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Methodenartikel

Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

10.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/53709

⸱

7. Juni 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Studien haben gezeigt, dass die kathodale transkranielle Gleichstromstimulation suppressive Effekte auf arzneimittelresistente Anfälle haben kann. In dieser Studie wurde ein in vitro Versuchsaufbau entwickelt, in dem die Gleichstromstimulation und die Aufzeichnung der anfallsähnlichen Aktivität durch Multielektrodenarrays bei der Präparation von Hirnschnitten von Mäusen evaluiert wurden. Die Gleichstrom-Stimulationsparameter wurden ausgewertet.

Zusammenfassung

Kathodaler transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) induziert unterdrückende Wirkung auf arzneimittelresistente Anfälle. Um eine effektive Durchführung von Aktionen, die Stimulationsparameter (zB Orientierung, Feldstärke und Stimulationsdauer) müssen bei Mäusen Hirnschnittpräparaten untersucht werden. Prüfung und die Ausrichtung der Elektrode relativ zu der Position der Mäuse brain slice Anordnung sind denkbar. Das vorliegende Verfahren bewahrt den thalamocingulate Weg die Wirkung von DCS auf anterioren cingulären Kortex anfallsähnliche Aktivitäten zu bewerten. Die Ergebnisse der Mehrkanal-Array-Aufnahmen zeigten, daß die kathodische DCS deutlich die Amplitude der Stimulation hervorgerufenen Reaktionen und die Dauer von 4-Aminopyridin und Bicucullin induzierten anfallsähnliche Aktivität verringert. Diese Studie fand auch, dass die kathodische DCS Anwendungen bei 15 min Langzeit-Depression im thalamocingulate Weg verursacht. Die vorliegende Studie untersucht die Auswirkungen von DCS auf thalamocingulate synaptische Plastizität und akuten Anfall-ähnliche Aktivitäten. Das derzeitige Verfahren können testen , um die optimalen Stimulationsparameter einschließlich Ausrichtung, Feldstärke und Stimulationsdauer in einem in - vitro - Maus - Modell. Außerdem kann das Verfahren die Auswirkungen von DCS auf kortikalen anfallsähnliche Aktivitäten sowohl auf zellulärer und Netzwerkebenen bewerten.

Einleitung

Epilepsie ist eine häufige neurologische Erkrankung. Dreißig Prozent der Patienten mit Epilepsie leiden an medikamentenresistenten Anfällen1. Die transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Kontrolle oder Veränderung von Netzwerkaktivitäten in großen Gehirnbereichen, wie z. B. Krampfanfällen. Klinische Studien haben gezeigt, dass tDCS hartnäckige Anfälle wirksam behandelt2 und sowohl kurz- als auch langfristige suppressive Effekte auf die Anfälle3-5 haben kann. Der therapeutische Mechanismus der tDCS-Wirkung ist jedoch noch unklar. Bei dem vorgestellten Hirnschnittmodell handelt es sich um eine in vitro Methode, um zu untersuchen, wie der therapeutische Mechanismus der tDCS-Wirkung die Symptome von anfallsähnlichen Hirnaktivitäten verändert. Um eine optimale Wirkung zu erzielen, müssen daher bestimmte Stimulationsparameter wie Orientierung, Feldstärke und Stimulationsdauer in einem experimentellen Modell getestet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Ausrichtung des elektrischen Feldes wichtig ist, um therapeutische Effekte zu erzielen6. Somit ist es möglich, die Ausrichtung der Elektroden relativ zur Position des getesteten Hirnschnitts zu testen und anzuordnen.

Anfälle bei Frontallappenepilepsie und anteriorem cingulärem Kortex (ACC) sind oft arzneimittelresistent7,8. Einige Studien haben über die Anwendung von tDCS im cingulären Kortexberichtet 9-11. Es wurde gezeigt, dass tDCS die Vigilanz, die Entscheidungsfindung und die Emotionen durch Veränderung der ACC-Aktivitäten beeinflusst und die neuronale Erregbarkeit und Anfallsaktivität in dieser Gehirnregion modulieren kann12. Daher können suppressive Effekte von tDCS auf ACC-Anfälle für die klinische Behandlung und die Bewertung alternativer Behandlungen hilfreich sein.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung einer Elektrode in der Aufnahmekammer für die DCS eines Hirnschnitts und deren Auswirkung auf die anfallsähnliche Aktivitätsaufzeichnung mit einem Multielektrodenarray (MEA).

