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Methodenartikel

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode

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DOI:

10.3791/53712

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28. März 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Protokolle, die speziell zur Überwachung morphogener Defekte entwickelt wurden, die während der frühen und späten Phasen der embryonalen Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans auftreten. Letztendlich sind diese Protokolle darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die diese Phasen regulieren, und ihre unterschiedlichen Anforderungen entlang der antero-posterioren Achse des Embryos zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Entschlüsselung der Signalwege, die die Veränderung morphogener Prozesse während der Embryonalentwicklung steuern, erfordert robuste und empfindliche Metriken. Die embryonale Elongation des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ist ein spätes Entwicklungsstadium, das aus der Verlängerung des Embryos entlang seiner Längsachse besteht. Dieses Entwicklungsstadium wird durch die interzelluläre Kommunikation zwischen den hypodermalen Zellen und der darunter liegenden Körperwandmuskulatur gesteuert. Diese Signalmechanismen steuern die Morphologie der hypodermalen Zellen, indem sie das Zytoskelett und die Zell-Zell-Verbindungen umbauen. Die Messung der embryonalen Letalität und des Entwicklungsstillstands im Larvenstadium sowie die Veränderung des Zytoskeletts und der Zell-Zell-Adhäsionsstrukturen in Hypodermis- und Muskelzellen sind klassische Phänotypen, die seit mehr als 25 Jahren verwendet werden, um diese Signalwege zu entschlüsseln. Neuere Studien erforderten die Entwicklung neuartiger Metriken, die speziell auf die frühe oder späte Elongation abzielen und morphogene Defekte entlang der antero-posterioren Achse des Embryos charakterisieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, die eine genaue Messung der Länge und Breite der länglichen Embryonen sowie der Länge der synchronisierten Larven ermöglichen. Diese Methoden stellen nützliche Werkzeuge dar, um Gene zu identifizieren, die die Elongation steuern, um zu beurteilen, ob diese Gene sowohl die frühe als auch die späte Phase dieses Stadiums kontrollieren und gleichmäßig entlang der antero-posterioren Achse des Embryos erforderlich sind.

Einleitung

Seit fast 50 Jahren gründeten die Nematode Caenorhabditis elegans sich als leistungsfähiges Modell wichtige Fragen in der Entwicklung, der Neurobiologie, evolution, Wirt-Pathogen - Interaktionen usw. 1 Die Stärke dieses Modells in der Studie der Entwicklung zu studieren , liegt in: seiner kurzen Lebenszyklus von 3 Tagen; die Leichtigkeit, mit der diese Tiere gentechnisch verändert werden; seine Transparenz, die die Beobachtung der Zell Verschiebung und Morphologie in lebenden Tieren und deren Entwicklung, die vor allem Extrauterin- ist ermöglicht. Die Entwicklungsstadien des Nematoden umfassen Embryonalentwicklung und vier Larvenstadien (L1 bis L4), gefolgt von Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung, zog epidermal Morphogenese beträchtliche Aufmerksamkeit auf seine Fähigkeit, um ein besseres Verständnis davon, wie Epithelzellen wandern als Gruppe zu ermöglichen, wie sie ihre junctions reorganisieren und ändern ihre individuellen Morphologie sowie deren relative Positionierung innerhalb eines funktionellen Epithels.Epidermal Morphogenese ist in vier Stufen unterteilt: dorsale Einlagerungs bestehend in der Reorganisation der dorsalen epidermalen Zellen, als der Unterhaut bezeichnet; ventralen Gehäuse, in der Migration von ventralen hypodermal Zellen in Richtung der ventralen Mittellinie aus so den Embryo in einer epithelialen Zellschicht umhüllt; Früh- und Spät Dehnung Umwandlung der bohnenförmigen Embryos in vermiform Larven. Im Anschluss an die Morphogenese, Embryo Luke und L1-Larven beginnen mit den verfügbaren Bakterien in ihrer unmittelbaren Umgebung ernähren.

Embryonic Dehnung ist daher eine späte Phase der Embryonalentwicklung. Es besteht aus der Verlängerung des Embryos entlang seiner Längsachse und eine Verringerung seines Querdurchmesser. Dies bedeutet eine drastische Änderung der Form der hypodermalen Zellen. Dehnung ist unterteilt in eine frühe und eine späte Phase. Die frühe Phase beginnt mit dem Komma Bühne und endet , wenn die Körperwand Muskeln in w bei 1,75-facher Etappenvertragsild Typ (wt) Embryonen - entsprechend Embryonen , die 1,75-fache in der Länge im Vergleich zu nicht verlängert Embryonen. Morphogene Prozesse in diesem Stadium auftreten , werden in erster Linie durch die Kontraktion von fädigen Aktinbündel (FB) am apikalen Pol hypodermal Zellen angeordnet angetrieben, die ihre Dehnung entlang der anteroposterioren Achse des Embryos 2 fahren. Die Kontraktion der FBs ist die Kontrolle durch die Phosphorylierung von Myosin-Leichtketten durch drei Kinasen LET-502 / ROCK, MRCK-1 und PAK-1 5. Die Spätphase der Verlängerung beginnt, wenn die Körperwand Muskeln funktionsfähig werden und Contracting beginnen. Es geht um Mechanotransduktion Signalisierung von den Körperwandmuskulatur zu den dorsalen und ventralen hypodermal Zellen und endet , wenn die Tiere 3 schlüpfen.

