Method Article

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

DOI:

10.3791/53732

⸱

March 3rd, 2016

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Zentromere" und "Kinetochore" beziehen sich auf die Stelle, an der sich Chromosomen während der Zellteilung mit der Spindel verbinden. Die direkte Visualisierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen während des Zellzyklus ist nach wie vor ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung des Mechanismus bzw. der Mechanismen dieser Proteine. Fortschrittliche bildgebende Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie bieten eine bemerkenswerte Auflösung der Zentromer-Kinetochor-Komponenten und ermöglichen die direkte Beobachtung spezifischer molekularer Komponenten der Zentromere und Kinetochore. Darüber hinaus sind Methoden der indirekten Immunfluoreszenzfärbung (IIF) mit spezifischen Antikörpern entscheidend für diese Beobachtungen. Trotz zahlreicher Berichte über IIF-Protokolle wurden jedoch nur wenige Probleme spezifischer Zentromer-Kinetochor-Proteine ausführlich diskutiert. 1-4 Hier berichten wir über optimierte Protokolle zur Färbung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen unter Verwendung von Paraformaldehyd-Fixierung und IIF-Färbung. Darüber hinaus berichten wir über Protokolle zum Nachweis von Flag-markierten exogenen CENP-A-Proteinen in menschlichen Zellen, die einer Aceton- oder Methanolfixierung unterzogen wurden. Diese Methoden sind nützlich für den Nachweis und die Quantifizierung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine und Flag-markierter CENP-A-Proteine, einschließlich solcher in menschlichen Zellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Zentromere" wurden klassisch definiert als Regionen unterdrückter meiotischen Rekombination in der Genetik und später als primäre Einschnürung der mitotischen Chromosomen erkannt, die während der Mitose eine wesentliche Rolle bei der genauen Chromosomensegregation spielt. "Kinetochore" wurden als die Mehrschichtstrukturen beschrieben, die an der Oberfläche des Zentromeren an Mikrotubuli binden, wie durch Elektronenmikroskopie ergab; "Kinetochore" wurden später als die hochmolekularen Komplex definiert, die am Zentromer von mitotischen Chromosomen lokalisiert. Trotz einer dramatischen Divergenz der Zentromer-DNA-Sequenzen unter den Wirbeltieren, kinetochore Struktur und Zusammensetzung sind hoch konserviert. Eine dynamische Wechselwirkung zwischen Mikrotubuli und dem Spindel kinetochore für treue Segregation der Chromosomen während der Mitose erforderlich ist, und Defekte in Zentromer-kinetochore Funktion führen zu Aneuploidie und damit Krebs.

Das Zentromer in den meisten Eukaryotenhat keine DNA-Sequenz definiert, wird aber von großen Arrays (0,3-5 Mb) repetitiver DNA alphoid bestehend aus 171-bp α-Satelliten-DNA zusammengesetzt ist. Außer in Bäckerhefe wird Zentromer Identität nicht von der DNA - Sequenz erreicht , sondern durch die Anwesenheit eines speziellen Nukleosomen, die die Histon - H3 - Variante CENH3 (Zentromer - Protein A [CENP-A] in Menschen) enthält. 5 CENP-A Nukleosomen lokalisieren zu der Innenplatte von Säugetier Kinetochore 7 und binden sich an das 171-bp - α-Satelliten - DNA. Aktive Romeren erfordern CENP-A-haltigen Nukleosomen die Rekrutierung eines konstitutiven Zentromer-assoziierten Netzwerk (CCAN) und die kinetochore Proteine ​​zu richten, die zusammen die Befestigung der Chromosomen auf die mitotische Spindel und nachfolgenden Zyklus Progression durch den Spindel-Checkpoint zu regulieren.

In Anbetracht der obigen Beweis, CENP-A wurde vorgeschlagen , die epigenetische Markierung der Zentromer zu 8; jedoch ist der Prozess, mit dem CENP-A i inkorporiertnto Zentromer-DNA und die Faktoren für diese Integration verantwortlich sind noch nicht gut charakterisiert. Eine kurze Zentromer-Targeting - Domäne (CATD) in der Histon liegt Region CENP-A falten, und Ersatz des entsprechenden Bereichs von H3 mit dem CATD reicht aus, um direkten H3 an den Zentromer. 9 Mehrere Studien legten nahe , funktionelle Rolle für die post-translationale Modifikation (PTM) von CENP-A - 12-16; jedoch haben die molekularen Mechanismen dieser PTMs von CENP-A in der Einstellung zum Zentromeren noch nicht aufgeklärt. Wir bereits berichtet , dass CUL4A-RBX1-COPS8 E3 - Ligase - Aktivität für CENP-A K124 Ubiquitinierung und Lokalisierung von CENP-A bis Romeren erforderlich ist. 17

