Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).
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Methodenartikel
Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine kinetochore
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
"Zentromere" und "Kinetochore" beziehen sich auf die Stelle, an der sich Chromosomen während der Zellteilung mit der Spindel verbinden. Die direkte Visualisierung von Zentromer-Kinetochor-Proteinen während des Zellzyklus ist nach wie vor ein grundlegendes Werkzeug zur Untersuchung des Mechanismus bzw. der Mechanismen dieser Proteine. Fortschrittliche bildgebende Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie bieten eine bemerkenswerte Auflösung der Zentromer-Kinetochor-Komponenten und ermöglichen die direkte Beobachtung spezifischer molekularer Komponenten der Zentromere und Kinetochore. Darüber hinaus sind Methoden der indirekten Immunfluoreszenzfärbung (IIF) mit spezifischen Antikörpern entscheidend für diese Beobachtungen. Trotz zahlreicher Berichte über IIF-Protokolle wurden jedoch nur wenige Probleme spezifischer Zentromer-Kinetochor-Proteine ausführlich diskutiert. 1-4 Hier berichten wir über optimierte Protokolle zur Färbung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen unter Verwendung von Paraformaldehyd-Fixierung und IIF-Färbung. Darüber hinaus berichten wir über Protokolle zum Nachweis von Flag-markierten exogenen CENP-A-Proteinen in menschlichen Zellen, die einer Aceton- oder Methanolfixierung unterzogen wurden. Diese Methoden sind nützlich für den Nachweis und die Quantifizierung endogener Zentromer-Kinetochor-Proteine und Flag-markierter CENP-A-Proteine, einschließlich solcher in menschlichen Zellen.
Einleitung
"Zentromere" wurden klassisch definiert als Regionen unterdrückter meiotischen Rekombination in der Genetik und später als primäre Einschnürung der mitotischen Chromosomen erkannt, die während der Mitose eine wesentliche Rolle bei der genauen Chromosomensegregation spielt. "Kinetochore" wurden als die Mehrschichtstrukturen beschrieben, die an der Oberfläche des Zentromeren an Mikrotubuli binden, wie durch Elektronenmikroskopie ergab; "Kinetochore" wurden später als die hochmolekularen Komplex definiert, die am Zentromer von mitotischen Chromosomen lokalisiert. Trotz einer dramatischen Divergenz der Zentromer-DNA-Sequenzen unter den Wirbeltieren, kinetochore Struktur ....
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Protokoll
1. Zellkultur und Transfektion
- Setzen Sie ein Deckglas (22 mm x 22 mm) in einer 6-Well Polystyrolplatte. Optional Mantel ein Deckglas mit Poly-L-Lysin, 0,1% w / v, in Wasser (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) die Schritte folgenden mitotischen Zellen auf dem Deckglas zu halten unten:
Hinweis: Optimale Bedingungen müssen für jede Zelllinie und Anwendung bestimmt werden.- Aseptisch Mantel Kulturoberfläche mit Poly-L-Lysin, 0,1% w / v, in Wasser (0,4 ml / Vertiefung einer 6-Well-Polystyrol-Platte). Schaukeln sanft sogar Beschichtung der Kulturoberfläche zu gewährleisten.
- Nach 5 min Lösung durch Absaugen entfernen und gründlich....
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Ergebnisse
Immunfluoreszenz - Analyse von endogenen CENP-A unterstützt die Hypothese , dass CUL4A-E3 - Ligase für die Lokalisierung von CENP-A bis Romeren erforderlich ist
Unsere jüngsten Studien zeigten , dass CUL4A-RBX1-COPS8 E3 - Ligase - Aktivität für die Ubiquitinierung von Lysin 124 (K124) auf CENP-A und Lokalisierung von CENP-A bis Romeren 17 zunächst erforderlich ist. Die Interphase-Zentro.......
