Methodenartikel

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

DOI:

10.3791/53692

⸱

2. Januar 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die aktuellen Protokolle zur Erhaltung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen (iMOP) und der otischen Differenzierung werden beschrieben. Kulturbedingungen und molekulare Marker, die auf eine Differenzierung in sensorische Epithelien und Spiralganglienneuronen (SGN) hinweisen, werden hervorgehoben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) oder embryonalen Stammzellen (ESC) für Zellersatztherapien ist vielversprechend. Mehrere Einschränkungen, darunter geringe Erträge und heterogene Populationen differenzierter Zellen, behindern den Fortschritt von Stammzelltherapien. Es wurde eine verbleibsbeschränkte immortalisierte multipotente otische Vorläuferzelllinie (iMOP) generiert, um die effiziente Differenzierung einer großen Anzahl von funktionellen Haarzellen und Spiralganglienneuronen (SGN) für Innenohr-Zellersatztherapien zu ermöglichen. Ausgehend von dissoziierten Kulturen einzelner iMOP-Zellen wurden Protokolle beschrieben, die den Austritt aus dem Zellzyklus und die Differenzierung durch den Entzug des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) fördern. Ein signifikanter Rückgang der proliferierenden Zellen nach bFGF-Entzug wurde mit einem EdU-Zellproliferationsassay bestätigt. Parallel zu einer Abnahme der Proliferation führte die erfolgreiche Differenzierung zur Expression molekularer Marker und morphologischer Veränderungen. Die Immunfärbung von Cdkn1b (p27KIP) und Cdh1 (E-Cadherin) in iMOP-abgeleiteten Otosphären wurde als Indikator für die Differenzierung in sensorische Epithelien des Innenohrs verwendet, während die Immunfärbung von Cdkn1b und Tubb3 (neuronales β-Tubulin) zur Identifizierung von iMOP-abgeleiteten Neuronen verwendet wurde. Die Verwendung von iMOP-Zellen ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis von Entscheidungen über das Zellschicksal, die von neurosensorischen Vorläuferzellen des Innenohrs getroffen werden, und wird dazu beitragen, Protokolle für die Erzeugung einer großen Anzahl von iPSC- oder ESC-abgeleiteten Haarzellen und SGNs zu entwickeln. Diese Methoden werden die Bemühungen um die Generierung von otischen Zellen für Ersatztherapien beschleunigen.

Einleitung

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Die Organe des Innenohrs, der Cochlea, des Utrikels, des Saccule und der drei Bogengänge vermitteln die Fähigkeit zu hören und zu balancieren. In der Cochlea wandeln Haarzellen Geräusche in elektrische Signale um, die an die Neuronen der Spiralganglien (SGN) weitergeleitet werden. Die SGNs feuern Aktionspotentiale ab, um neuronale Signale durch den auditorischen Schaltkreis zu verbreiten. Genetische Mutationen, ototoxische Medikamente und die Exposition gegenüber lauten Geräuschen tragen zum Absterben von Haarzellen und SGN bei, die zu Hörverlustführen 1-4. Einmal verloren, werden diese Zellen nicht mehr ersetzt. Die Verwendung von iPSC und ESC zur Erzeugung von naszierenden Haarzellen oder SGNs ist vielversprechend für Therapien zum Ersatz von Innenohrzellen5-8. Eine Flut von Fortschritten hat gezeigt, dass sich pluripotente Stammzellen und aus dem Innenohr stammende Vorläuferzellen in verschiedenen Reifestadien zu Haarzellen und SGNs differenzieren können. Embryonale Stammzellen (ESC) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) können verwendet werden, um funktionelle Haarzellen und SGNs9-11 zu erzeugen. Es wurde auch gezeigt, dass Stammzellen und Vorläuferzellen, die aus dem Innenohr von Säugetieren stammen, Haarzellen und Neuronen mit Eigenschaften ihrer zellulären In-vivo-Gegenstücke bilden 12-16.

