Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Testen der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster bei Einzeltierauflösung. Dieser Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform zur Identifizierung von Genen und Schaltkreiskomponenten, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Vor kurzem Eiablage bevorzugt von Drosophila als genetisch manipulierbaren Modell entstand die neuronale Grundlage einfacher Entscheidungsprozesse zu studieren. Bei der Auswahl von Standorten um ihre Eier abzulegen, sind weibliche Fliegen der Lage, die relative Attraktivität ihrer Optionen Ranking und die Auswahl von "größeren von zwei Waren." Allerdings sind die meisten Eiablage bevorzugt Assays sind nicht praktisch, wenn man will, eine systematische genetische Screening-Ansatz zu übernehmen für die Schaltung Basis zu suchen, diese einfache Entscheidungsprozess zugrunde liegen, wie sie sind populationsbasierte und arbeitsaufwendig einzurichten. Um den Durchsatz des Studiums der Eiablage Präferenzen der einzelnen Frauen zu erhöhen, entwickelten wir individuelle Kammern, die jeweils gleichzeitig Assay Eiablage Vorlieben von bis zu dreißig Einzel sowie ein Protokoll fliegt, die jedes Weibchen sorgt für eine hohe Eiablagerate (so dass ihre Präferenz ist leicht erkennbar und überzeugender). Unser Ansatz ist einfach auszuführenund produziert sehr konsistente Ergebnisse. Darüber hinaus können diese Kammern mit verschiedenen Aufsätzen ausgestattet werden, um Video die Eiablage Tiere Aufnahme zu ermöglichen und Licht für die Optogenetik Studien zu liefern. Dieser Artikel enthält die Baupläne für diese Kammern Herstellung und das Verfahren zur Herstellung der Fliegen in diesen Kammern untersucht werden.
Einleitung
Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus, um die neuronalen Grundlagen von Verhaltensweisen zu untersuchen. Die rasante Entwicklung genetischer Werkzeuge zur gezielten Manipulation von Neuronen und das Aufkommen ausgefeilter Verhaltensanalysewerkzeuge haben unsere Fähigkeit, die Schaltkreismechanismen zu entschlüsseln, die den sensomotorischen Transformationsprozessen verschiedener angeborener und erlernter Verhaltensweisen zugrunde liegen1-3, erheblich verbessert.
Die Eiablage von Drosophila ist ein geeignetes Modell, um die neuronalen Grundlagen einfacher Entscheidungsprozesse zu untersuchen. Insbesondere hat sich gezeigt, dass Drosophila-Weibchen die Fähigkeit besitzen, ihre Optionen zu vergleichen und zu ordnen, bevor sie sich "verpflichten", ein Ei auf eine gegebene Option4-8 zu legen. Wenn sie beispielsweise nur ein einfaches (saccharosefreies) Substrat oder nur ein saccharosehaltiges Substrat erhalten, akzeptieren die Weibchen bereitwillig beide Optionen für die Eiablage. Wenn sie jedoch mit beiden Optionen konfrontiert werden, lehnen Weibchen das Saccharosesubstrat in einigen Kontexten robust ab7,9,10. Über die neuronalen Mechanismen, die es Frauen ermöglichen, "das größere von zwei Gütern zu wählen", ist jedoch relativ wenig bekannt. Ein Haupthindernis war das Fehlen einer effizienten Methode, um die Präferenzen der Eiablage zu testen, so dass man ein systematisches genetisches Screening-Verfahren zur Untersuchung dieses Problems verwenden kann.
In diesem Bericht beschreiben wir das von uns entwickelte Protokoll, das es ermöglicht, die Eiablagepräferenzen von Weibchen mit Einzeltierauflösung und mit wesentlich verbessertem Durchsatz und Konsistenz gegenüber früheren Methoden zu testen. Konkret stellen wir die Baupläne für den Bau der von uns entworfenen Kammern zur Verfügung, das Protokoll für die Vorbereitung der Weibchen, damit jedes darauf vorbereitet ist, viele Eier zu legen, und das Protokoll für die Nutzung der Kammern.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Flies Vorbereitung zu test
- Kultur fliegt auf Standard-Melasse / cornmeal Medien bei Inkubator bei 25 ° C und 65% Luftfeuchtigkeit. Achten Sie darauf, nicht die Fläschchen überfüllen. Zum Beispiel setzen 8 Frauen und 6 Männer in einen schmalen Essen Fläschchen.
