Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Zusammenfassung

Wir haben ein Verfahren zur Isolierung, phänotypische Charakterisierung und funktionelle Analyse von Immunzellen aus murinen Gingiva etabliert.

Zusammenfassung

Immunzellnetzwerke in Geweben spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der lokalen Immunität und der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase, dennoch ist wenig über die ansässigen Immunzellpopulationen in der Mundschleimhaut und Gingiva bekannt. Wir haben eine Technik für die Isolierung und Untersuchung von Immunzellen aus murinem Zahnfleischgewebe etabliert, einem Bereich ständiger mikrobieller Exposition und einer anfälligen Stelle für eine häufige entzündliche Erkrankung, die Parodontitis. Unser Protokoll ermöglicht eine detaillierte phänotypische Charakterisierung der Immunzellpopulationen, die in der Gingiva leben, auch im stationären Zustand. Unser Verfahren liefert auch genügend Zellen mit hoher Lebensfähigkeit für den Einsatz in funktionellen Studien, wie z. B. der Beurteilung der Zytokinsekretion ex vivo. Diese Kombination aus phänotypischer und funktioneller Charakterisierung des gingivalen Immunzellnetzwerks soll dazu beitragen, die Mechanismen der oralen Immunität und der parodontalen Homöostase zu untersuchen, aber auch unser Verständnis der Mechanismen der lokalen Immunpathologie zu verbessern.

Einleitung

Zahnfleischgewebe umgeben den Menschen und der Maus Gebiss und werden ständig auf die komplexe Biofilm des Zahnes ¹ ausgesetzt. Die Immunzellennetz der Zahnfleischschutz Überwachung ist entscheidend für Gewebeintegrität zu gewährleisten, mit den lokalen kommensale Bakterien gewährleisten Homöostase und, zur gleichen Zeit, ^zwei wirksame Immunität gegen pathogene Herausforderung bietet. Um das zu erreichen Homöostase wird das Immunsystem sorgfältig auf die Zahnfleischumgebung zugeschnitten eine hoch spezialisierte Immunzellen Netzwerk zu schaffen, noch so kleine Detail wird von den Zahnfleischimmunzellpopulationen bekannt und ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebe Immunität ^2.

Wenn Immunhomöostase auf dem Zahnfleisch gestört ist, entweder durch eine erhöhte Anfälligkeit Host und / oder das Vorhandensein von dysbiotischen mikrobiellen Gemeinschaften, eine entzündliche Erkrankung entsteht Parodontitis ^{3 4.} Parodontitis ist eine weitverbreitete entzündliche Erkrankung, was zu einem Verlust des Zahnes supporting Strukturen. In seiner schweren Formen wird in ca. 10% der Bevölkerung im allgemeinen ^{5 ersichtlich.} Die Schlüsselfaktoren in Parodontitis Anfälligkeit und Progression beteiligt Sezieren hat sich als schwierig erwiesen, ^6. Allerdings Tiermodellen haben im Verständnis der Mechanismen der Parodontitis Initiierung und Progression ⁷ äußerst nützlich. Die Modelle können die wichtigsten Zellpopulationen und molekulare Mechanismen zu definieren, verwendet werden, die Immunhomöostase und Antrieb sind entscheidend Entwicklung einer Parodontitis zu halten. Eine solche Erkenntnis wird unser Verständnis von Zahnfleisch-spezifische Steuerung von Immunhomöostase und weiterhin unser gegenwärtiges Verständnis der Krankheitsentstehung zu transformieren.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben gefolgt erforderlichen Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee, NIDCR / NIH genehmigt.

1. Bereiten Sie im Voraus

1. Bereiten Sie die komplette Medien: RPMI mit 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FBS.
2. Bereiten DNase Mittel: 50 ml RPMI-Medium mit 7,5 ug DNase ergänzt (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
3. Bereiten Collagenase-DNase Medien: 5 ml DNase Medium plus 3,2 mg / ml Collagenase Typ IV (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
4. Pre-kühlen FACS-Puffer: 0,5% FBS in PBS verdünnt.
5. Pre-kühlen Zentrifuge bis 4 ° C.
6. Warm Schüttelinkubator bis 37 ° C.