Die Verwendung von iPSC- oder ESC-abgeleiteten otischen Vorläuferzellen als Ersatz für verlorene Haarzellen und SGNs erfordert eine effiziente Differenzierung. Eine unsachgemäße Differenzierung oder fortgesetzte Proliferation von transplantierten Stammvorläuferzellen im Innenohr kann die Innenohrfunktion verschlimmern und ein tumorigenes Risiko darstellen, wie z. B. die Bildung von Teratomen im Innenohr17. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Kulturbedingungen und dem Verständnis der Differenzierung otischer Vorläuferzellen. Eine Strategie bei der Entwicklung dieser Methoden besteht darin, die Entscheidungen über das Zellschicksal, die von neurosensorischen Vorläuferzellen während der Entwicklung des Innenohrs getroffen werden, zu rekapitulieren. Protokolle, die die Proliferation verhindern und otische Vorläuferzellen in Haarzellen oder SGNs leiten, tragen dazu bei, die Sicherheit und Wirksamkeit von Ersatztherapien zu verbessern.

Während der Entwicklung beginnt das Innenohr mit der Verdickung des Oberflächenektoderms in einer begrenzten Region zwischen den Rhomboeren 5 und 6 und wird zur otischen Plakode. Wenn die otische Plakode einstülpt, um einen Oticusbecher zu bilden, entsteht aus einer Ansammlung von Zellen im vorderen Bereich des Oticusbechers die neural-sensorisch-kompetente Domäne (NSD), die Vorläufer von Haarzellen und Neuronen des Innenohrs enthält18. Schicksalskartierungsstudien an Mäusen, Hühnern und Zebrafischen, die sich im Innenohr entwickeln, deuten auf mehrere Populationen neurosensorischer Vorläuferzellen hin, aus denen die sensorischen Haarzellen, die umgebenden Stützzellen und die otischen Neuronen hervorgehen19-22. Der Transkriptionsfaktor der Gruppe mit hoher Mobilität, Sox2, wurde mit der Spezifikation von sensorischen Zellen in Verbindung gebracht und als Marker für Innenohr-Vorläuferzellen verwendet23,24. Hypomorphe Mutationen, die die Sox2-Expression im Innenohr verringern, führen zum Verlust der Haarzellen, der Stützzellen und der SGNs in der Cochlea25,26.

Um otische Vorläuferzellen zu untersuchen, die sich in Zellschicksalsentscheidungen befinden, wurde zuvor eine durch das Schicksal eingeschränkte immortalisierte multipotente otische Vorläuferzellen (iMOP) von Sox2-exprimierenden Cochlea-Vorläuferzellen etabliert. iMOP-Zellen wurden ursprünglich aus embryonalen E12.5-13.5 Cochlea gewonnen und mit einem c-Myc-Retrovirus infiziert27. iMOP-Zellen können sich kontinuierlich als koloniebildende Zellen, die als Otosphären bekannt sind, vermehren und haben die Fähigkeit, sich in Haarzellen, Stützzellen und SGNs zu differenzieren27. Das Verständnis der Fähigkeit von iMOP-Zellen, sich in unterschiedliche otische Linien zu differenzieren, ermöglicht die Anwendung dieser Erkenntnisse zur effizienten Erzeugung von iPSC- oder ESC-abgeleiteten Haarzellen und SGNs. Effiziente Differenzierungsprotokolle werden neue Wege für Zellersatztherapien bei Innenohrerkrankungen eröffnen, die gegenüber konventionellen Behandlungen widerspenstig sind. Ein entscheidendes Problem bei der Erzeugung von otischen Zellen durch In-vitro-Zellkultur besteht darin, Differenzierungsmarker zu haben, mit deren Hilfe festgestellt werden kann, ob sich Zellen differenzieren. Cdkn1b (p27KIP) wurde ausgiebig als früher Marker für die Differenzierung im sich entwickelnden Innenohr verwendet, jedoch wurde die Expression von Cdkn1b in iMOP-Zellen und wie sie mit der Differenzierung korreliert, nicht untersucht. In dieser Studie werden die aktuellen Kulturbedingungen und die Korrelation der Cdkn1b-Expression mit anderen Markern der iMOP-Differenzierung beschrieben.