Die Entdeckung und Charakterisierung von kinetochore Proteine ​​, um neue Erkenntnisse in Bezug auf die Chromosomensegregation geführt. 18 Mehr als 100 kinetochore Komponenten in Zellen von Wirbeltieren durch verschiedene Ansätze identifiziert worden. 19,20 Ein unterStehen wie Kinetochore montieren und Funktion kommt auch von der Charakterisierung der zellulären Funktionen jedes Zentromer-Kinetochor - Proteinen und Protein-Protein - Netzwerk innerhalb von Zellen. 19 Direkte Visualisierung und fortschrittliche Bildgebungsverfahren in der Fluoreszenzmikroskopie liefern bemerkenswerte Auflösung von Zentromer-Kinetochor Komponenten und ermöglichen direkte Beobachtung der spezifischen molekularen Komponenten der Zentromer und Kinetochore. Darüber hinaus Methoden der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) Färbung spezifische Antikörper verwenden, sind von entscheidender Bedeutung für diese Beobachtungen. Doch trotz zahlreicher Berichte über IIF - Protokolle, einige im Detail Probleme spezifischer Zentromer-Kinetochor Proteine ​​diskutiert. 1-4 So entwickeln und Berichtsmethoden IIF - Färbung und einer quantitativen IIF - Assay spezifisch jedes Zentromer-Kinetochor Protein analysieren ist extrem wichtig. In IIF Färbung sollte man mit dem Färbungsprotokoll gehen Verlust des Proteins von Interesse zu vermeiden oderder Rest der Zelle. Jedoch zerstört Fixierung Antigenstellen gelegentlich und verschiedenen Antikörper-Antigen - Kombinationen arbeiten schlecht mit einem Fixiermittel, aber sehr gut mit einer anderen, 21 und die Wahl des Fixierungs hängt weitgehend von der Protein (e) von Interesse. Aus diesem Grund sind verschiedene Fixiermittel Methoden entscheidend in IIF-Färbung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen.

Hier optimierte Verfahren der indirekten Immunofluoreszenz (IIF) -Färbung und einem Assay Lokalisation von endogenem Zentromer-kinetochore Proteine ​​zu adressieren, einschließlich CENP-A und FLAG-markiertem exogenem CENP-A-Proteine, und die Quantifizierung dieser Proteine ​​in menschlichen Zellen entwickelt wurden. Diese Verfahren können zur Analyse der Zentromer-kinetochore Proteine ​​in anderen Spezies verwendet werden.

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Protocol

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1. Zellkultur und Transfektion

  1. Setzen Sie ein Deckglas (22 mm x 22 mm) in einer 6-Well Polystyrolplatte. Optional Mantel ein Deckglas mit Poly-L-Lysin, 0,1% w / v, in Wasser (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) die Schritte folgenden mitotischen Zellen auf dem Deckglas zu halten unten:
    Hinweis: Optimale Bedingungen müssen für jede Zelllinie und Anwendung bestimmt werden.
    1. Aseptisch Mantel Kulturoberfläche mit Poly-L-Lysin, 0,1% w / v, in Wasser (0,4 ml / Vertiefung einer 6-Well-Polystyrol-Platte). Schaukeln sanft sogar Beschichtung der Kulturoberfläche zu gewährleisten.
    2. Nach 5 min Lösung durch Absaugen entfernen und gründlich Oberfläche gründlich mit steriler Gewebekultur-Wasser.
    3. Trocken mindestens 2 Stunden vor der Zellen und das Medium eingeführt wird.
  2. Seed HeLa - Zellen 17 oder HeLa Tet-Off Zellen 17,22 auf einem Deckglas (22 mm x 22 mm) stecken in einer 6-Well Polystyrolplatte. Überprüfen Sie, dass die Zelldichte 5,4 x 10 5 pro Vertiefung ist. Kulturzellenin High-glucose DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
    Hinweis: Für optimale Ergebnisse bestimmen empirisch die Zelldichte in der Aussaat zu verwenden.
  3. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 18 Stunden.
    Hinweis: Im Fall von HeLa Tet-Off - Zellen, die Transkription des exogenen Gens ist in der Abwesenheit des Induktors (dh Tetracyclin / Doxycyclin) daher Kulturzellen ohne Tetracyclin / Doxycyclin und transfizieren transient mit dem pTRM4 Überexpressionsvektor (Tabelle 2 ), dessen Transkription durch die TRE-Promotor reguliert wird (siehe unten).
  4. Achtzehn Stunden nach dem Aussäen transfizierbaren Zellen wie folgt:
    1. Machen Lösung A durch Mischen von 1,5 ul siRNA Oligo (20 uM geglüht Lager; Tabelle 1) und / oder 2,0 ug Plasmid (Tabelle 2) in 50 ul reduziert Serum - Medium (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) und Inkubation bei RT für 5 min .
      Hinweis: In dieser AnalyseCA-UTR siRNAs (eine Mischung aus 5 'und 3' UTR siRNA; Tabelle 1) wurden in den Protokollen für den Einsatz cotransfiziert 3 und 4 (siehe Diskussion).
    2. Machen Lösung B um 0,75 ul Transfektionsreagenz Mischen I (siehe Liste der Materialien / Geräte) in 50 & mgr; l Serum Medium reduziert, und Inkubation für 5 min bei RT.
      Hinweis: Ein optionaler Schritt ist die Zugabe von 1,0 ul Transfektionsreagenz II (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung).
    3. Mischen Sie die Lösungen A und B zusammen, und Inkubation bei RT für 15 min.
    4. Waschen Sie einmal die kultivierten Zellen mit PBS, und fügen Sie dann 500 & mgr; l reduziert Serummedium zu jeder Vertiefung der 6-Well Polystyrolplatte. Fügen Sie die Mischung der Lösungen A und B (dh RNA und / oder DNA-Lipid - Komplex) direkt an jedem der einzelnen gut.
      Hinweis: Die Endkonzentration beträgt 3,3 ug / ml (Plasmid); 50 nM (siRNA).
    5. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 4,5 Std. Ändern Sie den mittleren bis hohen Glucose DMEM with 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
    6. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 48-72 h nach der Transfektion.
      Hinweis: Für optimale Ergebnisse muss die Inkubationszeit für das Zellwachstum vor der Fixierung empirisch bestimmt werden, und Proteinabbau und / oder Expression muss durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden (siehe Protokoll 6).
    7. Wenn mitotischen Zellanalyse von Interesse ist, fügen Paclitaxel (10 nM) an kultivierten Zellen 24 Stunden vor der Fixierung, oder fügen Sie TN16 (0,5 uM) auf die kultivierten Zellen 2,5 Stunden vor der Fixierung.