Dehnungsfehler werden durch den Prozentsatz der Tiere als Embryonen (Embryonale Letalität; Emb) sterben im Allgemeinen gekennzeichnet und diejenigen zu verhaften ihre Entwicklung als L1-Larven (Larven Verhaftung Phänotyp; Lva) aufweist und deutlich kürzer als Gew. Bezeichnung des Stadium der Entwicklungsstopp erfordert mikroskopische Beobachtung von toten Embryonen und verhaftet Larvae 3-6.

Es wurde vor kurzem gezeigt , dass mehrere Gene, wie die Cdc42 / Rac Regler und Effektor pix-1 und pak-1, während morphogenic Prozesse steuern sowohl frühe als auch späte Dehnung 3,7. Wir zeigten auch vor kurzem , dass morphogenic Prozesse entlang der anteroposterioren Achse der Embryonen während der frühen Verlängerung 3 7 unterscheiden. Diese Erkenntnisse die Entwicklung neuer Metriken motiviert speziell frühe oder späte Verlängerung Stadien und anderen Metriken Targeting ermöglicht die Charakterisierung der Morphologie der Embryonen entlang ihrer anteroposterioren Achse während der frühen Dehnung.

Diese neuen Verfahren bestehen, um die Länge von Embryonen zu Beginn und am Ende des frühen Dehnung sowie die Breite der bei der Messung erAnzeigen und Schwänzen. 7 Zwei Protokolle wurden auch die Länge der frisch geschlüpften Larven zu messen entwickelt, synchronisiert auf L1 Stufe 7.

Die Eischalen der Embryonen schützen sie gegen alkalischen Hypochlorit-Behandlung während Larven, Erwachsene und Bakterien in den Kulturmedien durch die Behandlung gelöst sind. Diese Behandlung wird dann verwendet , Embryonen zu reinigen , aus einem nicht-synchronisierten Population eine Mehrheit von gut ernährt Erwachsene 8 enthält. Lebensmittel Einschränkung verwendet frisch geschlüpften Larven zu synchronisieren. Messen der Länge dieser Larven wird dann verwendet, Verlängerung Defekte zu detektieren. Diese Messung wird über die Messung der verhafteten Larven auf Kulturplatten bevorzugt, da Larven, die aus nicht vollständig länglichen Embryonen schlüpfen können "normale Länge" erholen, wenn Fütterung aber ihre reduzierte Größe beibehalten, wenn in Abwesenheit von Lebensmitteln festgenommen.

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle ermöglichen die Messung der lenge von Embryonen sowie die Breite des Kopfes und der Schwanz mit Zeitraffer-DIC-Mikroskopie und Bildanalyse (Protokoll 1) verlängert wird. Wir bieten auch detaillierte Protokolle über die Länge der synchronisierten Larven mittels Bildanalyse (Protokoll 2) und Durchflusszytometrie (Protokoll 3) zu messen.