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Protokoll

Die Verfahren, die Tier Themen betreffen wurden von der Institutional Animal Care and Utilization Committee, Academia Sinica, Taipei, Taiwan genehmigt.

1. Vorbereiten Experimental-Lösung und Ausrüstung für die Multielektrodenarray Recording

  1. Vorbereitung künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 25 mM NaHCO 3 und 10 mM Glucose, mit 95% O 2 und 5% CO 2).
  2. Verwenden Sie zwei Arten von MEA-Sonden: 6 x 10 planaren MEA und 8 x 8 MEA. Die ehemalige Sonde umfasst die Region, die den Cortex, Striatum und Thalamus umfasst. Letztere Sonde deckt nur den kortikalen Bereich.
  3. Verwenden Sie ein 60-Kanal-Verstärker mit einem Bandpassfilter-Set zwischen 0,1 Hz und 3 kHz bei 1200 Verstärkung. Erwerben von Daten mit einer 10 kHz Abtastrate.
  4. Legen Sie zwei AgCl-beschichteten Silberdrähte in der MEA Kammer für DCS. Verwenden Sie die AgCl-beschichteten Silberdrähte elektrische Felder zu erzeugen, die durch einen isolierten Stimulator erzeugt werden.
  5. Legen Sie eine Wolframelektrode (Durchmesser, 127 & mgr; m, Länge, 7,62 cm; 8 ° AC verjüngte Spitze, Widerstand, 5 M & Omega;) für Thalamus-Stimulation, und legen Sie die Referenzelektrode in der MEA Kammer. Liefern die Ströme der Wolframelektrode einen isolierten Stimulator verwenden, die von einem Impulsgenerator gesteuert wird.

2. Hirnschnitt Vorbereitung

  1. Verwenden männliche C57BL / 6J-Mäuse, 4-8 Wochen alt. Haus die Tiere in einem klimatisierten Raum (21-23 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit, 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, um 8:00 Uhr leuchtet auf) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
  2. Nehmen Sie einen 250-ml-Aliquot des aCSF, die in Schritt 1.1, und legen Sie sie in ein Becherglas, das Eis enthält, hergestellt. Zugleich liefern kontinuierliche Gas , das 2 von 95% O 2 und 5% CO zusammengesetzt ist.
  3. Chirurgie
    1. Anesthetize das Tier mit 4% Isofluran in einem Glasfür ca. 3 min Feld. Sobald das Tier eine chirurgische Narkosetiefe erreicht (durch das Fehlen einer Antwort auf Zehe Prise angegeben), legen Sie es auf eine flache Schale, die mit zerstoßenem Eis gefüllt ist, und entfernen Sie den Kopf einer Schere.
    2. Expose den Schädel, und schneiden Sie die verbleibenden Muskel ab. Als nächstes mit rongeurs, ziehen Sie die dorsale Oberfläche des Schädels aus dem Gehirn entfernt. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit rongeurs. Sterilisieren alle der chirurgischen Instrumente mit einer 75% igen Ethanollösung.
    3. Mit einem Spatel, schneiden Sie die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns, und das Gehirn zu entfernen. Nach Enthauptung, Transfer schnell das Gehirn in ein Becherglas mit eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte aCSF gefüllt.
  4. Herstellung von Medial Thalamus (MT) -ACC Gehirn in Scheiben schneiden
    Hinweis: Bereiten Scheiben, die den Weg von der MT zu ACC - 13 enthalten.
    1. Hand schneiden das Gehirn Block mit zwei sagittale Schnitte 2,0 mm bis zur Mittellinie in jeder Hemisphäre lateraldie subcortical Anatomie anzuzeigen. Dann machen Sie zwei Winkelschnitte. Sprechen Sie die erste Querschnitt parallel zur sichtbaren Faser-Darm-Trakt im Striatum.
    2. Machen Sie das zweite Kreuzschnitt von der Verbindung zwischen dem Cerebellum und visuellen Kortex auf den Mittelpunkt zwischen dem vorderen Kommissur und Sehbahn, die dem thalamocingulate Weg ventralen und parallel sind.
    3. Bringen Sie das Gehirn Block auf eine Winkelplatte (~ 120 °) mit Cyanacrylatkleber, und einen Schnitt machen knapp über dem Wendepunkt des Weges. Klappen Sie die Platte, glätten sie und kleben Sie es auf die Kammer Stufe eines Vibratom.
    4. Machen Sie medialen Thalamus-ACC Hirnschnitten (500 & mgr; m dick) und tauchen sie dann in eiskaltem mit Sauerstoff angereicherte aCSF.Transfer Scheiben auf die Aufzeichnungskammer, und halten bei 32 ° C unter kontinuierlicher Perfusion (12 ml / min) mit Sauerstoff angereicherten aCSF für 1 h.

