inkubation O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Dies ist auf die Zelloberfläche Epitope, die durch die enzymatische Verfahren betroffen sein können, wiederherzustellen. Dann sammeln Zellsuspension und zählen gewonnenen Zellen und fahrenfür die Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse 8. </li></ol></li><li> Wachsen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage, bis die Bildung von ~ 80% konfluent MF Monoschicht (1D-E). </li><li> Passage-Zellen in T25-Kolben mit 6-Well-Platte in einem Verhältnis von 1: 1 und das Wachstum für ~ 10 bis 100% Konfluenz - 14 Tagen in Fibroblastenwachstumsmedium bis 80 zu erzielen. </li><li> Erweitern Kultur durch Passagieren Zellen von T25 bis T75 Zellen in einem Verhältnis 1: 2. Sobald Zellen Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine Flasche für die Analyse von isolierten MF Reinheit unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie zuvor 5 beschrieben. Einfrieren oder einen anderen Durchgang T75-Kolben von MF Kultur bei Verhältnis 1: 3. Hinweis: Wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert, wird erwartet, dass Darmschleimhäute stromal MF mesenchymalen Ursprungs bei Wachstum in Kultur werden folgenden Phänotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

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<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Während dieses Protokoll wurde für das Forschungsanwendung nur dann entwickelt, unter Berücksichtigung der wachsenden Bedeutung der kritischen Stromazellen als potentielle Krebsprognostische Biomarker und therapeutisches Ziel, die Fähigkeit, &quot;funktional&quot; Gewebeproben für eine spätere Verwendung gefrier bietet einen signifikanten Vorteil. Dies stellt einen einzigartigen Vorteil für die Erstellung von klinischen Biobanken, die dazu dient, die Entwicklung der personalisierten Medizin 10, 11 voran als z...

Myofibroblasten / Fibroblasten (MFS) stellen eine reiche Population von Zellen in der gastrointestinalen (GI) Schleimhaut. Diese Stromazellen gerade unterhalb von Epithel und bilden ein miteinander verbundenes Netzwerk innerhalb Schleimhaut Lamina propria im Darm. MFs sind nicht nur für die Ablagerung der extrazellulären Matrix verantwortlich, sondern durch parakrine Regulation kann Elektrolyttransport, Rückgabe und Barrierefunktion der benachbarten Epithel 1, 2 beeinflussen. Weiterhin haben MFs gezeigt, dass eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Gewebe spielen Umbau 3, 4. Myofibroblasten sind ein kritischer Teil der Tumor-Mikroumgebung, wo sie auch als Krebs assoziierten Fibroblasten bekannt, und dazu beitragen, die das Tumorzellwachstum und dienen als Nische für Krebsstammzellen 3. Schwellen Daten legt nahe, dass Marktfaktoren können auch als lokale Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Zusätzlich MFs Funktion als wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort, producing eine Vielzahl von Cytokinen und Wachstumsfaktoren. 5 Bei gesunden Menschen werden MFs Zellen vermutlich aus mesenchymalen Stammzellen zu differenzieren und Express auf ihrer Zelloberfläche, die mesenchymalen Marker CD90 3, 5. Diese Zellen sind auch positiv für Vimentin, aber negativ für Epithelzellen und hämatopoetischen Zellmarker EpCAM und CD45 , beziehungsweise. Myofibroblasten werden vorgeschlagen, um eine aktivierte Form von Fibroblasten und kann aus nicht-aktivierten Fibroblasten durch die Expression von α-SMA 5 unterscheiden. Im Laufe des letzten Jahrzehnts mehrere Ansätze zur Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Darmschleimhaut wurden veröffentlicht, meist auf der ursprünglich von Mahida et al. 5-8 beschrieben berechnet. Während einzelne Studien berichten Isolierungsverfahren aus verschiedenen Darmschleimhaut, kein universelles Protokoll für die Isolierung von Marktfaktoren aus mehreren Bereichen des GI-Trakts (dh Magen, kleine und large Darmschleimhaut) ist erschienen. Die hierin enthaltenen Protokoll wurde getestet und für alle drei Gewebetyp oben erwähnt erfolgreich eingesetzt. . Darüber hinaus wurden Verfahren zur Isolierung von Marktfaktoren aus gefrorenen GI-Schleimhaut nicht berichtet worden. Wir stellen hier ein optimiertes Verfahren, die auf enzymatische Verdauung basiert, und gleichzeitig ermöglicht die Isolierung menschlicher Darmschleimhaut MFs für Kultur und Durchflusszytometrie-Analyse in frisch gespalten, einzelne Zelle, Schleimhaut Zubereitungen. Diese Technik zuverlässig liefert Primärkulturen mit einem MF-Phänotyp. Darüber hinaus können die gleichen Methoden verwendet, um die MFS an der gefrorenen Proben von Magen und Dünndarm-Gewebe zu isolieren, als auch werden. Isolierung von Myofibroblasten aus frischem Gewebe GI zuvor beschrieben wurde; jedoch die Verwendung von gefrorenen Proben stellt viele Vorteile. Das heißt, die Forscher würden von einer beliebigen Anzahl von Mitarbeitern auf der ganzen Welt, die die Capabi müssen in der Lage, sammeln und speichern Gewebenkeit auf den eingefrorenen Gewebeproben zu versenden. Darüber hinaus können die Forscher die Sammlung von gebrauchten Gewebe aus dem Operationssaal und / oder Endoskopie-Suite und sofortige Bearbeitung des Gewebes für die Isolierung, um Konflikte mit ihren aktuellen Experimente Plan zu finden. Auch aufgrund der Unvorhersehbarkeit der Chirurgie, Gewebeentnahme kann sehr spät in den Tag kommen, was die Zeit für die Verarbeitung Gewebe links begrenzen. Einfrieren Gewebe für die spätere Verarbeitung werden diese Herausforderungen zu verbessern. Schließlich sind diese Verfahren wurden erfolgreich bei der Isolierung von Kolon, Magen und Dünndarm Myofibroblasten bei Krankheitszuständen, wie beispielsweise Dickdarmkrebs und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol Lösung (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus&nbsp; Clostridium histolyticum, Typ I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus&nbsp; Clostridium histolyticum, Typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum, Typ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Accumax Zelldissoziationslösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (70 &Mikro; m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human-Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Klon RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoklonales Anti-Aktin, &alpha;-Glatte Muskulatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Klon 1A4</td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Klon 5E10</td></tr></tbody></table>