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Protokoll

1. Charakterisierung der frühen Mängel Dehnung in WT und Mutant Tiere

  1. Montage Embryonen für Normarski DIC - Mikroskopie
    1. Bereiten Sie die folgenden Kulturmedien und Material:
      1. M9 - Puffer, lösen sich 12,8 g / L Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L NaCl, 0,25 g / L MgSO 4 • 7H 2 O in destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren.
      2. NGM - Platten, lösen sich 3 g / L NaCl, 16 g / L Agar, 2,5 g / l Bactopepton in ddH 2 O. Autoklaviert und fügen 1 mM MgSO 4, 1 mM CaCl 2, 1 mM Phosphatpuffer und 5 ug / ml Cholesterin. Gießen 6 ml NGM pro 60 mm-Schalen. Das Medium für 24 Stunden bei Raumtemperatur zu verfestigen. Fügen Sie ein paar Tropfen einer gesättigten Kultur von E. coli OP50 Bakterien in Luria - Brühe (LB) gezüchtet. Lassen die Bakterien für 48 Stunden wachsen und zu speichern, die Platten bei 4 ° C.
      3. Zur Erzeugung der Wurm pick, montieren Sie einen 0,01 "Durchmesser Platindraht auf einer kurzen Pasteurpipette. Befestigen Sie den Platindraht an das Ende des Glaspipette durch dieses Ende mit einem Benzol Brenner erhitzt wird. Glätten Sie das Ende des Drahtes eine Art Schaufel zu erzeugen.
    2. Wachsen die Wurmstamm auf 60 mm NGM-Platten mit OP50 bei 20 ° C.
      HINWEIS: Wärmeempfindliche Allele erfordern kann bei bis zu 25,5 ° C, die Tiere bei nicht-permissiven Temperaturen wachsen. Die Platten sollten viele junge Erwachsene enthalten und immer noch genügend Nahrung, um die Protokolle zu verfolgen.
    3. Platzieren Sie einen Objektträger zwischen zwei Distanzrutschen bedeckt durch zwei Lagen Abdeckband (1A).
    4. in 20 ml M9-Puffer durch Erhitzen in der Mikrowelle während 30 sec Bereiten einer 3% igen Agarose-Lösung (Gewicht / Volumen) in M9-Puffer von 0,6 g Agarose-Pulver aufzulösen. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten abkühlen lassen.
      HINWEIS: Die Agarose-Lösung kann für einige Tage verwendet werden, nachdem in einem Mikrowellen schmelzen. Eskann auch bei 4 ° C über Wochen aliquotiert und gelagert werden.
    5. Geben Sie einen Tropfen heißen 3% igen Lösung auf dem Glasträger zwischen den beiden Distanzrutschen. Vermeiden Sie Blasen bilden.
    6. Schnell decken die Agarose mit einer anderen Folie als sanft in 1B und drücken nach unten gezeigt. Die obere Folie wird die Agarose Tropfen flach und ein Kissen mit der Dicke von zwei Schichten aus Kreppband erzeugen.
    7. Erlauben die Agarose für mindestens 1 min bei Raumtemperatur zu verfestigen, oder bis die Embryonen sind bereit, auf die Unterlage übertragen werden.
    8. Mit Hilfe eines Schnecken Pick, Transfer 20 bis 30 gut gefüttert jungen Erwachsenen aus der NGM-Platte in einen Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 ul M9-Puffer.
    9. Erlauben die Würmer etwa 5 min durch die Schwerkraft zu sedimentieren und der Überstand unter Verwendung einer Mikropipette entfernt werden. Dieser Schritt zielt darauf ab, die maximale Anzahl von Bakterien mit den Nematoden gepflückt zu entfernen.
    10. Mit 200 & mgr; l M9-Puffer zu jedem Röhrchen.
    11. Mit Hilfe einer Pasteur pipette, übertragen den Inhalt des Röhrchens (buffer und Nematoden) auf einem Uhrglas.
    12. Verwenden Sie eine oder zwei 25G 5/8 "Nadeln, die Tiere zu schneiden in der Mitte Körperabschnitt (zwischen dem Spermatheka und der Vulva).
      ANMERKUNG: Eine Skalpellklinge kann auch als Alternative zur Nadel (n) verwendet werden. Tun Sie dies auf Schwimmen Nematoden und kann einige Übung erfordern. Die Idee ist, Nadeln wie Schere oder als Messer zu verwenden, je nachdem, wie viele Nadeln verwendet werden. Sobald die Tiere aufgeschnitten werden, lassen Hermaphroditen ihre Embryonen in den Puffer.
    13. Konzentrat Embryonen in der Mitte der Uhr Glas durch Erzeugung eines kreisförmigen Wirbel in der Flüssigkeit.
    14. Entfernen Sie die meisten der M9 aus dem Uhrglas mit einer Mikropipette. Lassen Sie etwa 30 ul M9 mit den Embryonen.
    15. Entfernen Sie die Folie für den Agarose - Pad (1B) , indem Sie sie das Pad gleiten.
    16. Schneiden Sie das Pad mit einer Rasierklinge, um der Lage sein, vollständig zu bedecken mit einem Deckglas (1C).
    17. Mit Hilfe einer Pasteurpipette übertragen alle Embryonen (und Wurm Schutt) auf die Agarose-Pad.
    18. Gruppe die Embryonen in der Mitte des Pads mit der Wimper am Ende einer Spitze für 200 & mgr; l Mikropipetten verwendet geklebt werden.
    19. Platzieren Sie langsam ein Deckglas auf dem Pad zu vermeiden Blasenbildung und abdichten.
      HINWEIS: Mehrere Versiegelungen verwendet werden kann. Wir verwenden Zeichnung Gummi in Kunst und Handwerk-Läden zu finden (in der Regel als Maskierung Gummi für aquarelle Malerei verwendet wird). Dieser Gummi wird verwendet, da es hydrophil ist und erstarrt relativ schnell und ist für die Würmer nicht toxisch. Dias können auch mit Nagellack oder VALAP (Mischung aus Vaseline, Lanolin und Parafin-Wachs) abgedichtet werden.
    20. Lassen Sie die Zeichnung Gummi trocken für ca. 15 min.
  2. Aufnahme Frühe Elongation Vierdimensionale Normarski DIC - Mikroskopie
    HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist frühen Elongation von Komma Anfang Ende Dehnung aufzunehmen- Definiert als der Moment, wenn die Körperwand Muskeln Contracting beginnen. Wir wollen auch mehr als ein Embryo in der Zeit aufzuzeichnen. Acht Stunden Aufnahme sind in der Regel erforderlich, um frühe Verlängerung für eine Gruppe von nicht synchronisierten Embryonen aufzuzeichnen.
    1. Setzen Sie den montierten Schlitten auf der Bühne eines Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop mit 10X und 60X Ziele sowie DIC Linsen ausgestattet ist, Prisma, Kamera und Capture-Software ermöglicht Zeitraffer-Mikroskopie und die Erzeugung von Z-Stapel (automatisierte Z-Plattform).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Temperatur zwischen 20 und 23 ° C in der Mikroskopie Raum konstant ist. Eine Heiz-Kühlkammer kann auf dem Mikroskoptisch erforderlich sein, insbesondere wenn thermo Mutanten verwendet.
    2. Identifizieren einer Gruppe von Embryonen im Pre-Morphogenese Stufen der 10X-Objektiv verwendet wird.
    3. Sobald sich, schieben Sie die 10X-Objektiv und fügen Sie auf der Folie einen Tropfen Öl Tauchen.
    4. Mit dem 60X Ziel, identifizieren Sie die oben und unten von embryos zur Einrichtung der Z-Stapel Bildparameter.
      HINWEIS: Zögern Sie nicht, den Z-Stack größer als die Dicke der Embryonen zu setzen. Die Entfernung zwischen zwei benachbarten Ebenen von 0,8 & mgr; m. Dies ermöglicht es in 35 bis 50 Z-Pläne, die Gesamttiefe der Embryonen zu decken.
      HINWEIS: Wenn das Mikroskop ein automatisiertes XY-Plattform enthält, an verschiedenen Stellen des Polsters angeordnet Embryonen gleichzeitig aufgenommen werden können. Dazu koordiniert Datensatz xy jeder Standort auf dem Pad, das Sie wollen im Laufe des Experiments zu analysieren. Achten Sie auf die xy zu wählen, wenn die Aufnahmeparameter einstellen und den Rest des Protokolls folgen, wie angegeben. Thin Z-Sektionieren des Embryos während der Aufzeichnung wird für die Messungen in diesem Protokoll detailliert nicht unbedingt erforderlich. Aufnahme der embryonalen Entwicklung von wt und mutanten Tiere mit der maximalen Auflösung ist jedoch eine gute Praxis , um eine Bibliothek von Aufnahmen können zusätzliche Analysen zu bauen unterstützen.
    5. Setup der Zeitraffer mit 2-Minuten-Intervallen zwischen zwei Akquisitionen nachhaltig 8 Stunden.
      HINWEIS: Die Belichtungszeit von der Lichtintensität für das Mikroskop gesetzt abhängen. Zellbewegung während der frühen Dehnung ist sehr langsam; Belichtungszeit könnte etwa ein Bild pro Sekunde oder weniger sein. Wenn die Embryonen in einem frühen Morphogenese Stufen (dorsale Einlagerungs, ventralen Gehäuse) sind, würde eine frühzeitige Verlängerung innerhalb 1 Stunde aufgezeichnet werden. Stellen Sie sicher, Lichtblende ist zwischen jedem Erwerb geschlossen.
    6. Führen Sie den Erwerb und speichern.
  3. Die Messung der Frühe Elongation Defekte Bildanalyse
    1. Offene Fidschi-ImageJ Software ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. Analyse / Set Messungen im Menü wählen, wählen Sie Perimeter. Für jeden Embryo, stellen Sie die Z-scale bar auf den Pharynx des Embryos zu konzentrieren , wie in 2A gezeigt. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie auf die Mitte des Embryos zu konzentrieren.
    3. Um die Länge des Embryos zu messen, stellen Sie die Bar Zeitskala den Embryo von Interesse zu Beginn der frühen Dehnung zu haben (comma Stufe; 2A). Beachten Sie die Zeit ( "Time-Anfang").
    4. Wählen Sie das segmentierte Zeilenwerkzeug. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie von der Spitze der Mündung des Embryos bis zur Schwanzspitze nach der Mittellinie des Embryos (2A). Mit Hilfe der Menüreiter die Länge der gezogenen Linie ( "Länge Anfang") analysieren / Messen, erhalten.
    5. Wiederholen Sie diese Messung für den gleichen Embryo am Ende der frühen Dehnung (Moment, wenn Muskeln Contracting beginnen). Beachten Sie die Zeit ( "Time-end") und messen die Länge des Embryos ( "Length-end") wie oben (2B) beschrieben.
    6. Berechnen der Dauer (D) der frühen Dehnung und der Längenzunahme (L) in dieser Phase, wie folgt:
      D = "Time-end" - "Time-Anfang"
      & #160; L = "Length-end" - "Length-Anfang"
    7. Um die Kopfbreite messen, einstellen bar die Zeitskala in der Phase von Interesse um einen Embryo zu haben (1,2-fache der Bühne oder am Ende der frühen Dehnung). Wählen Sie den geradlinigen Werkzeug. Zeichnen Sie die transversale (dorsoventrale Achse) Mittellinie des Kopfes. Dieser Abschnitt ist der dickste Teil des Embryos (Abbildung 2C). Mit der Menü Analysieren / Messen, erhalten die Länge der Linie der Breite Kopf entspricht.
    8. Zur gleichen Zeitpunkt, wiederholen Sie diesen Schritt für die transversale Mittellinie des Schwanzes Zeichnung (Mid-Linie zwischen dem Darm-Ventil und der Spitze des Schwanzes; 2C) und messen sie den Schwanz Breite zu erhalten.
      HINWEIS: Um diese Messung verwenden Embryonen in verschiedenen Phänotypen auf der gleichen Stufe zu vergleichen. rund um die Mittellinie des Schwanzes des Tieres angeordnet, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten, stellen Sie sicher, einen Ort zu finden, die leicht von einem Tier auf ein erkannt werden könnennother.
    9. Um den Kopf bis zum Schwanz Breite-Verhältnis berechnen, teilen Sie die Kopfbreite durch den Schweif Breite.

