Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in Arabidopsis Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Summary

Kristalline Cellulose ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Die Quantifizierung mit zellulärer Auflösung ist jedoch eine technische Herausforderung. Hier berichten wir über den Einsatz von Polarisationslichttechnologie und Wurzelquerschnitten, um Informationen über die Zusammensetzung der Zellwände mit raumzeitlicher Auflösung zu erhalten.

Abstract

Pflanzenzellen sind von einer Zellwand umgeben, deren Zusammensetzung ihre endgültige Größe und Form bestimmt. Die Zellwand besteht aus einer komplexen Matrix, die Polysaccharide enthält, zu denen Cellulose-Mikrofibrillen gehören, die sowohl kristalline Strukturen als auch Celluloseketten mit amorpher Organisation bilden. Die Ausrichtung der Zellulosefasern und ihre Konzentrationen bestimmen die mechanischen Eigenschaften der Zelle. Zur Bestimmung des Gehalts an kristalliner Cellulose werden mehrere Methoden verwendet, die jeweils sowohl Vorteile als auch Einschränkungen mit sich bringen. Einige können den Anteil der kristallinen Bereiche an der Gesamtcellulose unterscheiden. Sie beschränken sich jedoch auf Ganzorgananalysen, denen es an raumzeitlichen Informationen mangelt. Andere, die sich auf Live-Imaging verlassen, sind durch die Verwendung ungenauer Farbstoffe eingeschränkt. In dieser Arbeit berichten wir über ein empfindliches polarisiertes lichtbasiertes System zur spezifischen Quantifizierung der relativen Lichtverzögerung, das die akkumulation von kristalliner Cellulose in Querschnitten von Arabidopsis thaliana-Wurzeln darstellt. Bei dieser Methode bleiben die zelluläre Auflösung und die anatomischen Daten erhalten, was direkte Vergleiche zwischen den verschiedenen Geweben ermöglicht, aus denen die wachsende Wurzel besteht. Dieser Ansatz eröffnet eine neue analytische Dimension und beleuchtet den Zusammenhang zwischen Zellwandzusammensetzung, zellulärem Verhalten und dem Wachstum ganzer Organe.

Introduction

Die Pflanzenzellwand ist eine dynamische Struktur. Wachsende Zellen werden durch eine primäre Zellwand umgeben ist, zu erweitern die Organisation, der ermöglicht Zellen. Zellen, die Kaution zu wachsen, um eine steifere Sekundärwand aufhören, die die mechanische Unterstützung der Anlage verbessert. Beide Zellwände bestehen aus Cellulose - Mikrofibrillen zusammengesetzt in einer Matrix aus Polysacchariden verschiedener Strukturen eingebettet (beispielsweise Hemicellulose und Pektin), die über die verschiedenen Entwicklungsstadien variieren und Geweben ^1,2. Cellulose wird synthetisiert, wie Ketten (1,4) -β-D-Glucan, die eng ausgerichtet sind, die Mikrofibrillen einer kristallinen Struktur zu bilden. Amorpher Cellulose bezieht sich auf die Regionen, in denen die Glucan-Ketten weniger geordnet. Das Verhältnis zwischen dem kristallinen und dem amorphen Domänen ist ein Parameter gedacht , um die mechanischen Eigenschaften der Zellwand beeinflussen, durch die mechanische Festigkeit und viskoelastische Eigenschaft Bereitstellen bzw. ^3. Verschiedene Verfahren wurdenentwickelt , um die zwei Formen von Cellulose Anordnung zu detektieren und zu quantifizieren, darunter Röntgenbeugung und Kreuzpolarisation / Magic Angle NMR Solid-State - Spinnen ^4. Röntgenbeugung kann verwendet werden , um den Anteil an kristallinen gegenüber amorpher Cellulose Domänen in der Probe ⁵ zu bestimmen. Eine alternative Methode verwendet Fraktionierung von Zellwand-Gehalt in säureunlösliche und säurelösliches Material, zwischen dem kristallinen und amorphen Cellulose oder anderen Polymeren zu unterscheiden, respectively. Bei diesem Ansatz Einbau markierter Glukose ^([14 C] Glucose) wird verwendet , um die Cellulose ^6,7 zu quantifizieren. Diese Verfahren erfordern große Mengen von Pflanzenmaterial für ganze Organ Analysen allenfalls und daher sind unzureichend empfindlich auf gewebespezifische Variation in der Zellwandstruktur. Visualisierung von Zellulosemikrofibrillen auf zellulärer Auflösung kann in Live - Imaging - Studien mit Fluoreszenzfarbstoffen ^8,9 kombiniert erreicht werden, dass Änderungen erkennen können,die Orientierung der Cellulosemikrofasern. Jedoch werden diese Farbstoffe nicht zur Quantifizierung verwendet, sie sind nicht spezifisch Cellulose kristallin und kann mit der normalen Struktur der Zellwand ⁸ stören. PolScope ist ein bildgebendes Verfahren , das auf der Fähigkeit von kristalliner Cellulose beruht Lichtstrahlen zu teilen und einen Teil des Lichts ¹⁰ zu verzögern. Licht Retardierung ist am stärksten für Mikrofibrillen, die senkrecht zur Richtung der Lichtausbreitung liegen. Für Mikrofibrillen mit ähnlicher Orientierung, desto höher ist der Grad der Kristallinität ist , desto größer der Lichtverzögerung ^11. Daher wird PolScope verwendet zu untersuchen, sowohl die relativen Niveaus und der Orientierung der Cellulosemikrofasern.