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Protokoll

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1. Die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung in IMOP Cells

  1. Bereiten iMOP Kulturmedien: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin und 20 ng / ml bFGF. Machen Sie 50 ml iMOP Kulturmedien unter Verwendung von sterilen Reagenzien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad.
    1. Auftau 50X B27 Supplement und filtersterilisiert 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min in einem 37 ° C Wasserbad. Auftauen 100 ug / ml bFGF Aliquot bei RT. 1 ml 50X B27, 10 ul 100 ug / ml bFGF und 12,5 & mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12.
  2. Verwenden Sie 3 ml Medium in einem 60 mm-Gewebekulturschale zur Züchtung iMOP Zellen. In frischem Medium, um Kulturen jeden zweiten Tag durch eine Verdoppelung des Volumens der Medien. Sicherzustellen, dass die Konzentration von bFGF nicht unter 5 ng / ml abfiel.
    1. Kultur iMOP Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 Passage-Zellen nach 5-7 Tagen in Kultur, wie in den unten aufgeführten Schritte. Übertragungs Kultur in einen 15ml konischen Verwendung einer 10 ml Pipettenspitze.
  3. Stellen 1 mM EDTA in HBSS durch Verdünnen von 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warmen 1 mM EDTA in HBSS in einem 37 ° C Wasserbad gestellt.
  4. Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. bei RT. Für Schwerkraftsedimentation, legen Sie die 15-ml-Erlen mit den Kulturen in der 37 ° C Inkubator für 5 bis 10 min. Nach dieser Zeit wird, beobachten die otospheres sammeln sich am Boden des konischen 15 ml.
    HINWEIS: Übermäßiger Zentrifugalkraft können Zellschäden verursachen.
  5. Saugen Sie vorsichtig den verbrauchten Medien mit einer 2 ml Ansaugpipette ohne das Zellpellet zu stören. 0,5 ml vorgewärmtes, 1 mM EDTA HBSS Lösung Pellet Zelle. Mit Hilfe eines P1000 Pipette vorsichtig pipettieren nach oben und unten 2 - 3-mal. Zeigen konischen bei 37 ° C und Inkubation für <5 min zur Dissoziation in Einzelzellen zu erleichtern.
  6. Vorsichtig schwenken die Zell-Lösung zu bestimmen, ob otospheres dissoziiert sind. Wenn keine otoSphären zu sedimentieren zu dem Boden des konischen werden die Zellen dissoziiert. Die Inkubationszeit kann variieren.
    HINWEIS: Längerer Inkubation mit EDTA in übermäßigen Zelltod führen.
  7. Entfernen Zellen von 37 ° C, 2 ml Medium zu neutralisieren und zu verdünnen das EDTA. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Saugen Sie verdünnten EDTA unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und 5 ml 1X PBS, um die Zellen zu waschen.
  8. Spin Zellen nach unten bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und saugen aus 1X PBS mit einem 2 ml Ansaugpipette. Resuspendieren der Zellen unter Verwendung eines P1000 Pipetten in 0,5 ml iMOP Kulturmedium durch sanftes Auf- und Abpipettieren 2-3 mal.
  9. Graf Zellen unter Verwendung eines mikrofluidischen Partikelzähler mit den entsprechenden Kassetten 28. Ein konfluenten Platte iMOP Zellen ~ 6 X10 enthalten 6 Zellen. Zellen verdünnt 1: 100 in Medium und füge 75 ul der Zell-Lösung in die Kassette für die Zählung. Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale in iMOP culture Medien (~ 1: 10 Verdünnung). Passage iMOPs alle 5 - 7 Tage die.
    Hinweis: Zellen, die große otospheres bilden oder sich an der Unterseite der Gewebekulturschale wird unterscheiden. Die Zellen werden auch sterben, wenn die Kulturen über konfluent.