isolierung von cd 90+ fibroblasten / myofibroblasten von human gefrorene magen-darm-proben

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasten / Myofibroblasten (MFS) wurden immer mehr an Aufmerksamkeit für ihre Rolle in der Pathogenese und ihre Beiträge sowohl für die Wundheilung und die Förderung der Tumor-Mikroumgebung. Zwar gibt es derzeit viele Techniken zur Isolierung von Marktfaktoren von gastrointestinalen (GI) Gewebe, dieses Protokoll ein neues Element der Isolierung dieser Stromazellen aus gefrorenem Gewebe. Einfrieren GI Gewebeproben nicht erlaubt nur dem Forscher Proben aus weltweit Mitarbeiter, Biobanken und kommerziellen Anbietern zu erwerben, es erlaubt auch die verzögerte Bearbeitung von frischen Proben. Die beschriebenen Protokoll konsequent liefern charakteristische spindelförmige Zellen mit dem MF-Phänotyp, der die Marker CD90, α-SMA und Vimentin auszudrücken. Da diese Zellen aus Patientenproben abgeleitet ist, verleiht die Verwendung von primären Zellen auch den Vorteil der eng nachahmt MFs an Krankheitszuständen, nämlich Krebs und entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik hat been im Magen, Dünndarm und Dickdarm-MF Primärkulturerzeugung validiert. Primär MF Kulturen können in einer Vielzahl von Experimenten, über eine Anzahl von Durchgangs verwendet werden, und ihre Reinheit sowohl durch Immunzytochemie beurteilt und Durchflusszytometrie-Analyse.

Mit diesen enzymatischen Verdau Protokoll Hintergrund haben wir in der Lage gewesen, zu isolieren und zu wachsen MF Bevölkerung gut CD90 + Schleimhaut Stromazellen aus GI chirurgischen Proben und Biopsien (Abbildung 1). 5 nach dem Aussäen mononuklearen Zellsuspensionen in 6-Well-Platten (1A-B) - Sichtbare MF Kolonie Proliferation konnte am Tag 2 beobachtet werden. Die MF Primärkulturen zu erreichen ~ 50-70% Konfluenz für Tag 7 bis 11 (...