2. Zell Fixierung und Immunfluoreszenzanfärbung zu erkennen Endogene Zentromer-Kinetochor Proteine ​​(Paraformaldehyd Fixierung)

  1. Herstellung von Fixiermittel, Puffer und Reagenzien.
    1. Frisch herstellen 50 ml 4% Paraformaldehydlösung in PBS, pH-Wert 7,4.
      1. In 40 ml 1 × PBS in einem Becherglas auf einer Rührplatte in einer belüfteten Haube. Hitze während stirring auf ca. 60 ° C. 2 g Paraformaldehyd Pulver zum erhitzten PBS.
      2. Langsam erhöhen den pH-Wert durch Zugabe von 1 ml 1 N NaOH insgesamt, da das Pulver nicht sofort löst.
        Anmerkung: Die Lösung nach der Zugabe von NaOH löscht.
      3. Sobald Paraformaldehyd gelöst hat, kühlen und filtriert die Lösung.
      4. Den pH-Wert mit 1 N HCl auf pH 7,4, und das Volumen der Lösung mit 1 × PBS auf 50 ml.
        Hinweis: Aliquots der Lösung kann eingefroren oder bei 2-8 ° C so lange wie 1 Woche gelagert werden. Die Lösung sollte bei 4 ° C eiskaltem oder gelagert werden, bis sie verwendet werden soll.
    2. Vorbereitung 50 ml Puffer KB1, die aus 10 mM Tris-HCl besteht, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,5% BSA; und 0,5% Triton X-100.
      Hinweis: BSA sollte frisch zugegeben werden.
      Hinweis: Die Puffer KB Serie basieren auf Puffer KB in früheren Berichten beschrieben 1,2,4.
    3. Vorbereitung 50 ml Puffer KB2, der aus 10 mM Tris-HCl besteht,pH 7,5; 150 mM NaCl; und 0,5% BSA.
      Hinweis: BSA sollte frisch zugegeben werden.
    4. Vorbereitung 1 ml Puffer, enthaltend KB3 DAPI (50 ng / ml).
    5. Herstellung von 100 ml der Befestigungsmittel, das von 1 mg / ml p-Phenylendiamin besteht; 10% PBS und 90% Glycerin.
      1. Der pH-Wert von 1 × PBS auf 9,8 mit 1 N NaOH, p-Phenylendiamin in der Lösung aufzulösen, und dann Glycerin hinzufügen.
      2. Speicher 1 ml Aliquots bei -80 ° C. Vor Licht schützen.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium durch Absaugen bei 48-72 Stunden nach der Transfektion (siehe Protokoll 1) für die Zellfixierung. Rinse Zellen einmal mit PBS. Gelten PBS zu der Seite der Kulturvertiefungen Störung der Oberfläche der Zellen zu vermeiden.
    Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für Zellfixierung empirisch bestimmt werden müssen.
  3. Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei 4 ° C. Spülen Sie die Zellen zweimal mit Puffer KB2 ausreichend Rest 4% Paraformaldehyd zu entfernen.
  4. PermeabiLIZE die Proben in Puffer KB1 für 30 min bei RT. Spülen Sie die Zellen einmal mit Puffer KB2, und fügen Sie Puffer KB2 für 5 min bei RT, um zusätzliche Blockstellen der unspezifischen Bindung.
    Hinweis: Puffer KB1 auch wesentlich zur Blockierung beiträgt.
  5. Entfernen Sie ein Deckglas (22 mm x 22 mm) aus einer 6-Well Polystyrolplatte mit einer Pinzette. Unter Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift (siehe Liste der Materialien / Equipment), eine hellgrüne Quadrat oder Kreis ziehen um jedes Deckglas Probe eine hydrophobe Barriere zu bilden. Sie nicht zu nahe berühren oder mit dem hydrophoben Barriere Stift an die Zellen zu bekommen. Legen Sie das Deckglas in neuen 6-Well Polystyrolplatte.
  6. Verdünnen Sie einen primären Antikörper gegen Zentromer oder kinetochore Protein (Verdünnungsverhältnis von 1: 100 bis 1: 200, siehe auch Liste der Materialien / Equipment) und entweder eine anti-CENP-B-Antikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 400) oder eine anti- Zentromer-Antikörper (ACA) (Verdünnungsverhältnis von 1: 2000) als Zentromer Standortmarkierung in Puffer KB2.
    Hinweis: Für optimale Ergebnisse die endgültige Konzention des primären Antikörpers in dieser Lösung muß empirisch ermittelt werden.
  7. Anwenden eines ausreichenden Menge (ca. 30 & mgr; l) des verdünnten primären Antikörpers mit der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 3 mal mit Puffer KB2.
  8. Unter Verwendung von Puffer KB2, verdünnter einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 100 bis 1: 200) gegen jeden primären Antikörper.
    Anmerkung: Für optimale Ergebnisse sollte die Endkonzentration des sekundären Antikörpers in dieser Lösung empirisch bestimmt werden.
  9. Tragen Sie eine ausreichende Menge (ein Minus von ca. 30 & mgr; l auf dem Deckglas) des verdünnten sekundären Antikörper , der die Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 5-mal mit Puffer KB2 während eines Zeitraums von 30 min (fünf 6 min Wäschen).
    Anmerkung: Für optimale Ergebnisse (dh für einen minimalen Verlust von Zellen), muß die optimale Waschbedingung empirica bestimmt werdenlly.
  10. Anwenden eines ausreichenden Volumen an Puffer, enthaltend KB3 DAPI (50 ng / ml) der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 5 min bei RT. Spülen Sie die Zellen 1-2 mal mit Puffer KB2.
  11. Montieren Sie das Deckglas, das die Zellprobe auf den Mikro Folie enthält.
    1. Geben Sie einen Tropfen des Mediums in der Mitte des Mikroschienenführung.
    2. Entfernen Sie Flüssigkeit aus der Zellprobe und mit den Händen oder einer Zange, positionieren Sie die Probe in der Mitte des Mikrorutsche. Vermeiden Sie Luftblasen.
    3. Überschüssiges Montagemedium mit einem Papiertuch.

3. Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung von C-terminalen FLAG-markierten CENP-A Proteine ​​(Acetone Fixation)

  1. Vorbereitung
    1. Bereiten Sie eiskaltem 75% Aceton.
    2. Frisch herstellen 50 ml PBS (pH 7,4), 0,5% Magermilch und 0,5% BSA enthält.
    3. Frisch herstellen 50 ml PBS (pH 7,4), 0,1% Magermilch und 0,1% BSA enthält.
    4. Vorbereitung 1 ml PBS (pH 7,4), enthaltend DAPI (50-100 ng / ml).
    5. Bereiten Sie 100 ml Eindeckmediums wie in 2.1.5 beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium durch Absaugen bei 48-72 Stunden nach der Transfektion (siehe Protokoll 1) für die Zellfixierung. Rinse Zellen einmal mit PBS. Gelten PBS zu der Seite der Kulturvertiefung zu vermeiden, dass die Oberfläche der Zellen zu stören.
    Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für Zellfixierung empirisch bestimmt werden müssen.
  3. Befestigen Sie die Zellen in eiskaltem 75% Aceton, und Inkubation der Zellen für 10 Minuten bei -20 ° C. Trockene Zellen auf dem Deckglas in einem Abzug für 30-60 min bei RT.
    Hinweis: Für optimale Ergebnisse benötigt, um die Länge der Zeit, für die Fixierung und Zelltrocknung muss empirisch ermittelt werden.
  4. Unter Verwendung der hydrophoben Barriere Stift (siehe Liste der Materialien / Equipment), eine hellgrüne Quadrat oder Kreis ziehen um jedes Deckglas Probe eine hydrophobe Barriere zu bilden. Sie nicht zu nahe berühren oder mit dem hydrophoben Barriere Stift an die Zellen zu bekommen.
  5. Block nonspecPBS, enthaltend 0,5% Magermilch und 0,5% BSA für 5 min bei RT ific Bindungsstellen auf den Zellen durch Zugabe von.
  6. Verwendung von PBS, das 0,1% Magermilch und 0,1% BSA enthält, verdünnt ein Anti-Flag-Antikörper (1: 1.000 Verdünnungsverhältnis) und entweder ein Anti-CENP-B-Antikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 200) oder ACA (1: 2.000 Verdünnungsverhältnis ) als Zentromer Standortmarkierung.
    Anmerkung: Für optimale Ergebnisse sollte die Endkonzentration des primären Antikörpers in dieser Lösung empirisch bestimmt werden.
  7. Anwenden eines ausreichenden Menge (ca. 30 & mgr; l) des verdünnten primären Antikörpers mit der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 5-mal mit dem Blockierungspuffer während eines Zeitraums von 30 min.
    Anmerkung: Die Zellen können mit PBS gespült werden. Für optimale Ergebnisse (dh zu vermeiden Verlust von Zellen), muß die optimalen Waschbedingungen empirisch ermittelt werden.
  8. Verdünnte einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 100 bis 1: 200) gegendie jeweils primären Antikörper in PBS, das 0,1% Magermilch und 0,1% BSA enthält.
    Anmerkung: Für optimale Ergebnisse sollte die Endkonzentration des sekundären Antikörpers in dieser Lösung empirisch bestimmt werden.
  9. Anwenden eines ausreichenden Menge (ca. 30 & mgr; l) des verdünnten sekundären Antikörpers der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 2 mal mit PBS 0,1% Magermilch und 0,1% BSA enthält.
    Hinweis: PBS allein kann auch verwendet werden, um die Zellen zu waschen.
  10. Anwenden eines ausreichenden Volumen PBS, enthaltend DAPI (50-100 ng / ml) der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 5 min bei RT. Spülen Sie die Zellen 1-2 mal mit PBS.