2. Charakterisierung der Spätdehnung Defekte Bildanalyse

  1. Die Synchronisation von L1 - Larven mit Alkaline Hypochlorit - Behandlung
    1. viele trächtige Erwachsene enthält, sammeln Sie alle Würmer in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus einem nicht verhungert 60 mm Platte durch die Nematoden von der Platte Waschen mit 1 ml M9-Puffer mit einer Pasteurpipette.
    2. Sediments Nematoden bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette ohne den Wurm Pellet zu stören.
    3. 1 ml der Hypochloritlösung zu jedem Röhrchen (0,4 M Hypochlorit, 0,5 M NaOH) und Schütteln für 3 min.
      HINWEIS: Alkaline Hypochlorit-Lösung frisch zubereitet werden soll und Embryonen in dieser Lösung sollte vorsichtig bewegt werden, sondern kontinuierlich Auflösung der Erwachsenen und die Sauerstoffversorgung des embr zu optimierenYos. Nach 3 min Rühren die meisten Erwachsenen sollten ihre Eier in die Lösung freizusetzen.
    4. Schleudern bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und schnell zu entfernen, um den Überstand mit einer Mikropipette, ohne das Pellet zu stören.
    5. Viermaliges Waschen mit 1 ml M9-Puffer, gefolgt von Zentrifugation bei 3.500 × g für 3 min.
    6. Nach dem vierten Wasch Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Eier in 700 ul M9-Puffer ohne die Eier Pipettieren up (wie die Eier auf dem Kunststoff der Spitze haften bleiben würde).
    7. Band das Rohr auf einem 3-mm-Orbitalschüttler in einem Inkubator bei der entsprechenden Wachstumstemperatur gebracht und schütteln über Nacht bei 600 Umdrehungen pro Minute.
  2. Längenmessung von Synchronized Larvae
    1. Zentrifuge verhaftet L1-Larven bei 3.500 × g für 3 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren die Larven in 100 ul M9-Puffer und übertragen sie auf einem Agarose-Pad mit einer Pasteurpipette (Agarose-Pads sollte vorbereitend wie in Abschnitt 1.1.2 bis 1.1.8 beschrieben). Legen Sie ein Deckglas auf dem Pad.
      HINWEIS: Das Pad nicht mit Gummi für dieses Experiment abgedichtet werden muss, die kurze Erwerb beinhaltet.
    2. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv und Phasenkontrast-Beleuchtung, die Länge der Larven zu messen, wenn eine hochauflösende Kamera verwendet wird. Erhöhen Sie die Intensität des Lichts , der Lage sein , ein klares Bild von den Larven (2D) zum Erfassen von Bildern innerhalb von wenigen Millisekunden und somit erhalten.
      HINWEIS: Während die Schwimm trashes der Larven durch die Agarose-Pad reduziert werden, werden sie noch in Bewegung. Daher ist die schnelle Aufzeichnung wichtig, ein klares Bild zu erhalten.
    3. Öffnen Sie Fidschi-ImageJ und wiederholen Sie Schritt 1.3.1. Um die Länge der Larven zu messen, wählen Sie die segmentierte Zeilenwerkzeug. Zeichnen Sie eine segmentierte Linie von der Spitze des Kopfes bis zur Spitze des Schwanzes nach der Mittellinie der Larven (2D, rechts).
    4. Über das Menü Analyse / Messen, erhalten die Länge dergezogene Linie zu der Länge der Larven in Mikrometer entspricht.