Wurzeln aufweisen lineares Wachstum, bei der Zellen an der Stammzellnische Ursprung an der Spitze der Wurzel, durchlaufen eine Reihe von Zellteilungen, bevor sie schnell ¹² erweitern. Die Zellen, die das Wurzel erweitern in einer unidirektionalen (anisotroper)Art und Weise, wie durch kleine Molekül Signalisierungs Hormone diktiert, die die Eigenschaften der Zellwand ¹³ auswirken. Differential Reaktionen auf Hormone, in Zeit und Raum, ein Mittel zur Gewährleistung einer ausgewogenen Organwachstum ^14. Daher können hochauflösende Analyse der Zellwandstruktur wichtige Informationen, die notwendig sind, um besser die Verbindung zwischen Zelltyp-spezifische Antworten auf ganze Organwachstum zu verstehen. Hier berichten wir über die Umsetzung der PolScope gewebespezifische Anreicherung von kristalliner Cellulose in Arabidopsis Wurzeln zu untersuchen, wie es in hoher Qualität anatomischen Abschnitten beobachtet. Dieses Verfahren kürzlich zelltypspezifischen Anhäufung von kristalliner Cellulose in Reaktion auf räumliche Störung der hormonellen Aktivität ¹⁵ freigelegt.

Protocol

1. Pflanzenwachstum

1. Oberflächen sterilisieren Samen.
   1. Sterilisieren Samen (bis zu 30 mg) durch Nass- oder Trockenverfahren. Als Beispiel für die Trockensterilisationsverfahren, 1 ml glazialen HCl 37% in 50 ml Bleichmittel, in einem Becherglas in einem geschlossenen Exsikkator für mindestens 4 Stunden und bis über Nacht. Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube.
2. Verbreiten Sie die sterilen Samen auf Platten mit 0,8% Plant Agar in 0.5x Murashige & Skoog (MS) Medium. Wrap-Platten mit Parafilm oder porösen Band und mit Alufolie abdecken.
3. Lagern Sie die Platten bei 4 ° C für 1 - 4 days einheitliche Keimung zu fördern.
4. Übertragen , um die Platten in eine Wachstumskammer geeignet für den Anbau Arabidopsis Keimlingen. Legen Sie die Platten vertikal Wurzelwachstum auf dem Agar-Medium zu erhalten und das Eindringen zu verhindern.
5. Transfer-Setzlinge zu Fixiermittel 7 Tage nach der Keimung (DAG).

2. Fixation

1. Bereiten Sie 50 ml Richardson Solution von gleichen Volumina von 1% Borax (Puffermittel), 1% Methylenblau und 1% Azure (histologische Farbstoffe) in doppelt destilliertem Wasser kombiniert. Filter durch eine Spritze Driven 0,22 um PVDF-Filtereinheit vor dem Gebrauch.
2. Vorbereitung 50 ml Fixierlösung: 1,25% Glutaraldehyd in 0,05 M Natriumcacodylat (Puffermittel).
   Anmerkung: Diese Materialien sind toxisch und müssen in einer chemischen Haube verarbeitet werden.
3. 100 l Richardson Lösung (siehe 2.1) auf die Fixierungslösung (siehe 2.2), um die endgültige Fixierung Lösung zu erhalten.
4. Markieren Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen.
5. Platz 2 - 3 ml endgültige Fixierung Lösung (siehe 2.3) in die Vertiefungen, so dass die Sämlinge, einmal übertragen, wird vollständig in Flüssigkeit bedeckt sein.
6. Sorgfältig übertragen, Pinzette, zu jeder Vertiefung bis zu 10 Sämlinge. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm. Lagerung bei 4 ° C, in der Finsternis, für mindestens eine Nacht, und bis zu einer Woche.