  11. Montieren Sie das Deckglas der Zellprobe auf den Mikroschieber enthält, wie in 2.11 beschrieben.

4. Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung von N-terminalen Flag-markiertes CENP-A Proteine ​​(Methanol Fixation)

  1. Vorbereitung
    1. Bereiten Sie eiskaltem Methanol.
    2. Bereiten TBS (pH 7,4), enthaltend 4% Ziegenserum.
    3. Vorbereitung 1 ml TBS (pH 7,4), enthaltend DAPI (50-100 ng / ml).
    4. Bereiten Sie 100 ml Eindeckmediums wie in 2.1.5 beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Kulturmedium durch Absaugen bei 48-72 Stunden nach der Transfektion (siehe Protokoll 1) für die Zellfixierung. Rinse Zellen einmal mit TBS. Gelten TBS zu der Seite der Kulturvertiefungen Störung der Oberfläche von Zellen zu vermeiden.
    Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für Zellfixierung empirisch bestimmt werden müssen.
  3. Befestigen Sie die Zellen in eiskaltem Methanol, und Inkubation der Zellen für 6 min bei -20 ° C. Spülen Sie die Zellen zweimal mit TBS ausreichend restliches Methanol zu entfernen.
  4. Unter Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift (siehe Liste der Materialien / Equipment), eine hellgrüne Quadrat oder Kreis zu zeichnen eine hydrophobe Barriere um jedes Deckglas Probe zu schaffen. Sie nicht zu nahe berühren oder mit dem hydrophoben Barriere Stift an die Zellen zu bekommen.
  5. Blockieren unspezifischer Bindungsstellen auf der cells durch Zugabe von TBS, die 4% Ziegenserum. Inkubieren für 10 min bei RT.
  6. Verdünnte eine Anti-Flag-Antikörper (1: 1000 Verdünnung) und entweder ein Anti-CENP-B-Antikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 200) oder ACA (1: 2.000 Verdünnungsverhältnis) als Zentromer Positionsmarkierung in TBS, enthaltend 4% Ziegenserum .
    Anmerkung: Für optimale Ergebnisse sollte die Endkonzentration des primären Antikörpers in dieser Lösung empirisch bestimmt werden.
  7. Anwenden eines ausreichenden Menge (ca. 30 & mgr; l) des verdünnten primären Antikörpers mit der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 5-mal mit dem Blockierungspuffer während eines Zeitraums von 30 min. Für optimale Ergebnisse (dh der minimale Verlust von Zellen), muß die optimale Waschbedingungen empirisch ermittelt werden.
  8. Verdünnte einen Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 100 bis 1: 200) gegen jeden primären Antikörper in TBS, enthaltend 4% Ziegenserum.
    Hinweis: Für optimale Ergebnisse die final Konzentration des sekundären Antikörpers in dieser Lösung muß empirisch ermittelt werden.
  9. Anwenden eines ausreichenden Menge (ca. 30 & mgr; l) des verdünnten sekundären Antikörpers der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 1 h bei 37 ° C. Spülen Sie die Zellen 3-mal mit dem Blockierungspuffer.
  10. Tragen Sie eine ausreichende Menge an TBS mit DAPI (50-100 ng / ml) der Zellprobe einzutauchen. Inkubieren der Zellprobe für 5 min bei RT. Spülen Sie die Zellen 1-2 mal mit TBS.
  11. Montieren Sie das Deckglas, das die Zellprobe auf den Mikro Folie enthält, wie in 2.11 beschrieben.