3. Charakterisierung der Spätdehnung Defekte Mit Durchflusszytometrie

  1. Synchronisieren Sie Larvae
    1. Reinige Embryonen die alkalische Hypochlorit-Behandlung, wie in Abschnitt 2.1 von vollen 100-mm-Platten von gut genährten jungen Erwachsenen beschrieben und lassen den Embryo Luke und die L1 Arrest in M9-Puffer für 16 bis 24 Stunden lang bei 20 oder 25,5 ° C in Abhängigkeit von der Belastung analysiert.
      HINWEIS: Eine volle Teller von gut genährten Erwachsene pro Stamm ist ausreichend für die Analyse weiter unten beschrieben.
  2. Die Kalibrierung des Worm Sorter
    HINWEIS: Das Durchflusszytometer hier verwendet wird, eine große Partikel Durchflusszytometer (im Folgenden als der Schnecken Sortierer bezeichnet). Der Wurm Sortierer enthält eine 670 nm roten Diodenlaser, die vor einer Extinktion Detektor befindet. Der Wurm Sortierer enthält auch eine mehrzeilige Argon-Laser für Fluoreszenzanregung. Die standard Instrumente haben drei Photovervielfacherröhren (PMT) Fluoreszenzdetektoren verwendet, um Fluoreszenzemissionen in den grünen, gelben und roten Bereiche des Spektrums erfassen. In dem Protokoll hier beschrieben wird TOF verwendet werden, um die Größe der Larven zu messen, wird der rote Kanal verwendet werden tote Würmer zu identifizieren, die mit Propidiumiodid (PI) wird gefärbt. GP (General Purpose) hohe Fluoreszenzkontrolle Partikel verwendet, um das Instrument und als interne Kontrolle in unserem Experiment zeigen eine hohe Fluoreszenz in grün, gelb und rot zu kalibrieren. Sie werden nur die Objekte in der Probe mit hoher Emission im grünen Kanal detektiert analysiert und wird anschließend auf der Basis dieser Kennlinie ermittelt werden.
    HINWEIS: Lebende Tiere werden auf der Grundlage der Abwesenheit von Fluoreszenz in den grünen und roten Kanal sowie auf der TOF identifiziert. Autofluoreszie- Emission aus dem Darm der Larven ist bei L1 Stadium nicht nachweisbar.
    1. Schalten Sie den Laserblock, der Computer, der Kompressor eind der Wurm Sortierer Instrument. Drücken Sie die START-Taste auf der Wurm Sorter Software geöffnet, wie in der Bedienungsanleitung des Gerätes angezeigt.
    2. Beachten Sie die Argon-Laser Steuerung Pop-up-Fenster. Wählen Sie RUN-Modus und warten, wie die Laserleistung 10 ± 1 mW erreichen. Wählen Sie FERTIG auf dem Laser-Kontrollfenster.
    3. Stellen Sie den Mantel und die Probendrücken auf 5,10 ± 0,02 und 5,51 ± 0,01 beziehungsweise. Lassen Sie den Druck für mindestens 15 min äquilibrieren und klicken Sie auf OK DRUCKKontrollKästchen.
      HINWEIS: Die Durchflussrate auf der Hülle und den Probendruck abhängt.
    4. Sicherstellen, dass alle Blasen, die in den Strömungskanal Tubuli zwischen der Probenschale und der Analysekammer zu beseitigen. Dazu ACQUIRE klicken und sanft die Tubuli Flick, bis keine Luftblase erworben werden (wie im Aufnahmefenster zu sehen ist).
    5. Einstellung aller Parameter für Leuchtstoff- und TOF Messung und Erfassung wie folgt:
      1. Stellen Sie die Waage für TOF, Ext, Grün, Gelb und Rot256. Set Gewinn wie in Tabelle 1 beschrieben. Set PMT Steuerung bei 700 für Grün und Gelb und 900 für Rot.
        HINWEIS: Zwei Anregungsfilter zur Verfügung (488 nm und 514 nm) und kann verwendet werden, um entweder das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder gelb fluoreszierendes Protein (YFP) oder jegliche Fluorochrome bei diesen Wellenlängen mit dem mehrzeiligen Argonlaser angeregt zu erregen. Entsprechende Filter müssen in der Filterkammer des Gerätes eingesetzt werden. Wir verwendeten die 488 nm-Filter für das folgende Experiment.
    6. Um den Wurm Sortierer kalibrieren, wählen Sie "Run Control Partikel" in Werkzeugmenü. Setzen Sie 20 ml 1x GP (General Purpose) hohe Fluoreszenzkontrolle Partikel in der Tasse (diese Partikel sind fluoreszierende Partikel präzise Größe, von der Zytometrie Hersteller verkauft ihr Instrument zu kalibrieren).
    7. Klicken Sie auf ACQUIRE-Taste Hülle und Probenfluss zu beginnen.
      HINWEIS: eine mittlere Erwarten Sie, um die Verteilungsregelung Teilchens von 21 ± 6 und acoefficient Variations um diesen Mittelwert (CV) ≤11. Wenn der CV ist> 11 und der Mittelwert> 27 versuchen, die Röhrchen zu reinigen, indem mehrmals auf der sauberen Schaltfläche klicken oder den Strömungskanal schnippen.
  3. Erwerb von Tier TOF
    HINWEIS: Licht streut, wenn ein Objekt geht in der Flusszelle zwischen der Laserquelle und dem Aussterben Detektor. Die Zeit, die das Licht braucht vom Flugobjekt (time of flight, TOF) wird verwendet, um zu messen, die axiale Länge des Objekts gestreut. Das Ausmaß des Lichts durch das Objekt maskiert (Extinktion, EXT) als Maß für die Opazität / optische Dichte verwendet.
    1. Platz 10 ul synchronisiert Wildtyp (wt) L1 in einem Uhrglas und schätzen den Prozentsatz der toten Eier ein Binokular mit.
      HINWEIS: Synchronisierte L1 Anzeige hoher Emb (höher als 20%) in wt sollte nicht für die weitere Analyse verwendet werden.