Hinweis: Die "narrow Essen Fläschchen" verwendet hier einen Innendurchmesser von 2,3 cm. Wir typischerweise etwa 10 ml fly Nahrung in jedem Fläschchen abgefüllt. Die Fliege Essen Rezept wir verwendet wird hier beschrieben: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html. - 2 - 3 Tage nach dem Schlüpfen Weibchen, bereiten Fläschchen mit frischer Hefe - Paste in 1E , wie dargestellt. Machen Frischhefe Paste durch 6 g aktiver Hefe-Mischung mit 10 ml von 0,5% Propionsäure. Verwenden Sie einen Spachtel, um den Hefe-Paste auf die Seitenwand der Lebensmittel Fläschchen anzuwenden. Sammeln Sie 30 - 35 geschlüpften Weibchen zusammen mit 20 bis 25 Männer in die Fläschchen.
- Im Allgemeinen sammeln die Männchen von den gleichen Fläschchen, wo die Weibchen gesammelt werden(So wie die Zeit und Mühe zu sparen). Wenn es jedoch Besorgnis über die Fruchtbarkeit von Männern ist, verwenden WT männlichen statt. Auch Hefe-Paste ist wichtig für die Stimulierung der Eierproduktion ist es daher bereiten täglich frisch.
- Aufrechterhaltung der gesammelten Weibchen / Männchen bei 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit, es sei denn, die Fliegen Temperatur empfindlich sind.
- Nach ca. 4 - 5 Tagen überprüfen Sie die Fläschchen zu sehen, ob Frauen bereit für Eiablage Experimente sind. Sie sind bereit , wenn die Oberfläche des Nahrungsmittel Medium nass von Larven ist aktiv in der Lebensmittel gräbt (siehe Abbildung 1 E - F).
Hinweis: Frauen vorenthalten Regel Eier zu legen, wenn die Nahrungsmitteloberfläche nass wird und kriecht mit Larven. Dieser Schritt stellt sicher , dass Frauen bereit sein würde , viele Eier zu legen , wenn sie Substrate mit der gewünschten Textur auftreten (z. B. ~ 1% Agarose).
2. Kammer Konstruktion, Montage, Test-Setup
- Haben Sie einen Maschinenhalle bauen Acryl Eiablage Kammern (FiAbbildung 1A - D). Die technische Zeichnung der verschiedenen Stücke wurden in Ergänzungs gezeigt . 1 - 3 Bilder mit hoher Auflösung können auch hier bestellt werden (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Kunststoffplatten in die Lade (oben) Stück der Kammer ein , wie in 1C gezeigt. Dies dient als Bodenfläche während des Ladens in einzelne Eiablage Arenen fliegt.
- Anesthetize Weibchen auf einem CO 2 Pad und laden Sie sie einzeln in jedem Eiablage Arena. Lassen Sie ~ 30 min für Fliegen aus dem CO 2 zu erholen und an die neue Umgebung gewöhnt zu werden.
- Bereiten Sie die Agarose-Substrate.
- Der Einfachheit halber halten eine premade Flasche geschmolzen 1% Agarose in einem 55 C-Wasserbad °.
- Fügen Sie die gewünschte Menge an Lager Saccharose-Lösung (2 M) in eine 50 ml konischen Röhrchen und mit Hilfe einer entsprechenden Menge an Agarose gemischt werden. Um zum Beispiel die 150 mM Saccharose Substrat, pla vorzubereitence 750 ul 2 M Saccharose-Lösung in das Röhrchen und füllen Sie dann das Rohr mit Agarose zur 10 ml-Markierung.
- Bereiten Sie die Ebene Substrat auf die gleiche Weise, aber mit destilliertem Wasser anstelle von Saccharose-Lösung.
Anmerkung: Die Endkonzentration an Agarose in diesem Protokoll als 1% etwas weniger ist. Nach unserer Erfahrung ist die genaue Konzentration der Agarose nicht so lange egal, wie es innerhalb von ~ 0,9 geregelt wird - 1,1%, und dass die beiden Substrate sind von der gleichen Agarose-Konzentration.
- Nehmen Sie das Substrat (Boden) Stück der Kammer und Pipetten 1000 ul Agarose Substrat in jeder Wanne , wie in Figur 1D zu sehen.
- Lassen Sie Agarose für ~ 30 min zu verfestigen.
- Nachdem die Agarose-Substrate und Fliegen bereit sind, montieren alle drei Teile des Eiablagekammer und dann die Kunststoffplatten herausnehmen.
- Legen Sie die Kammern in der Fliege Inkubatoren.
Anmerkung: Die Länge des Eiablage Experimenten variieren kann auf expe jerimental Bedürfnisse. Wir laufen in der Regel das Experiment O / N (14 bis 16 h). Auch keine wesentlichen Auswirkungen der zirkadianen Timing auf Eiablage Präferenzen beobachtet. - Anästhesieren Weibchen von CO 2 in die Kammer eingespritzt wird . Zerlegen Sie die Kammer, werfen Sie die betäubten Fliegen in Fliegen Leichenschauhaus (dh., Ein leerer Kaffee kann mit etwas Maisöl gefüllt). Machen Sie Fotos von den Ergebnissen für Recordkeeping (siehe Abbildung 2).