3. Herstellung von Perfusionskammer für Multielektrodenarray Recording

  1. Vorbereitungvon Perfusionskammer
    1. Legen Sie eine MEA-Sonde auf einem Mehrkanalsystem, und verwenden zwei separate Polyethylenröhrchen der Sonde an eine peristaltische Pumpe zu verbinden. Verwenden einen Röhre die aCSF in die MEA Kammer und dem anderen Rohr zu führen den aCSF aus der Kammer zu führen. Schließlich kontinuierlich die Zubereitung mit warm (29-30 ° C) oxygeniert aCSF (8 ml / min) perfundiert.
  2. Übertragen Hirnschnitt zu MEA. Halten Sie das Gehirn in Scheiben schneiden auf der MEA nach unten einen feuchten Wattestäbchen. bewegen Sie vorsichtig das Gehirn in Scheiben schneiden die ACC orientiert über den Elektroden zu gewährleisten.
  3. Verwenden Kits Scheibe Anker und Hold-downs das Gehirn Scheibe zu drücken. Dieser Schritt gewährleistet eine gute elektrische Verbindung zwischen der Scheibe und Elektroden.

4. Erzeugung von elektrischen Feldern durch DCS

Anmerkung: Die Definition des elektrischen Feldes Orientierung wurde auf der Grundlage der Richtung der axodendritic Achse in der ACC. Die Orientierungen von Dendriten und soma Abteile warenmit Golgi - Färbung bestätigt 12.

  1. Platzieren Sie die AgCl-Elektrode (definiert als die Anode) proximal des ACC und legen die andere Elektrode (definiert als die Kathode) distal der ACC. Aufzeichnung der Feldstärke, die durch die beiden Feldausrichtungen (parallel und senkrecht zu den ACC axodendritic Fasern) durch die MEA und liefern die Ströme der elektrischen Felder mit einem Stimulator erzeugt wird.
  2. Befestigen Sie den Abstand der AgCl-Elektroden (ca. 1,5-2 cm) und stellen Sie die Stromstärke des Stimulators die DCS zwischen 0,5 und 2 mA zu machen.

5. elektrisch induzierte Cortical synaptischen Antworten

Hinweis: Induzieren synaptischen Reaktionen im ACC durch elektrische Stimulation in dem MT, in dem ein programmierbarer elektrischer Reizgenerator Rechteck zweiphasige Stromimpulse erzeugt.

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 3 oben.
  2. Legen Sie eine Wolframelektrode im MT und liefern Impulse von dem Stimulator zur thalamic Bereich der Scheiben über bipolaren Wolframelektroden.
  3. Verwenden Sie verschiedene Stromstärken, die Schwelle zu bestimmen, die ein ACC Antwort auslöst. Hier verwenden eine Intensität von ± 150 & mgr; A und die Dauer von 200 & mgr; s, die eine 80% ige maximale Reaktion in der ACC in den meisten Scheiben hervorgerufen.
  4. Bewegen Sie die Wolframelektrode entlang der thalamocingulate Weg (von MT zu Corpus callosum) in der MT-ACC Scheibe, die optimalen Reaktionsprofile zu erhalten.
  5. Machen 10-20 Sweeps von ACC-Antworten, und verwenden Sie die Software im Durchschnitt automatisch alle von der ACC durch MT Stimulation hervorgerufen. Das Ergebnis iss die synaptischen Antworten in ACC induziert von MT-Stimulation durch MT-ACC-Weg.

6. elektrisch induzierte krampfanfallähnliche

Anmerkung: Seizure-ähnliche Aktivität wurde induziert durch die Anwendung von 4-Aminopyridin (4-AP; 250 uM) und Bicucullin (5 uM). Zurück Zeit-Kontroll-Studien zeigten, dass die maximale und stabile Antworten erschienen2-3 Stunden nach der Medikamentenapplikation 14.