3. Dehydration

1. Entwässern Sämlinge. Übertragen sie zwischen Vertiefungen neue Platten mit 6 Vertiefungen, enthaltend Konzentrationen von Ethanol zu, wie hier aufgeführt: 10% Ethanol für 15 min; 30% Ethanol für 15 min; 50% Ethanol für 15 min; 70% Ethanol für 15 min; 85% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol bei 4 ° C, über Nacht bei Minimum. Griff Sämlinge indem man sie vorsichtig in ihren Kotyledonen, bevorzugt mit Kunststoff-Pinzette greifen.

4. Infiltrations

1. Bereiten Sie Infiltrationsmedium. Mischen Sie den Inhalt von 1 Beutel des Historesin Kit-Aktivator mit 50 ml Basisharzflüssigkeit Kit in einer kleinen Glasflasche. Rühren mit Magnet für 20 min. Infiltrationsmedium kann bei 4 ° C für ein paar Wochen aufbewahrt werden.
2. Markieren Sie jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen und füllen mit 2 - 3 ml Infiltrationsmedium.
3. Übertragen Sie die Sämlinge aus der 95% igen Ethanollösung zu dem Infiltrationsmedium mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, die Sämlinge sind fully vom Medium bedeckt.
4. Lagerung bei 4 ° C für mindestens 4 Tage, maximales Eindringen in die Pflanzengewebe zu gewährleisten.

5. Satzvorbereitung

1. Legen Sie kleine Etiketten, Bleistift-markiert mit Beispielnamen, innerhalb jeder Vertiefung Einbettschälchen.
2. Bereiten Sie Einbettmedium durch Zugabe von 1 ml Härter 15 ml Infiltrationsmedium (siehe 4.1). Versuchen Sie nicht, ein Volumen von weniger als 15 ml herzustellen, Polymerisation Probleme zu vermeiden.
3. Füllen Sie die Hälfte jeder Vertiefung in der Form mit 200 ul Einbettungsmedium und Abdeckung mit einem Overhead-Folienstück auf die Form Form geschnitten, sondern zu einer Größe von 1 mm größer auf jeder Seite. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 2 h für die Polymerisation zu ermöglichen. Nicht 5 Stunden nicht überschreiten.
4. Bereiten Sie eine zusätzliche Charge von Einbettmedium (siehe 5.2) und auf Eis halten, Polymerisation zu vermeiden, während der Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden.
5. Schneiden Sie jede Wurzelspitze unter einem Binokular Skalpell und sehr sorgfältig positionieren it: senkrecht zur Querschnitte oder horizontal für Längsschnitt, bei etwa 2 - 3 mm von der Formperipherie. Füllen Sie die Form vollständig mit Blocking-Lösung und die Abdeckung mit einem Overhead-Folie. Beachten Sie, dass die Blockierungslösung leicht schrumpfen wird, wenn es polymerisiert wird.
6. Halten Sie bei Raumtemperatur für 2 Stunden, bei Minimum.
7. Um die Blöcke trocknen, legen Sie in einem Kasten mit trockenem Kieselgel und lassen bei Raumtemperatur bei mindestens über Nacht.

6. Sectioning

1. Bereiten Glasmesser aus Glasstäben mit einem Messer ausgestattet. Verwenden Sie die Glasmesser für Gewebe Schnitte. Schneiden Sie den Glasstab in ein Quadrat und dann schneiden Sie das Quadrat diagonal zwei Messer zu produzieren, ein Diamant-Scoring-Tool.
2. Die Sperrung der Abschnitte in 2 - 3 & mgr; m Breite Scheiben, mit schneidender Maschine. Die Scheiben auf einem Glasträger, auf destilliertes Wassertröpfchen und den Objektträger auf einem Wärmeblock zu geringe Wärme gesetzt (50 - 60 ° C), bis das Wasser verdunstet.