    2. Transfer synchronisiert L1 vom Mikro (approximately 700 & mgr; l M9 enthält L1) zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen , Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 10 ug / ml (Verdünnung 1/100 von einer 1 mg / ml Stammlösung) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Tote Eier und Larven werden als stark fluoreszierende Objekte unter Verwendung von PI und erfasst werden gefärbt, um die roten Kanal.
    3. 10 ml M9-Puffer gefärbten Populationen zu verdünnen. Nehmen Sie 5 ml der verdünnten Populationen und verdünnen sie viermal um 15 ml M9-Zugabe. Dieses Verdünnung in den Probenbecher.
    4. Führen Sie den Probenfluss durch Klicken akquirieren und beobachten die Fließgeschwindigkeit.
      HINWEIS: Um eine genaue Messung zu haben, die Durchflussrate sollte zwischen 15 und 25 Objekte / s bleiben.
    5. Falls erforderlich, passen Sie die Menge der Tiere in der Tasse die gewünschte Strömungsrate zu erreichen.
      HINWEIS: Die Strömungsrate hängt von dem Druck (Mantel und Probe), die konstant sind, wie in 3.2.3 und von der Konzentration der Larven i angedeutetn die Tasse. Wenn die Durchflussrate von mehr als 25 Objekte / s etwas Puffer in der Tasse hinzufügen. Wenn es weniger als 15 Objekte / sec konzentrierte L1 (aus Schritt 3.3.3) in der Tasse.
    6. Sobald die geeignete Konzentration des Objekts erreicht ist, das Volumen in der Tasse zu bewerten und 1/4 th dieses Volumens in High Fluorescent GP Kontroll Partikel 4x Lösung hinzufügen.
    7. Stellen Sie die Gating und Sortierparameter. Dazu klicken Sie auf "Gating" auf dem Menü und wählen Sie "TOF vs. ' und "Grün". Klicken Sie auf "Sortieren" auf dem Menü und wählen Sie "TOF vs. 'und' Red '. Gating und Sortier Grafiken wird dann erscheinen , wie in 3A gezeigt.
      Hinweis: Dies wird die Visualisierung der Kontrollpartikel (Emission in Grün und Rot), tote Tiere befleckt von PI und Blasen (Emission in Rot und nicht Grün) und lebende Tiere (keine Emission in weder Grün noch Rot - Kanäle) erlauben (3A ).
    8. Führen Sie das Experiment von ACQ klickenUire.
      HINWEIS: Um kleine Unterschiede zwischen den Larven, analysieren rund 10.000 Objekte zu identifizieren, so etwa 8000 Tiere. Stoppen Sie das Experiment und exportieren Sie die Daten als TXT-Format, indem Sie auf STORE klicken.
  4. Messung der relativen Größe des lebenden Tiere in Synchronized Populations
    1. Öffnen Sie die TXT-Datei mit einer Software in der Lage, um große Datentabellen zu verwalten.
    2. Von den untersuchten Objekten, die die TOF-Werte im Zusammenhang mit Steuer Teilchen extrahieren, die höher durch Emission im grünen Kanal gekennzeichnet sind als 100 willkürlichen Einheiten (hängt dieser Wert auf den in Abschnitt Parameter 3.2.5). Erstellen Sie eine neue Spalte und nennen es "Steuer Partikel". Erstellen Sie eine Spalte enthält alle anderen Objekte mit Ausnahme der Steuer Partikel genannt "Probe". HINWEIS: die Fluoreszenzemission von neuen Teilchen Charge muss überprüft werden, bevor die Akquisitionen zu starten. Dadurch wird die Fluoreszenzschwelle gesetzt, die Identifizierung zu ermöglichenSteuer Partikel über L1s.
    3. Für jeden analysierten Stamms des Teils des Experiments festzustellen, wo die Strömungsrate (aufgrund des Vorhandenseins eines Stopfens von Eiern beispielsweise) verändert wurde. Dazu:
      1. Zeichnen Sie die TOF von 'Steuer Partikel "für jede Probe als Faktor Zeit (3B).
      2. Zeichnen Sie die lineare Trendlinie die Trendlinie Werkzeug und die Gleichung zeigen auf der Karte.
        HINWEIS: Die TOF von Steuer Partikel sollten im Laufe der Zeit (horizontale Linie, 3B) konstant sein. Betrachtet man die Gleichung des linearen Trendlinie auf der Daten y = ax + b gezogen, sicherzustellen , dass die "a" Wert ist niedriger als 10 -4. Alle Messungen innerhalb von Zeitabschnitten einen Bruch in der Ausrichtung der Steuerpartikel Anzeige sollte aus der Analyse entfernt werden.
    4. Entfernen Sie die toten Embryonen und Blasen (Emission von mehr als 15 in den roten Zahlen) sowie kleine Trümmer und große Ei-Stecker (TOF von weniger als 10 und eine hoheer als 70 bezeichnet) von der "Probe" Messung.
    5. Zeichnen Sie die 'Steuer Partikel' Verteilung für jeden analysierten Stamm. Wie in 3C gesehen sollten diese Verteilungen nahezu perfekt überlagern. Dies stellt sicher, dass für verschiedene Stämme erhalten TOF-Messungen verglichen werden können. HINWEIS: Normalisierung der Probenelemente TOF über Kontrollpartikeln verwendet werden können, wenn die Verteilungen der Steuer Teilchen in einer Probe mit dem Overlay nicht von Kontrollproben. Normierte TOF werden wie folgt berechnet:
      1. Normalisieren TOF für Genotyp G = (Probe TOF für G) / (durchschnittliche Kontrolle Teilchen "TOF für G) x (durchschnittliche Kontrolle Teilchen" TOF für wt) , wobei Gew die Kontrollprobe ist.
    6. Plot Larvae TOF Verteilung für jeden Stamm einschließlich Kontrollprobe, in unserem Fall wt Tieren (3D). Messen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) für jede Population ( 5A und B).