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Diskussion
In den letzten Jahren haben viele Studien unterschiedliche quantitative Mikroskopie - Assays für fixierte Zellen entwickelt. 42 Die Fortschritte in der Biologie Zentromer-Kinetochor erfordert oft ein Verständnis für die Zentromer-spezifischen oder kinetochore spezifische Funktion von Proteinen , von denen subzellulärer räumlich-zeitliche Regulation die wechselnden Funktionen widerspiegelt diese Proteine während des Zellzyklus. Daher entwickelten wir hier Methoden der IIF-Färbung und einer quantitativen IIF-.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses GM68418 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | Transfektionsreagenz I |
| Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | Transfektionsreagenz II |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduziertes Serummedium, warm in 37 μg; C Wasserbad vor dem Gebrauch |
| DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | DMEM mit hohem Glukosegehalt, warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch |
| Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, Ursprung in den USA | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fötales Rinderserum) |
| Poly-L-Lysin SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser |
| UltraPure Distilled | Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Steriles Wasser in Gewebekulturqualität |
| Micro Cover Glas (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Deckglas (22 mm x 22 mm) |
| 6-Well-Zellkultur-Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-Well-Polystyrolplatte |
| Penicillin, Streptomycin; Flüssigkeit | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-Streptomycin |
| PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophober Barrierestift (für eine wasserabweisende Barriere bei der Immunfluoreszenzfärbung) |
| Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol für die mitotische Zellanalyse |
| TN-16, Mikrotubuli-Inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 für die mitotische Zellanalyse |
| BSA (Rinderserumalbumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blockierungsreagenz |
| Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Reinigungsmittel für die Permeabilisierung |
| Paraformaldehyd | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixiermittel |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | Für die nukleare Färbung |
| von p-Phenylendiamin | SIGMA-SLDRICH | P6001 | Für Einbettmedium |
| VWR Micro Slides, mattiert | VWR International | 48312-013 | Mikro-Objektträger |
| Anti-CENP-A-Antikörper | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CENP-B-Antikörper | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung) |
| Anti-CENP-B-Antikörper | abcam | ab25734 | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF, Methanol/Aceton-Fixierung)-1:400 (IIF, Paraformaldehyd-Fixierung) |
| Anti-Zentromer-Antikörper (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Antiserum für humane Zentromere; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (IIF) |
| Anti-CENP-H-Antikörper | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF) |
| Anti-CENP-H-Antikörper | BD | 612142 | monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:200 (IIF) |
| Anti-CENP-I-Antikörper | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
| Anti-KNL1-Antikörper | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF) |
| Anti-Hec1 Antikörper | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Maus monoklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF) |
| Anti-Hec1 Antikörper | GeneTex | GTX110735 | Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:100 (IIF) |
| Anti-Ska1-Antikörper | abcam | ab46826 | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:100 (IIF) |
| Anti-Flag-Antikörper | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-Flag-Antikörper | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CUL4A Antikörper | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Kaninchen polyklonaler Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
| Anti-RBX1-Antikörper | Cell Signaling | 4397 | Polyklonaler Kaninchen-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:2000 (WB) |
| Anti-GAPDH-Antikörper | Chemicon | MAB374 | monoklonaler Maus-Antikörper; Verdünnungsverhältnis von 1:5000 (WB) |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus-IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG Life | Technologies/Invitrogen | A11005 | Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life | Technologies/Invitrogen | A11008 | Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper) |
| Fettfreies Milchpulver (zugelassener Ersatz für Nelkenpulver) | Fisher Scientific | NC9255871 (Nachbestellung Nr. 190915; Los# 90629) | Magermilch |
| Leica DM IRE2 motorisiertes Fluoreszenzmikroskop | Leica | motorisiertes Fluoreszenzmikroskop | |
| HCX PL APO 63x Öl-Tauchobjektiv | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X Öl-Tauchobjektiv |
| HCX PL APO 100x Öl-Tauchobjektiv | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Öl-Tauchobjektiv |
| Leica EL6000 Kompaktlichtquelle | Leica | Externe Kompaktlichtquelle für Fluoreszenzanregung | |
| ORCA-R2 Digitale CCD-Kamera | Hamamatsu | C10600-10B | digitale CCD-Kamera |
| Openlab Version 5.5.2 Software für die wissenschaftliche Bildgebung | Perkin Elmer/Improvision | Für die Beobachtung, Erfassung, Quantifizierung und Analyse von Bildern | |
| Velocity Version 6.1.1 3D-Bildanalysesoftware | Perkin Elmer/Improvision | Für die Bildbetrachtung, -erfassung, -quantifizierung und -analyse | |
| Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Proteasehemmer-Cocktailtabletten |
| PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Kommerzielles Proteinassay-Reagenz I zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 2 % SDS) |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Kommerzielles Protein-Assay-Reagenz II zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 0,1 % SDS) |
| Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF-Membran zum Transfer von |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF) |
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF) |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF) |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:20000 (IIF) |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper Antikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF) |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-konjugierter SekundärantikörperDyLight-konjugierter SekundärantikörperIR-Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper); Verdünnungsverhältnis von 1:10000 (IIF) |
| Openlab Version 5.5.2. Wissenschaftliche Bildgebungssoftware | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
| Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Erfassung) | PerkinElmer | Software B1 | |
| Volocity Version 6.3 3D-Bildanalyse-Software (Volocity-Quantifizierung) | PerkinElmer | Software B2 | |
| Branson SONIFIER 450 | Ultraschallgerät | ||
| Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Step, Solid, Gewinde 9,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptorhorn für die Beschallung |
| Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Tapered 6,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Mikrospitze für die Beschallung |
| Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem | LI-COR Biosciences | Infrarot-Bildgebungssystem für den Nachweis von Immunoblots | |
| Image Studio Analysis Software Version 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
| Molekularer Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemilumineszenz-Imager für den Immunoblot-Nachweis | |
| Menge Eins 1-D-Analysesoftware | Bio-Rad | Software D | |
| SuperSignal West Femto Substrat mit maximaler Empfindlichkeit | Thermo | 34095 | Hochempfindliches Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL) |
Referenzen
- DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
- Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