2. Einfrieren und Auftauen IMOP Cells

  1. Vorbereitung synthetischen Einfriermedium durch Auftauen und Äquilibrieren der Lösung auf 4 ° C vor dem Gefrierzellen.
  2. Sammeln Sie Zellen aus einer konfluenten 6 cm Schüssel iMOP Zellen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette und Übertragungszellen (~ 6 - 8 x 10 6 Zellen) in einen 15-ml-Erlen.
  3. Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Wenn die otospheres sind klein, werden Zellen, die nicht durch die Schwerkraft Sedimentation absetzen. Optional: Zählen von Zellen mit Schritt 1,9 bis Gesamtzellzahl zu bestimmen.
  4. Saugen Sie verbrauchte Medium mit einem 2 ml Ansaugpipette während die losen Zellpellet hinter.
  5. In 0,25 ml synthetischen Einfrieren Medien ce resuspendierenlls in einer Dichte von ~ 5 × 10 5 bis 3 × 10 6 Zellen / ml. Gently Pipette Zellen mit einem P1000 Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in Kryoröhrchen mit einem P1000 Pipette mit 1 ml gefilterte Spitze.
  6. Legen Sie die Fläschchen in einem Alkohol frei Gefrierbehälter und setzen Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C, die Temperatur 1 ° C pro Minute zu verringern, bis die Temperatur erreicht 80 ° C.
  7. Für langfristige Lagerung von Zellen, übertragen die Vials in die Dampfphase aus einem Flüssigstickstofflagertank. Auftauen Zellen für die Kultur, ins Gleichgewicht Kryo-Fläschchen mit gefrorenen Zellen bei -80 ° C.
  8. Pre-warmen iMOP Kulturmedien in einem 37 ° C Wasserbad.
  9. Auftauen gefrorenen Fläschchen schnell von Wirbeln den Boden des Fläschchens in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml der vorgewärmten iMOP Kulturmedien, um aufgetauten Zellen, sobald die letzten Eiskristall verschwindet. Übertragungszellen in einem 15 ml konischen und fügen zusätzliche 4 ml iMOP Nährmedien
  10. Drehen Sie das 15 ml Conische für 5 min. bei 200 xg und saugen die verbrauchte Medien. Resuspendieren der Zellen in 2 ml iMOP Kulturmedien und Zellen in einer Platte 6 cm Schale. Kulturen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für die Expansion.

3. Differenzierung IMOP Cells in Sinnesepithelien

  1. Bereiten Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierungsmedium: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin. Machen Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad. Auftau 50X B27 Supplement und 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min. in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml 50X B27 und 12,5 & mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12.
  2. Zu ernten, zu distanzieren, resuspendieren und zählen Zellen Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9
  3. Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3 Verwendung iMOP Kulturmedien. Am Tag 0 Transfer Kulturen mit einer 10 ml Pipette in ein 15-ml-Erlen. Sammeln Sie die otoKugeln durch die Schwerkraft der Sedimentation, wie in Schritt 1.6 angegeben. Aspirat aus verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und lassen die otospheres auf der Unterseite des konischen.
  4. Sanft fügen in 2 ml Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Transfer otospheres zu einer 6 cm-Schale mit einer großen Bohrung 10 ml Pipette.
    HINWEIS: Mechanische Scher vor rauen Pipettieren können Zellen aus den otospheres distanzieren.
  5. 2 ml frischem sensorischen Epitheldifferenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag. Falls erforderlich, können die Zellen durch Schwerkraftsedimentation und Medien ersetzt gesammelt werden.
  6. Sammeln otospheres am Tag 10 durch die Übertragung von einer 15-ml-Erlen und es den otospheres sedimentieren, wie in Schritt angegeben 1.6.Aspirate die verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml-Pipette und verlassen Ansaugen der otospheres ungestört.
  7. Fix otospheres durch Inkubation in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min bei RT. Entfernen Formaldehydlösung, waschen otospheres mit Waschpuffer (1X PBS, das 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde.
    1. Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterliegt die otosphere der Immunofärbung 27. Transfer otospheres in 1X PBS und Ort otospheres in die Montagetechnik auf einen Glasobjektträger mit einem P1000 Pipette. Setzen Sie ein Deckglas über die Probe und lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C zu trocknen.
  8. Erwerben Epifluoreszenz Bildern unter Verwendung eines Umkehrmikroskops Setup mit einem 16-Bit-CCD-Kamera und entweder 20X 0,75 Luft oder 40X 1,3 NA -Ölimmersionsobjektiv ausgestattet. Sammeln Fluoreszenz von verschiedenen Farbkanälen unter Verwendung der genannten (Anregung und Emission) Wellenlängen: blau (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), Grün (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rot (562 ± 20 nm / und 625 ± 20 nm) und Infrarot (628 ± 20 nm / und 692 ± 20nm).