5. Immunofluoreszenz Bildbeobachtung, Akquisition, Quantifizierung und Analyse

  1. Beobachten der Zellprobe durch ein motorisiertes Fluoreszenzmikroskop, ausgerüstet mit einem 63X und 100X-Ölimmersionsobjektiv, eine externe kompakte Lichtquelle und einer digitalen CCD-Kamera.
  2. Nehmen Sie die Bildaufnahme und -verarbeitung, einschließlich Entfaltungs, mit Hilfe von SoftwareA oder Softwares B1 und B2 (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung). Bitte sehen Ergänzenden Code-Dateien (5.2.1) für alle Befehle in Software A. Für alle Befehle in Softwares B1 und B2 verwendet, siehe (5.2.2) in Ergänzenden Code-Dateien.
  3. Verwenden eines zuvor 23-25 ​​beschriebenen Methode Signale Zentromer-kinetochore Proteine ​​zu quantifizieren (zB verbleibenden Signale von CENP-A am Zentromer) mit den folgenden geringfügigen Änderungen:
    1. Wählen Sie Bereich der Zentromer-Kinetochor Proteine ​​und die der Hintergrund wie folgt:
      1. Mitotischen Zelle: (Zentromer-Kinetochor Region) Wählen Sie einen Bereich überlappend mit Chromosomen mit DAPI gefärbt; (Hintergrundbereich) und die Fläche außerhalb Chromosomen , aber innerhalb der identischen einzelnen Zelle (dh cytosolische Region).
      2. Interphase Zelle: (Zentromer-Kinetochor Region) Wählen Sie einen Bereich überlappend mit Chromatin mit DAPI gefärbt; (Hintergrundbereich) und die Fläche außerhalb Chromatin, aber innerhalb der identischen Einzelzelle ( dh Cytosol - Region).
        Hinweis: Siehe auch Ergänzenden Code-Dateien (5.2.1.4.3) oder (5.2.2.6.4) für Bereichsauswahl mit Software A oder Software B2 sind.
    2. Quantifizieren den Prozentsatz der verbleibenden Signale an den Zentromeren unter Verwendung Software A oder B. Für diese Aufgabe verwenden Sie die folgende Formel:
      Verbleibende Signale von Zentromer-Kinetochor Protein am Zentromer-Kinetochor
      figure-protocol-1
      wobei s die Signalhelligkeit des ausgewählten Bereichs ist, die von ACA oder CENP-B - Färbung bestätigt wird; b ist das Hintergrundsignal Helligkeit; r Probe die Referenz ACA oder CENP-B - Signale für siRNA (s) behandelten Zellen; und r - Abfrage ist die Referenz ACA oder CENP-B - Signale für Luc siRNA-transfizierten Zellen.
      Hinweis: In dieser Analyse CENP-B-Signale wurden als Referenzsignale für CUL4A verwendet und RBX1 wie in früheren Berichten beschrieben.
    3. Verwenden Sie eine Excel-Datei für diese Berechnung nach dem Kopieren und Einfügen der Rohdaten aus der Signalquantifizierungssoftware oben beschrieben. Siehe auch Ergänzenden Code-Dateien: (5.2.1.4) und (5.2.2.6) für weitere Einzelheiten. Ein Beispiel der Berechnung ist in Tabelle 3 gezeigt.
  4. Analysieren Sie mindestens 20 Zellen Variation in Färbung und Bildaufnahme für jede Messebene zu beseitigen. verwenden Optional "gemittelte Wert" der verbleibenden Zentromer-Kinetochor Signale für jede Zelle analysiert diese Werte unter den verschiedenen Zentromer-Kinetochor Proteine ​​zu vergleichen.