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Etablierung von primären Fibroblasten/Myofibroblasten (MF)-Kulturen aus gefrorenen Magen-, kleinen Darm- und Dickdarmgewebe-liefernden Zellen mit einem MF-Phänotyp vorgestellt. Diese Zellen exprimieren CD90, α-SMA und Vimentin. MFs können für eine Vielzahl von funktionellen Assays verwendet werden, einschließlich enzymatischer Aktivität und Zytokinproduktion.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, lebensfähige mukosale Myofibroblasten und Fibroblasten aus gefrorenen gastrointestinalen Gewebeproben zu isolieren, die ursprünglich aus Biopsien oder chirurgischen Proben gewonnen wurden. Die Isolierung von Myofibroblasten und Fibroblasten aus ordnungsgemäß gefrorenem Magen-Darm-Gewebe ermöglicht es, die Verarbeitung frischer Proben zu verzögern. Dies erleichtert die Verwendung von Proben aus unterschiedlichen Quellen weltweit.Wenn das Gewebe in Gefriermedium konserviert wurde, stellen Sie das Kryoröhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, bis das Gewebe und das Medium aufgetaut sind. Für vier bis fünf zwei Quadratmillimeter große Gewebefragmente fügen Sie 10 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzu, schließen Sie den Deckel fest und waschen Sie das Gewebe, indem Sie das Röhrchen einmal vorsichtig umdrehen. Sobald sich das Gewebe durch die Schwerkraft abgesetzt hat, entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie das Gewebe erneut.Geben Sie dann 10 Milliliter Kollagenaselösung in das Röhrchen und überführen Sie die Gewebesuspension in ein steriles DNase/RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren. Verschließen Sie das Rotorrohr fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse eines Dissoziators. Führen Sie dann das voreingestellte Programm H-Tumor Zero One aus.Am Ende des Programms wird die Gewebeaufschlämmung 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Drehung von 140 U/min auf einem Schüttler inkubiert. Setzen Sie dann die Röhre wieder in den Dissoziator ein und führen Sie das Programm H-Tumor Null Zwei aus. Nach der zweiten Dissoziation geben Sie 50 Mikroliter DNA-Stammlösung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Drehung des Schüttlers mit 60 U/min in die Zelllösung.Führen Sie am Ende der zweiten Inkubation das Programm H-Tumor Null Drei aus. Filtrieren Sie nun die Suspension durch ein steriles 70-Mikron-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet zweimal in 25 Millilitern HBSS ohne Kalzium und Magnesium, wobei Sie die Zellen nach dem ersten Waschen zählen.Für die Erzeugung von Myofibroblasten-Primärkulturen resuspendieren Sie das Pellet in bis zu 4 x 10 bis 6. Zellen pro drei Milliliter Medium und säen Sie es in 6-Well-Zellkultur-behandelte Platten. Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis sich eine zu 80 Prozent konfluente Myofibroblasten-Monoschicht bildet. Die Zellen sind dann bereit, in T25-Kulturflaschen abgefüllt zu werden.Um die isolierten Myofibroblasten mittels Durchflusszytometrie zu analysieren oder zu sortieren, werden bis zu 2 x 10 bis 6. Zellen pro zwei Milliliter Fibroblasten-Isolationsmedium in eine 24-Well-Platte mit niedriger Bindung für die Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid plattiert. Mit Hilfe dieses enzymatischen Verdauungsprotokolls erhielten Myofibroblasten und Fibroblasten CD-90-positive Schleimhautstromazellpopulationen, die konsistent isoliert und aus gastrointestinalen chirurgischen Proben und Biopsien gezüchtet werden können. Während es eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit der Schleimhauteinzelzellpräparation nach dem Einfrieren der chirurgischen Proben gibt, gibt es eine Steigerung der Effizienz der Myofibroblasten- und Fibroblastenkulturerzeugung aufgrund einer gleichzeitigen Abnahme der Bakterien- und Pilzkonzentration.Nach zwei Passagen sind die Myofibroblasten und Fibroblasten positiv für CD90, den mesenchymalen Markerlinienmarker, Vimentin, und Aktin der glatten Muskulatur, einen Marker für differenzierte mesenchymale Zellen, wie sowohl durch konfokale Mikroskopie als auch durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik, wenn sie richtig ausgeführt wird, in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die notwendige Zeit einzuplanen, damit das Gewebe vollständig enzymatisch verdaut werden kann.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und verschiedene funktionelle Assays durchgeführt werden. Sie können verwendet werden, um den Beitrag von Myofibroblasten und Fibroblasten zur Homöostase der Darmschleimhaut sowie zur Pathologie akuter und chronisch entzündlicher Magen-Darm-Erkrankungen zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Myofibroblasten und Fibroblasten aus gefrorenem Magen-Darm-Gewebe isoliert.Vergessen Sie nicht, dass nicht fixiertes menschliches Gewebe durch pathogene Mikroorganismen kontaminiert werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten bei der Arbeit mit humanbiologischen Proben immer allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Die Myofibroblasten ist ein einfluss Stromazellen des Magen-Darm-Trakt, die wichtige physiologische Prozesse in normalen und Krankheitszustände regelt. Wir beschreiben eine Technik, die für die Isolierung von primären Myofibroblasten aus Maus und menschlichen Dickdarmgewebe, das für die in vitro Experimente verwendet werden können, ermöglicht.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung von Primärkulturen von murinen und humanen ösophagealen Stromazellen mit einem Myofibroblasten-Phänotyp. Kultivierte Zellen haben eine spindelförmige Morphologie, exprimieren α-SMA und Vimentin und es fehlen epitheliale, hämatopoetische und endotheliale Zelloberflächenmarker. Charakterisierte Stromazellen können in funktionellen Studien zu epithelial-stromalen Wechselwirkungen verwendet werden.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung lebender Zellen und zur Primärkultur von myogenen und Fibroblasten-Zelllinien aus Muskel- oder Hautgewebe.  Auch eine Technik zur Immortalisierung dieser Zelllinien wird beschrieben.  Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Dieses Manuskript beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von papillären und Netzfibroblasten von der menschlichen Haut. Sie umgeht in der vitro-Kultur, die mit dem häufig verwendeten Isolationsprotokoll über Explantationskulturen unvermeidlich war. Die ausstrahlenden fibroblasten Untersätze sind funktional unterscheidbar und zeigen eine differenzierte Genexpression und Lokalisierung innerhalb der Dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Lernen Sie die Isolierung von CD90+ Myofibroblasten und Fibroblasten aus gefrorenen humanen Gastrointestinalproben. Diese Methode ermöglicht funktionelle Assays zur Erforschung von Gewebereparatur und Fibrose.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

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