- Zähle die Anzahl der Eier manuell und berechnen Vorzugs Indizes für die Analyse. Berechnen Präferenz Index wie (N a - N b) / (N + a N b) , wobei N a und N b repräsentieren Anzahl der Eier vor Ort gegen Seite b verbunden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die Eiablage Kammern bestehen aus mehreren Teilen zusammengesetzt: ein Substrat (unten) Stück, einen Teiler (Mitte) Stück, eine Lade (oben) Stück, und 2 Schiebetüren (1A - D). Diese Stücke werden verwendet , um unabhängig Setup Fliegen und Substraten vor Eiablage Experimenten. 1F zeigt , wie Fläschchen aussehen sollte , wenn weibliche Fliegen bereit für Eiablage sind. Wenn Fliegen eine Wahl zwischen einem einfachen und einem Substrat Saccharose-haltige S...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Kammern und Protokolle hier beschrieben haben mehrere Verbesserungen gegenüber früheren Eiablage Assays. Erstens erhöhen sie den Durchsatz erheblich Präferenzen der einzelnen Tiere Untersuchung. Jede Kammer kann 30 einzelne Frauen-Assay und es dauert weniger als eine Stunde einzurichten. Zweitens erhöhen sie die Konsistenz der Eiablage Präferenzen gegenüber früheren Methoden. Die Standardisierung der Abmessungen der Arena, Größe der Eiablage Substrate und Abstand zwischen den Substraten macht es leichter, die Ergebn...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken dem Duke Physics Shop, insbesondere Phil Lewis, für die Hilfe beim Bau des Verhaltensapparates und der Anhänge und bei der Erstellung der Zeichnung. Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health unter der Fördernummer R01GM100027 finanziert.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ultrareine Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Saccharose | Sigma | S0389 | |
| Wasserbad | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema Webcam | Microsoft | H5D-00013 | |
| Rote LEDs | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| Eiablagekammern | Speziell angefertigte | ||
| Kamerahalterungen | Speziell angefertigte | ||
| LED-Halterungen | Speziell angefertigte | ||
| Fly-Fläschchen (schmal) | Genesee | 32-116 v. Chr |
Referenzen
- Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr. Biol. 23 (17), 752-763 (2013).
- Yamamoto, N. C., Koganezawa, M. Genes and circuits of courtship behaviour in Drosophila males. Nat. Rev. Neurosci. 14 (10), 681-692 (2013).
- Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly. 6 (1), 35-48 (2012).
- Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (27), 11352-11357 (2009).
- Miller, P. M., Saltz, J. B., Cochrane, V. A., Marcinkowski, C. M., Mobin, R., Turner, T. L. Natural variation in decision-making behavior in Drosophila melanogaster. PLoS One. 6 (1), 16436(2011).
- Schwartz, N. U., Zhong, L., Bellemer, A., Tracey, W. D. Egg-laying decisions in Drosophila are consistent with foraging costs of larval progeny. PloS One. 7 (5), 37910(2012).
- Yang, C. H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Drosophila egg-laying site selection a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Kacsoh, B. Z., Lynch, Z. R., Mortimer, N. T., Schlenke, T. A. Fruit flies medicate offspring after seeing parasites. Science. 339 (6122), 947-950 (2013).
- Wu, C. -L., Fu, T. -F., Chou, Y. -Y., Yeh, S. -R. A Single Pair of Neurons Modulates Egg-Laying Decisions in Drosophila. PloS one. 10 (3), e0121335(2015).
- Yang, C. H., He, R., Stern, U. Behavioral and circuit basis of sucrose rejection by Drosophila females in a simple decision-making task. J. Neurosci. 35 (4), 1396-1410 (2015).
- Gou, B., Liu, Y., Guntur, A. R., Stern, U., Yang, C. H. Mechanosensitive neurons on the internal reproductive tract contribute to egg-laying induced acetic acid attraction in Drosophila. Cell Rep. 9 (2), 522-530 (2014).
- Stern, U., Zhu, E. Y., He, R., Yang, C. H. Long-duration animal tracking in difficult lighting conditions. Sci. Rep. 5, 10432(2015).
- Zhu, E. Y., Guntur, A. R., He, R., Stern, U., Yang, C. H. Egg-laying demand induces aversion of UV light in Drosophila females. Curr. Biol. 24 (23), (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat. Methods. 6, 451-457 (2009).
- Klatpoetke, N. C., et al. Independent Optical Excitation of Distinct Neural Populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