6. Western Blot-Analyse von Gesamtprotein

  1. Resuspendieren der Zellen in denaturierenden Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40, 0,5% Desoxycholat, 0,5% SDS, 1 mM EDTA, und vollständig EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktail), 26 unterliegt die Suspension einer Ultraschallbehandlung und Gefrier-Auftau - Verfahren, und messenProtein-Konzentrationen wie folgt:
    1. Für die Beschallung Verfahren werden 50 ul Puffer A zu den aus zwei Vertiefungen einer 6-Well-Polystyrol-Platte bei 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt Zellen (siehe Protokoll 1). Betreiben Sie ein Beschallungsgerät mit Disruptor Horn und microtip (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) für insgesamt 15 Sekunden intermittierenden Pulsdauer (Tastverhältnis 50%) pro Probe.
    2. Für Frost-Tau-Prozess, Gefrierzellen mit flüssigem Stickstoff und Auftauen Zellen bei RT.
    3. Messen Proteinkonzentrationen unter Verwendung eines kommerziellen Protein-Assay-Reagenz I oder II (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung).
      Anmerkung: Die Lysate werden entweder mit I-Reagenz mit einem Verhältnis von 1:10 bei der Messung der Proteinkonzentrationen verdünnt oder II. Bei dieser Verdünnung zeigt die SDS in Puffer A wenig oder gar keine Störungen bei dieser Messung.
  2. Mischen Sie das Lysat enthält 20 bis 30 & mgr; g Gesamtprotein mit 2 × oder 4 × SDS-PAGE - Ladepuffer. 27 Boil die Proben5 min und laden sie dann auf einem 12,0% -15,0% SDS-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese denaturieren.
  3. Übertragen die aufgetrennten Proteine ​​durch SDS-PAGE auf eine PVDF - Membran durch eine Western - Blotting - Verfahren unter Verwendung zuvor beschrieben. 17,24,27-31
    1. Blockieren die unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran mit 5% fettfreier Milch in PBS 1 ×, und dann Inkubieren der Membran mit Lösungen von verdünnten Primärantikörper für 1 h bei RT. Siehe Liste der Materialien / Ausrüstung für detaillierte Informationen (zB Verdünnungsverhältnis) eines jeden primären Antikörper.
    2. Nach dem Waschen der Membran 3-4 mal (jeweils 3 bis 5 min Inkubation mit Schütteln) mit PBS-T-Puffer (1 × PBS und 0,1% Tween-20), Inkubieren der Membran in einem Gemisch von im nahen Infrarot (IR) Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern (Verdünnungsverhältnis von 1: 20.000), DyLight-konjugiertem Sekundärantikörper (Verdünnungsverhältnis von 1: 20.000) und / oder Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt in PBS-T; dilutiauf Verhältnis von 1: 10.000) 1 h bei RT. Siehe Liste der Materialien / Ausrüstung für detaillierte Informationen (zB Verdünnungsverhältnis) jeder sekundären Antikörper.
  4. Waschen Sie die Membran 3 mal, und dann scannen die Membran, die die Proteine ​​mit dem Infrarot-Imaging-System und / oder die Chemilumineszenz-Imager für Immunoblot-Detektion (siehe Liste der Materialien / Geräte) zu analysieren.
    1. Für die Infrarot-Imaging-System finden Sie unter (6.4.1) in Ergänzenden Code-Dateien.
    2. Für die Chemilumineszenz-Imager finden Sie unter (6.4.2) in Ergänzenden Code-Dateien. Verwenden Sie ein ultra-sensitive verstärkten chemolumineszenten (ECL) Substrat (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) für dieses System.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunfluoreszenz - Analyse von endogenen CENP-A unterstützt die Hypothese , dass CUL4A-E3 - Ligase für die Lokalisierung von CENP-A bis Romeren erforderlich ist
Unsere jüngsten Studien zeigten , dass CUL4A-RBX1-COPS8 E3 - Ligase - Aktivität für die Ubiquitinierung von Lysin 124 (K124) auf CENP-A und Lokalisierung von CENP-A bis Romeren 17 zunächst erforderlich ist. Die Interphase-Zentrome...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahren haben viele Studien unterschiedliche quantitative Mikroskopie - Assays für fixierte Zellen entwickelt. 42 Die Fortschritte in der Biologie Zentromer-Kinetochor erfordert oft ein Verständnis für die Zentromer-spezifischen oder kinetochore spezifische Funktion von Proteinen , von denen subzellulärer räumlich-zeitliche Regulation die wechselnden Funktionen widerspiegelt diese Proteine ​​während des Zellzyklus. Daher entwickelten wir hier Methoden der IIF-Färbung und einer quantitativen IIF-...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses GM68418 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668Transfektionsreagenz I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778Transfektionsreagenz II
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Reduziertes Serummedium, warm in 37 μg; C Wasserbad vor dem Gebrauch
DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM mit hohem Glukosegehalt, warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, Ursprung in den USALife Technologies/Gibco10082FBS (fötales Rinderserum)
Poly-L-Lysin SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser
UltraPure DistilledWater Life Technologies/Invitrogen/Gibco10977Steriles Wasser in Gewebekulturqualität 
Micro Cover Glas (22 mm x 22 mm)  Surgipath105Deckglas (22 mm x 22 mm)
6-Well-Zellkultur-ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-Well-Polystyrolplatte
Penicillin, Streptomycin; FlüssigkeitFisher/Gibco15-140Penicillin-Streptomycin
PAP PENBinding SiteAD100.1Hydrophober Barrierestift (für eine wasserabweisende Barriere bei der Immunfluoreszenzfärbung)
Paclitaxel (Taxol)SIGMA-SLDRICHT7402Taxol für die mitotische Zellanalyse
TN-16, Mikrotubuli-Inhibitor (TN16)Enzo Life SciencesBML-T120TN16 für die mitotische Zellanalyse
BSA (Rinderserumalbumin)SIGMA-SLDRICHA7906Blockierungsreagenz
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787Reinigungsmittel für die Permeabilisierung