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Ergebnisse

Head-, Schwanz- und Kopf / Schwanz-Breite - Verhältnis sind Robust Metrics.

Die Protokolle hier beschrieben wurden während der frühen Verlängerung 7. Pix-1 und pak-1 - Code jeweils für eine Guanin-Austauschfaktor Funktion der Regulatoren und Eff...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt neue Metriken frühen und späten Phasen der embryonalen Dehnung zu charakterisieren.

Im Bereich 1 ist der kritische Schritt die mögliche Anwesenheit von Bakterien auf dem Pad. Die Embryonen werden hermetisch zwischen dem Kissen und dem Deckglas während der Bilderfassung eingeschlossen ist. die Folie Abdichtung ist erforderlich während der Erfassung Desikkation der Tiere zu vermeiden, dass mehr als zwei Stunden dauert. Unseres Wissens nach keiner der Versiegelungen ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada und der Canada Foundation for Innovation unterstützt. Vielen Dank an Dr. Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) für den Stamm let-502(sb118ts). Einige der Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar BioShopAGR001.500
AgaroseBioshopAGA001.500
CaCl2 (Calciumchlorid)Bio Basic Inc.CT1330
CholesterinSigma-aldrichC8667
Reinigungslösung Union Biometrica300-5072-000
Deckgläser aus GlasFisherbrand12-542B
ObjektträgerFisherbrand12-552-3
Hochfluoreszierende KontrollpartikelUnion Biometrica310-5071-001
K2HPO4 (Kaliumphosphat, zweibasisch)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4 (Kaliumphosphat, einbasisch)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4 (Magnesiumsulfat)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4( Natriumphosphat, zweibasisch)Bio Basic Inc.
NaCl (Natriumchlorid)Bio Basic Inc.DB0483
Pebeo Zeichengummi 45  mlpé bé oPDG033000jedem Kunst- und Bastelgeschäft
PeptoneBioShopPEP403.500
HülsenpufferBiometrica300-5070-100
COPAS BiosortUnion Biometrica
SDB0487

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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