Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Arbeit zeigt, in-situ-Charakterisierung von Protein Biomolekülen in der wässrigen Lösung in dem Liquid Vacuum-Schnittstelle des Systems für die Analyse unter Verwendung von (SALVI) und Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). Die Fibronektin Proteinfilm wurde auf dem Siliziumnitrid (SiN), die die Membran immobilisiert SALVI Erfassungsbereich bildet. Während ToF-SIMS-Analyse wurden drei Arten der Analyse durchgeführt, einschließlich hoher räumlicher Auflösung Massenspektrometrie, zweidimensionale (2D) Bildgebung und Tiefenprofilierung. Massenspektren wurden im positiven und negativen Modus erworben. Entionisiertes Wasser wurde als Referenzprobe analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fibronektin Film in Wasser hat deutlicher und stärker Spitzen Wassercluster zu Wasser allein verglichen. Charakteristische Peaks von Aminosäure-Fragmente sind ebenfalls zu beobachten in der hydratisierten Protein TOF-SIMS-Spektren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteinmolekül Adsorption an einer Oberfläche dynamica sucht werden könnenlly Verwendung SALVI und ToF-SIMS in der flüssigen Umgebung zum ersten Mal.
Einleitung
Hydratation ist entscheidend für die Struktur, Konformation 1, 2 und 3 der biologischen Aktivität von Proteinen. Proteine ohne Wassermoleküle um sie herum wäre nicht lebensfähig biologischen Aktivitäten haben. Genauer gesagt, interagieren Wassermoleküle mit der Oberfläche und die innere Struktur von Proteinen und verschiedenen Hydratationszustände von Proteinen machen solche Wechselwirkungen deutlich. 4 Die Wechselwirkung von Proteinen mit festen Oberflächen ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen im Bereich der Nanotechnologie, Biomaterialien und Prozesse Tissue Engineering. Studien haben darauf hingewiesen, dass....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Reinigung und Sterilisation des SALVI Microchannel
- Sterilisation des Mikrokanals in SALVI
- Unentschieden 2 ml 70% Ethanol wässrigen Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlassende von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze am Ende der Injektion. Als nächstes den Einlass und Auslass von SALVI ein Polyetheretherketon (PEEK) Vereinigung anschließen werden. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe die gleiche Prozedur durchzuführen. Sie können beispielsweise die Strömungsgeschwindigkeit bei 100 & mgr; l / min.
- Halten Sie die SALVI Mikrokanal gefüllt mit 70% Ethanol-Lö....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Einige repräsentative Ergebnisse sind die Vorteile des vorgeschlagenen Protokolls zu demonstrieren. Durch die Verwendung der Mikrofluid-SALVI Schnittstelle der Primärionenstrahl (Bi 3 +) auf dem hydratisierten Film Fibronektin in DI Wasser direkt bombardieren. So ist die molekulare chemische Kartierung der Flüssigkeitsoberfläche erfolgreich erworben werden kann.
1a und 1b.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
SALVI ist ein Mikrofluidik-Schnittstelle, die durch Vakuumbasierte Instrumente, wie TOF-SIMS und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dynamische Flüssigkeitsoberfläche und Flüssig-Fest-Schnittstellenanalyse ermöglicht. Durch die Verwendung von kleinen Öffnungen Flüssigkeit auszusetzen direkt im Vakuum, ist SALVI für viele fein fokussierten Spektroskopie und bildgebenden Verfahren ohne Änderungen; 22 die Portabilität und Flexibilität der Mikrofluidik es eine echte multimodale Bildgebungsplattform machen. Besonder.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken dem Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) und Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD Fund für die Unterstützung. Der instrumentelle Zugang wurde durch einen Science Themed Proposal des W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) ermöglicht. EMSL ist eine nationale wissenschaftliche Nutzereinrichtung, die vom Büro für Biologische und Umweltforschung (BER) am PNNL gefördert wird. Die Autoren danken Herrn Xiao Sui, Herrn Yuanzhao Ding und Frau Juan Yao für das Korrekturlesen des Manuskripts und das nützliche F....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF. SIMS 5 | Auflösung: >10.000 m/Δ m für Massenauflösung; >4.000 m/Δ m für hohe räumliche Auflösung |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI ist ein einzigartiges, in sich geschlossenes, tragbares Analysegerät, das es zum ersten Mal ermöglicht, vakuumbasierte wissenschaftliche Instrumente wie die Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) zu analysieren, um Flüssigkeitsoberflächen in ihrem natürlichen Zustand auf molekularer Ebene zu analysieren. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | zum Verbinden des Einlasses und Auslasses von SALVI |
| 5 Achsen Probentisch | IONTOF | N/A | Tisch ist selbstgebaut für die Montage SALVI in ToF-SIMS |
| Barnstead Nanopure Water Pur Water Purification System | Thermo Fisher | Scientific D11921 | ROpure LP Umkehrosmose Filtrationsmodul (D2716) |
| Spritze | BD | 309659 | 1 ml |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Bereich: 100 bis 1.000 ml |
| Pipettenspitze | Neptune | 2112.96.BS | 1.000 & Mikro; l |
| Zentrifugenröhrchen | Corning | 430791 | 15 ml |
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F1141 | 1 mg/ml |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% vergällt |
| Gibco PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | pH 7,4 |
Referenzen
- Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. Water rotation barriers on protein molecular surfaces. Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).
- Maruyama, Y., Harano, Y. Does water drive protein folding? Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).
- Chaplin, M.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