ParaformaldehydSIGMA-SLDRICHP6148Fixiermittel
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Für die nukleare Färbung
von p-PhenylendiaminSIGMA-SLDRICHP6001Für Einbettmedium
VWR Micro Slides, mattiertVWR International48312-013Mikro-Objektträger 
Anti-CENP-A-AntikörperStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CENP-B-AntikörperNovus BiologicalsH00001059-B01PMonoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung)
Anti-CENP-B-Antikörperabcamab25734Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung)
Anti-Zentromer-Antikörper (ACA)Fitzgerald Industries International, Inc.90C-CS1058Antiserum für humane Zentromere; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (IIF)
Anti-CENP-H-AntikörperBethyl LaboratoriesBL1112 (A400-007A)Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF)
Anti-CENP-H-AntikörperBD612142monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF)
Anti-CENP-I-AntikörperN/A, Dr. Katusmi KitagawaN/A, Dr. Katusmi KitagawaPolyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)
Anti-KNL1-AntikörperNovus BiologicalsNBP1-89223Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 AntikörperNovus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268Maus monoklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)
Anti-Hec1 AntikörperGeneTexGTX110735Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF)
Anti-Ska1-Antikörperabcamab46826Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF)
Anti-Flag-AntikörperSIGMA-ALDRICHF3165Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-Flag-AntikörperSIGMA-ALDRICHF7425Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)
Anti-CUL4A AntikörperN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriN/A, Dr. Pradip RaychaudhuriKaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999)
Anti-RBX1-AntikörperCell Signaling4397Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (WB)
Anti-GAPDH-AntikörperChemiconMAB374monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:5000 (WB)
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus-IgGLife Technologies/InvitrogenA11001Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG LifeTechnologies/InvitrogenA11005Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG LifeTechnologies/InvitrogenA11008Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgGLife Technologies/InvitrogenA11012Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Fettfreies Milchpulver (zugelassener Ersatz für Nelkenpulver)Fisher ScientificNC9255871 (Nachbestellung Nr. 190915; Los# 90629)Magermilch
Leica DM IRE2 motorisiertes Fluoreszenzmikroskop Leicamotorisiertes Fluoreszenzmikroskop 
HCX PL APO 63x Öl-TauchobjektivLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Öl-Tauchobjektiv
HCX PL APO 100x Öl-TauchobjektivLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Öl-Tauchobjektiv
Leica EL6000 KompaktlichtquelleLeicaExterne Kompaktlichtquelle für Fluoreszenzanregung
ORCA-R2 Digitale CCD-KameraHamamatsuC10600-10Bdigitale CCD-Kamera
Openlab Version 5.5.2 Software für die wissenschaftliche Bildgebung Perkin Elmer/ImprovisionFür die Beobachtung, Erfassung, Quantifizierung und Analyse von Bildern
Velocity Version 6.1.1 3D-Bildanalysesoftware Perkin Elmer/ImprovisionFür die Bildbetrachtung, -erfassung, -quantifizierung und -analyse
Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-CocktailRoche11873580001/11836170001Proteasehemmer-Cocktailtabletten
PlusOne 2-D Quant KitAmersham Biosciences80-6483-56Kommerzielles Proteinassay-Reagenz I zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 2 % SDS)
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Kommerzielles Protein-Assay-Reagenz II zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 0,1 % SDS)
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010PVDF-Membran zum Transfer von
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR Biosciences926-32210IR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR Biosciences926-32221IR Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)
Ziegen-Anti-Maus-IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)
Ziegen-Anti-Kaninchen-DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF)
Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRPSanta CruzSC-2005HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper Antikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF)
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRPSanta CruzSC-2004HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF)
Openlab Version 5.5.2. Wissenschaftliche Bildgebungssoftware Improvision/PerkinElmerSoftware A
Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Erfassung)PerkinElmerSoftware B1
Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Quantifizierung)PerkinElmerSoftware B2
Branson SONIFIER 450Ultraschallgerät
Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Step, Solid, Gewinde 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33995-325Disruptorhorn für die Beschallung
Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.  33996-185Mikrospitze für die Beschallung
Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem LI-COR BiosciencesInfrarot-Bildgebungssystem für den Nachweis von Immunoblots
Image Studio Analysis Software Version 4.0 LI-COR BiosciencesSoftware C
Molekularer Imager Versadoc MP4000 System Bio-RadChemilumineszenz-Imager für den Immunoblot-Nachweis
Menge Eins 1-D-Analysesoftware Bio-RadSoftware D
SuperSignal West Femto Substrat mit maximaler EmpfindlichkeitThermo34095Hochempfindliches Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL)

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