4. Assaying EdU Incorporation

  1. Am Tag -3, Platte 1 x 10 6 iMOP Zellen in einer 6 cm Schale. Drei Tage später, am Tag 0, ernte, distanzieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen durch Wiederholen der Schritte von 1,4 bis 1,9.
  2. Platte 2,5 x 10 5 Zellen in iMOP Nährmedien und 5 x10 5 Zellen in Sinnesepithelien Differenzierungsmedium in verschiedenen Vertiefungen einer 6 Well-Platte.
  3. Bestimmen den Prozentsatz an Zellen in S-Phase durch EdU Einarbeitung am Tag 3 durch Verwendung eines EdU Inkorporationstest
    1. Hinzufügen EdU Lager direkt an die iMOP Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 1 uM EdU in dem Kulturmedium zu erhalten.
    2. Inkubieren EdU in iMOP Kulturen für 2 Stunden und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Harvest, distanzieren und sammeln Zellen wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9. Hinzufügen in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min. bei RT, um Zellen zu reparieren. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Entfernen Formaldehydlösung und properly entsorgen.
    3. Etikett Kerne von Zellen mit Hoechst und einge EdU mit grünem Fluoreszenzfarbstoff-Azid gemß dem Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Alle Waschungen werden mit 1X PBS, 3% BSA und 0,1% Tween 20. Wasche die Zellen mit 1 × PBS zweimal durchgeführt.
    4. Berg-Zellen auf einem Objektträger mit Antifade-Reagenz und legen Sie eine 1,5 Abdeckglas über die Probe. Erwerben Fluoreszenzbilder der markierten Zellen mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskopie.

5. Differenzierung IMOP abgeleiteten Neuronen

  1. Machen Sie 50 ml der neuronalen Differenzierung Medien: Neurobasal Medien, 1X B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin. Thaw Flasche 50X B27 und 200 mM L-Glutamin in 37 ° C Wasserbad für 5 min. 1ml 50X B27 und 0,5 ml 200 mM L-Glutamin 48,5 ml Neurobasal Medium.
  2. Coat Deckglas, indem 12 mm rund 1,5 Deckgläser in einer sterilen 10 cm Platte und fügen Sie 70% EtOH an der Platte, die sterilisiert und reinigen Sie die Deckgläser.
  3. Rühren Sie vorsichtig die Buchtrslips um sicherzustellen, dass sie in Ethanol abgedeckt sind. Lassen Sie die Platte für 10 Minuten bei RT. Mit steriler 1X PBS spülen Sie die Deckgläschen 3 mal zum Auswaschen der verbleibenden Ethanol. Spülen Sie das Deckglas einmal mit sterilem H 2 0 zu waschen restlichen 1X PBS.
  4. Saugen Sie das H 2 0 mit einem 2 ml Ansaugpipette und lassen Sie die Deckgläser trocken. Setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht in der Gewebekultur Haube für 15 min. Speicher Deckgläschen in einer sterilen Umgebung, wenn sie nicht sofort verwendet.
  5. Legen Sie eine 12 mm runde Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Schale. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Deckgläser liegen flach auf dem Boden des Bohrlochs.
  6. Tau-2 mg / ml Poly-D-Lysin-Stammlösung bei RT gelöst und auf eine 10 ug / ml Poly-D-Lysin-Konzentration in 1X PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Poly-D-Lysin an die Vertiefungen. Lassen Sie die Platte in der 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde.
  7. 3-mal mit steriler 1X PBS Waschen Sie die Vertiefungen. Tau-10 mg / ml Laminin Stammlösung bei RT und 10 & mgr; g / m verdünntenl in 1 × PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Laminin Arbeitslösung in eine einzige Vertiefung einer 24-Well-Platte mit mehreren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C Inkubator. Saugen Sie die Laminin-Lösung unter Verwendung eines 2 ml Ansaugpipette.
  8. 3-mal mit 1X PBS waschen des Deckglases durch Zugabe von in 1 ml 1X PBS mit einer P1000-Pipette und Entfernen des 1X PBS durch Absaugen mit einer 2 ml Ansaugpipette. Lassen 1X PBS von den letzten Wasch im Brunnen, bis die Zellen sind bereit, überzogen werden. Einzuleiten neuronale Differenzierung durch Ernten, Dissoziieren und Zählen der Zellen in den Schritten 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3.
  9. Am Tag 0, ernte, distanzieren und zählen Zellen durch Wiederholen von 1,4 bis 1,9. Seed 1 x 10 5 bis 1,5 x 10 5 iMOP Zellen in 0,5 ml vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medium pro Well in einer 24 Multi-Well-Schale. Saugen Sie und fügen vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag.
  10. Fix iMOP abgeleiteten Neuronen in 4% Formaldehyd für 15 min. eint RT an Tag 7. Entfernen Formaldehydlösung, Waschen iMOP abgeleiteten Neuronen mit Waschpuffer (1 × PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde.
    1. Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterworfen Zellen an Immun 27. Vor der Platzierung auf Montagemedien Waschen Sie die Deckgläser mit 1X PBS. Lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C vor dem Erwerb Epifluoreszenz Bilder wie in Schritt 3.8 aufgeführten trocknen.