7. Schieben Vorbereitung für polarisierte Mikroskop

1. Verdünnte Richardson-Lösung (siehe 2.1) auf 0,2% der ursprünglichen Lösung und mit 1 ml davon die Scheiben zu bedecken. Legen Sie auf dem Wärmeblock für 5 Sekunden und dann mit destilliertem Wasser waschen.
2. Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte. Beachten Sie unter einem Binokular und die Rückseite der Folie mit einer Markierung zu markieren, um die Position der Scheiben von Interesse zeigen, ihre spätere Identifizierung unter dem Mikroskop zu erleichtern.
3. 100 l Eindeckmediums und Abdeckung mit einem Deckglas.

8. Image Acquisition

1. Legen Sie die bedeckte Schlitten die Wurzelabschnitte unter einem Lichtmikroskop ausgestattet mit PolScope System , das geeignet ist, um Retardierung Informationen und einen Polarisator / Interferenzoptikfilter (Abbildung 1 AD) erhalten.
2. Wählen Sie Vergrößerung , die klare Visualisierung der gesamten Probe erlaubt (zB 40X in dieser Studie) und konzentrieren sich die microscope auf einem leeren Feld, das Blockabschnitt aber keine Wurzel Abschnitt enthält. Versuchen Sie, eine saubere Region ohne Makel zu finden. Verwenden Sie diese Region den Hintergrund zu setzen.
3. Stellen Sie die Abbildungssystem und Software-Parameter: Stellen Sie Bereich bis 17 nm. Übernehmen "Auto Exposure" und Hintergrundbild aus dem leeren Feld erhalten (siehe 8.2). Einem Hintergrundbild wird pro Experiment verwendet.

9. PolScope Analyse von Cellulose Mikrofibrillen Orientierung

1. Analyse von Längsschnitten.
   1. Legen Sie eine Folie mit Längsschnitten unter dem Mikroskop und erhalten eine Retardierung Bild davon. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem Wurzelabschnitt von Interesse. Geben Sie einen neuen Dateinamen.
   2. Aufnehmen eines Abrio Bild (Bild mit Verzögerung Informationen) durch die "Live Abrio" Fenster. Sicher sein , einen Abschnitt zu erfassen , die die Zellwand enthält, die von der gefärbten Cellulose identifiziert werden können , die entlang des Umfangs der Zelle ausgeführt wird , wie in 2C gezeigt.
2. Die Bildanalyse.
   1. Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie "Ausrichtung Pseudo Farbe" im "Display Settings".
   2. Um die Zellulose microfibril Winkel abschätzen zu können, passen Sie die entsprechenden Schatten der Zellwand, das dem in dem Farbrad.
      HINWEIS: Das Farbrad in Figur 2C zeigt die langsame Achse des Lichts entlang der Mikrofibrillen liegen , die der Richtung entlang der langen Achse der Mikrofibrillen zeigt. Der Winkel der Cellulose-Mikrofibrillen ist der Winkel zwischen der Farbe und der langen Achse der Zelle angezeigt. Zum Beispiel zeigt die elongating Zelle in der eingesetzten Farbe Zyan, um etwa 90 ° zur langen Achse der Zellen verkippt.
   3. Um die durchschnittliche microfibril Winkel in der Zellwand zu quantifizieren, verwenden Sie "Hemmung und Azimuth Stamp" aus der Werkzeugleiste der Software. Während das Werkzeug, Punkt auswählen und in dem erhaltenen Bild auf dem Gebiet von Interesse klicken.
      HINWEIS: Diese will Ergebnis in der Anzeige der Winkel (Azimut) in Grad (Figur 2C).
   4. In einer alternativen Open-Access-polarisierten Lichtbildanalyse-Software, Mittagessen "Pol-Analyzer" Plugin aus dem Plugin-Menü. Im neu geöffneten Fenster wählen Sie die "Doppelbrechungs" und öffnen Sie dann die Hintergrunddatei und die Bilddatei speichern.
   5. Im Bildfenster, wählen Sie "Specs." und stellen Sie die "ROI Pixelgröße" (Einsatz 5 Pixel für diese Studie). Im "Specs." Wählen Sie im Fenster "zeigen Werte in Ergebnistabelle".
   6. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um die Region von Interesse im Bildfenster zu markieren. Wählen Sie "Orientierungslinien", um die Ausrichtung der Cellulose Mikrofibrillen erhalten.
      ANMERKUNG: Diese in der Anzeige der Winkel führen (Azimut) in Grad.
      HINWEIS: Der Durchschnittswinkel berechnet, indem einer der beiden Methoden, dann entlang der Rutsche zur Positionierung des Fußabschnitts normalisiert werden sollte. Zur Korrektur für die Abweichung vondie horizontale Positionierung des gesamten Wurzelabschnitt entlang der Rutsche, quantifizieren die durchschnittliche microfibril Winkel der Zellwand der Zelle entlang ihrer langen Achse flankieren (dh, senkrecht zu dem Abschnitt und entlang der Achse des Wurzelwachstums, 2C). Dieser Winkel 180 ° beträgt, wenn der Wurzelabschnitt genau entlang der Rutsche positioniert ist. Für den microfibril Winkel zu berechnen, subtrahieren den Mittelwert gemessen microfibril Winkel der flankierenden Zellwand von 180 °. Fügen Sie den ergab Unterschied zu den durchschnittlichen gemessenen microfibril Winkel der Zellwand, die auf der Folie flach liegt.