  1. Wiederholen Sie Abschnitt 5 oben.
  2. Hinzufügen Medikamente zur Perfusionslösung. Verwenden Sie 4-AP (250 & mgr; M) und Bicucullin (5 uM). Mischen Sie die Medikamente gleichmäßig, und weiter Perfusion für 2-3 Std.
  3. Um anfallsartige Aktivität zu erleichtern, halten die Transfusionspumpe mit einer relativ schnellen Durchblutungsrate (8 ml / min), die auch dazu beitragen, den Aufbau eines pH-Gradienten zu verhindern.
  4. Legen Sie eine Wolframelektrode in der MT und liefern elektrische Stimulation (150 uA, 200 & mgr; s Dauer) ACC Antwortprofile erhalten.
  5. Machen 10-20 Sweeps und der Mittelwert der Antworten.
  6. Ersetzen Sie die Perfusionslösung mit frischen aCSF, um die Drogen auszuwaschen. Wiederholen Sie Schritt 6.5.

7. Prüfung Wirkung von DCS auf evozierte kortikale Antworten

  1. Wiederholen Sie die Abschnitte 3 und 4. sicherstellen, dass einheitliche elektrische Felder erzeugt durch Ströme zwischen zwei parallelen AgCl-beschichteten Silberdrähten vorbei, die innerhalb des M platziertEA Kammer. Wenn es keine Probleme gibt, bleibt das DCS zwischen 0,5 und 2 mA.
  2. Schalten Sie das DCS, und legen Sie eine Wolframelektrode den Thalamus (± 150 & mgr; A, 200 & mgr; s Dauer) zu stimulieren. Zur Erzielung maximaler synaptischen Antworten im ACC, machen 10-20 fegt und die Antworten im Durchschnitt.
  3. Gleichzeitig schalten Sie die DCS (2 mV / mm DCS Stärke) und Thalamus-Stimulation (350 uA, 200 & mgr; s Dauer). Bewerten Sie die Änderungen der Amplitude des Thalamus-Stimulation-evozierte ACC Reaktion während DCS.
  4. Schalten Sie das DCS, und fügen Sie 4-AP (250 & mgr; M) und Bicucullin (5 uM) zur Perfusionslösung. Dann 2-3 Stunden warten. Wenn die Medikamente das Gehirn in Scheiben schneiden beeinflussen, erzeugt die Scheibe kortikalen Anfalls Antworten.
  5. Machen 10-20 Sweeps von ACC-Antworten, und messen dann die Amplitude und Dauer des elektrischen evozierten kortikalen Anfalls Antworten.
  6. Nach dem Schritt 7.5, schalten gleichzeitig auf dem DCS (2 mV / mm DCS Stärke) und Thalamus-Stimulation (150 uA, 200 duratiauf & mgr; s). Bewerten Sie Änderungen in der Amplitude und Dauer der evozierten kortikalen Anfalls Reaktionen während DCS-Anwendung.
  7. Ersetzen Sie die Perfusionslösung mit frischen aCSF die Drogen zu waschen, und wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3.
  8. Sammle alle der Aufzeichnungsdaten, und der Gruppe, die Daten in den verschiedenen Versuchsbedingungen. Bewerten Sie die Amplitude und Dauer der kortikalen Anfalls Antworten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

8. Datenanalyse

  1. Verwenden Sie Software (zB MC - Rack - Software) , um automatisch die aufgezeichneten Antworten im Durchschnitt, und exportieren Sie die Rohdaten in eine Tabelle. Analysieren Sie die Amplitude und Dauer der Rohdaten und Farbzahlen generieren.
  2. Um Schwingungsanfallsereignisse erfassen, verwenden Software den Ausgangswert und Standardabweichungen (SD) zu messen. Set 3 SD des Rauschpegels als Schwellenwert. Amplituden der Spitzen während einer Schwingungs Ereignis, das diese Schwelle übertreffen werden automatisch erkennen,ed.
  3. Führen Sie die statistische Analyse unter Verwendung von Student-t - Test.
  4. Express - Messungen und eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) Ergebnisse im Text als Mittelwert ± SE, wobei n die Anzahl der Scheiben anzeigt , untersucht 12.