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Ergebnisse

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bFGF Widerrufs Verringert Proliferation in IMOP Cells

Um die proliferative Kapazität von iMOP Zellen zu verringern und zu initiieren Differenzierung iMOP Zellen wurde bFGF aus den Kulturen entnommen. Um zu bestätigen, dass die Wachstumsfaktorentzug verringert Proliferation wurde EdU Einarbeitung als Proliferationstest verwendet. Der Prozentsatz von Zellen, die aus EdU otospheres mit iMOP Kulturmedium (enthalte...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Überwachung IMOP Kulturen

Ein Protokoll zum Aufrechterhalten der Selbsterneuerung und die Förderung der Differenzierung einer neuartigen iMOP Zellinie beschrieben und zusätzliche Plattierung Formate enthalten sind (Tabelle 1). Mehrere wichtige Schritte, die mit Routine Expansion und Differenzierung von Zellen iMOP helfen, werden zur Kenntnis genommen. Ähnlich wie pluripotente Stammzellkulturen, iMOP Zellen haben theoretisch eine unbegrenzte Lebensdauer. Um s...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Arbeit wurde teilweise durch den Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) und den Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CoolCell LX Alkoholfreie ZellgefrierbehälterBioCisionBCS-405
Kryofläschchen (2 ml)  Corning430654
1,5 Dicke Glasdeckglas (rund 12 mm)Elektronenmikroskopie Wissenschaften72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasales MediumLife Technologies21103
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4Life Technologies10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14025-092
B27 Supplement (50X) Serum FreeLife Technologies17504-044Gelagert als 1 ml Aliquot
L-Glutamin (200 mM)  Life Technologies25030-081Gelagert als 5 ml Aliquots
Natural Mouse LamininLife Technologies23017-015Gelagert als 1 mg/ml Aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze KryokonservierungsmediumLife TechnologiesA12542-01
Prolong Gold Antifade EindeckmittelLife Technologies47743-736Gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquots
Moxi Z Mini Automatisierter ZellzählerOrflo MXZ001
Moxi Z Kassette Typ SOrflo MXC002
Rekombinanter Maus-Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basisch (bFGF)Peprotech450-33Resuspendiert in 0,1 % BSA in H20 und gelagert als 20 mg/ml Aliquots
Poly-D-LysinSigmaP7886Resuspendiert in 1X PBS und gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquot
Carbenicillin, DinatriumsalzThermo Fisher ScientificBP2648-1Resuspendiert in 10 mM Hepes pH 7,4 und gelagert als 100 mg/ml Aliquote
5 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)Thermo Fisher Scientific1367811E
Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 24-Well-PlatteThermo Fisher Scientific130188
Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 6-Well-PlatteThermo Fisher Scientific130184 
Mit Gewebekulturen behandelte 6 cm SchaleThermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex Sterilspritze PVDF Filter Porengröße: 0,22 μ mThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne Filterpipettenspitzen 0,1 - 10 μ l längliche FilterspitzeUSA Scientific1120-3810
TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 20 μ l FilterspitzeUSA Scientific1120-1810
TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 200 μ l  FilterspitzeUSA Scientific1120-8810
TipOne Filterpipettenspitzen 101 - 1000 μ l FilterspitzeUSA Scientific1126-7810
15 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)USA Scientific1475-0511
50 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)USA Scientific1500-1211

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
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