10. PolScope Analyse der kristallinen Cellulose Accumulation

1. Verwenden Sie die Quer (Kreuz) Abschnitte. Man beachte, dass kristalline Cellulose Akkumulation kann nur zwischen den Zellen verglichen werden, wenn die Cellulose-Mikrofibrillen in einem ähnlichen Winkel ausgerichtet sind (wie in 9 bestimmt).
2. Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie "Pseudonym Farbe "im" Display Settings ".
3. Zur Messung der Retardierung. Zoom-in auf das Bild. Wählen Sie "Region" und alle Regionen von Interesse zu markieren. Umzug in die "Messungen" klicken und alle Werte "In Zwischenablage kopieren".
   1. Übertragen Sie die Daten in Excel und extrahieren erforderlichen Informationen (mittlere Region Retardierung). Normalisieren der Daten.
      HINWEIS: Um Unterschiede in der Dicke zwischen den Schichten ausmachen, drücken die Werte relativ zu einer bestimmten Zellwandkante in der Folie. Zu normalisieren, teilen die durchschnittliche Verzögerung an die Zellwand von Interesse durch die durchschnittliche Verzögerung von einer anderen Zellenwand in der gleichen Bild entspricht. So wurde beispielsweise die äußere epidermale Zellwand zu der inneren kortikalen Zellwand in unserer Studie normalisiert.
4. Wiederholen Sie die Messungen für mindestens 3 Abschnitte pro Wurzel, mit einem Minimum von 3 Wurzeln pro Probe.

Results

Wir untersuchen die Auswirkungen der zelltypspezifische Reaktionen auf Brassinosteroiden (BRS), mit der Arabidopsis Wurzel als Modellorgan ^15-17. Wenn der BR - Rezeptor BRI1 richtet, in dem Hintergrund BRI1 mutant, zu einer Untergruppe von Epidermiszellen nicht-Haarzellen (2A, B) genannt, es unidirektionalen Zellexpansion benachbarter Zellen hemmt und Vollwurzelwachstum ^15. PolScope Analyse wurde durchgeführt, um den Mechanismus zu...

Discussion

Hier stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von kristalliner Cellulose in den verschiedenen Geweben , die Arabidopsis Wurzeln Komponieren, während anatomische Information erhalten bleibt. Als solches bietet es einen zusätzlichen Schritt in Richtung Wachstum zu verstehen Prozesse in Pflanzen auf zellulärer Auflösung. Dieses Verfahren kann auch für die Untersuchung der zusätzlichen Pflanzenarten und Organe angewendet werden.

Eine Reihe von Punkten berücksichtigt wer...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog (MS)	Duchefa	M0221
Borax	LOBA CHEMIE	6038
Methylenblau	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
spritzengetriebener 0,22 mm PVDF-Filter	MILLEX-GV
Glutaraldehyd	EMS	16220
Natriumcacodylat	Sigma	C-0250
Leica Bausatz Historesin	Leica	7022 18 500
Einbettformen	Agar Scientific	AGG3530
Film 100 & Mikro; P.P.C.			Überkopffolie
Messersägemaschine	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount		Thermo-9990402-Einbettmikroskop
	Nikon	Eclipse 80i
Abrio Bildgebungssystem	CRI	Abrio Bildgebungssystem
Abrio V2.2 Software	CRI	Abrio V2.2 Software
Frei zugängliche Bildanalysesoftware für polarisiertes Licht	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/