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Ergebnisse

Vorbereitung der Thalamocingulate Scheibe und MEA Recording System-Setup

Die MT-ACC slice von Mäusen ist eine spezielle Scheibe Zubereitung , die Erforschung der elektrophysiologischen Eigenschaften des thalamocingulate Wegs ermöglicht. 1A zeigt die Art und Weise , in der die MT-ACC Scheibe hergestellt. Das Gehirn der Maus wurde schnell entfernt und hielt in kühlen , sauerstoffreiches aCSF (1A, a, b).<...

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Diskussion

In der vorliegenden Studie wurden die Effekte der Dauer und der Orientierung von DCS auf ACC anfallsähnliche Aktivität wurden getestet. Um eine stabile Daten in mouse brain slices erhalten, wie die Integrität des MT-ACC-Weg zu halten und eine Beschädigung zu vermeiden, ist es Schlüssel, insbesondere die Schritte, in denen zwei abgewinkelte ventralen Einschnitte und eine dorsale Schnitt des Kortex hergestellt sind. Darüber hinaus kann die Zeit, um die Hirnschnitt herzustellen auch die Aktivität des Gehirns slice beeinflu...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung durch den Neural Circuit Electrophysiology Core an der Academia Sinica. Diese Arbeit wurde vom National Science Council (102-2320-B-001-026-MY3 und 100-2311-B-001-003-MY3) und dem Neuroscience Program der Academia Sinica unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anästhetikum:
IsofluraneHalocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
aCSF (gesamt:1 L):
D(+)-GlukoseMERCK1.08337.100010 mM
NatriumhydrogencarbonatMERCK1.06329.050025 mM
NatriumchloridMERCK1.06404.1000124 mM
(+)-Natrium-L-Ascorbat, >=98%SIGMAA4034-100G0,15 g/2 c.c
Magnesiumsulfat, wasserfrei, ReagentPlusSIGMAM7506-500G2 mM
Calciumchlorid-DihydratMERCK1.02382.10002 mM
Natriumdihydrogenphosphat MonohydratMERCK1.06346.10001 mM
KaliumchloridMai & Baker Ltd Dagenham EnglandMS 76164.4 mM
NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
Medikamente:
(+)-BicucullineTOCRIS01305 µ M in aCSF
4-AminopyridinTOCRIS0940250 µ M in aCSF
NameCompany<>Katalognummer<strong>Kommentare
Brain slice Vorbereitung:
VibratomeVibratomeSeries 1000Block Schneiden in 500 & Mikro; m dicke Scheiben
Name<>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
MEA System:
Sonden: 6 x 10 planare MEAMehrkanalsysteme60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10Elektrodendurchmesser, 30 &Mikro; m; Elektrodenabstand, 500 & Mikro; m; Impedanz, 50 kΩ bei 200 Hz
Multielektrodenarray (MEA) Sonden: 8 x 8 MEA Ayanda Biosystems60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8pyramidenförmige Elektrode; Durchmesser, 40 & Mikro; m; Spitzenhöhe, 50 &Mikro; m; Elektrodenabstand, 200 & Mikro; m; Impedanz, 1.000 kΩ bei 200 Hz
Es wurde ein 60-Kanal-Verstärker mit einem Bandpassfilter verwendet, der zwischen 0,1 Hz und 3 KHz bei 1.200-facher Verstärkung eingestelltMehrkanalsystemeMEA-1060-BC
MC Rack-Software mit einer Abtastrate von 10 KHzMehrkanal-SystemeSoftware zur Datenerfassung und Aufzeichnung
eines ImpulsgeneratorsMehrkanal-SystemeSTG 1002
Schichtanker-Kits und HalteWarner InstrumentsSHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltische Pumpe-minipuls3GilsomMINIPULS3Perfusionsrate : 8 ml/min
NameCompanyKatalognummer>Kommentare
>Stimulationssystem:
Isolierter StimulatorA-M SystemsModell 2100Intensität von ± 350 μ A , Dauer von 200 μ sec
WolframelektrodeA-M Systems575300im Thalamus platziert
Multielektrodenarray (MEA) ist Steuerung

Referenzen

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Thalamocingulärer Pfadanteriorer cingulärer CortexFeldstärkeStimulationsdauerElektrodenorientierungkathodale DCS
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