2. Isolierung, Dissection und Zellisolierung von Zahnfleischblöcke

1. Euthanize Mäuse von ihnen auszusetzen _{2 in} einer entsprechenden Kammer zu CO, nach ARAC Richtlinien.
2. Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle, das Herz und die inneren Organe freizulegen. Zu perfundieren, stellen einen Einschnitt in die untere Hohlvene und perfundieren 3 ml PBS über dem linken Ventrikel unter Verwendung einer 3 ml-Spritze mit einer 27 G Nadel.
3. Immobilisieren den Körper und Kopf der Maus auf einen Block mit Magen nach oben zeigt.
4. Schneiden Sie jede Kommissur der Lippe in Richtung des Halses mit einer Schere, trennt die Haut, die Unterkiefer und Hals-Region umfasst, Freilegen der darunter liegenden Gewebe und Muskeln. Präparieren Sie die Unterlippe des Unterkiefers zu entdecken.
5. Schneiden zwischen den unteren Schneidezähnen auf beiden Seiten des Unterkiefers zu trennen und jede Seite immobilisieren, um die Mundhöhle gelangen.
6. Visualisieren und sezieren den Gaumen von der Nasenhöhle.
7. Sezieren Bereiche mit einem 10 Blatt und sind Ober- und Unterkieferbackenzahn Bereiche mit umgebenden Zahnfleischentzündung (Abbildung 1). Stellen vertikale Einschnitte gerade anterior zu den ersten Molaren und hinter der dritten Molaren und einer horizontalen Schnitt andie Grenze des Zahnfleisches (white collar des umgebenden Gewebes Zähne).
8. Legen Sie die Ober- und Unterkieferblöcke in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 5 ml Collagenase / DNase (auf Eis halten).
9. Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C für 1 Stunde und während der letzten 5 Minuten Inkubation werden 50 ul 0,5 M EDTA.
10. In 5 ml kaltem DNase Medien auf die 50-ml-Tube mit Geweben und sanft zu mischen wirbeln.
11. Übertragen Sie die vier Blöcke von Gewebe auf eine Petrischale geben und mit 500 ul DNase Medien. Entfernen Zahnfleisch aus jedem Block von Gewebe, eine Skalpellklinge mit und zeigt die Klinge in den Zahnfleisch und Interdentalräume.
12. Übertragen die Gewebe und die Medien aus der Petrischale sowie den vorhergehenden DNase Medien bei der Präparation verwendet werden, auf eine neue 50-ml-Röhrchen durch die Zelle Sieb (70 & mgr; m groß). Wasche mit DNase Medien (3-5 ml) alle Instrumente verwendet und filtriert.
13. Mit dem Kolben einer sterilen 3 ml Spritze, Maische, das Gewebe gegen das Sieb,Filterung mit kaltem DNase Medien (30 bis 35 ml).
14. Waschen Sie die Zelle Sieb mit kaltem DNase Medien.
15. Zentrifuge bei 4 ° C, 314 xg für 6 min.
16. Überstand verwerfen, erneut zu suspendieren in 1 ml Vollmedien.
17. Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzählers (die erwartete Menge sollte zwischen 8 x ^{10 5 bis} 1,2 x ^{10 6 Zellen} mit einer Lebensfähigkeit von> 80% liegen).

3. Die Stimulation und FACS-Färbung von Zahnfleisch Cells

1. Stimulieren die Einzelzellsuspension mit PMA (50 ng / ml) und Ionomycin (2,5 & mgr; g / ml) in Gegenwart von 1 ul / ml Brefeldin A.
2. Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C und 5% _{CO 2.}
3. Spin down und waschen mit PBS und Zentrifuge bei 4 ° C; 314 g für 6 min.
4. Stain die Zellen eine Lebensfähigkeit Fleck unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
5. Stain für extrazelluläre Marker (CD45, TCRγδ, TCR & bgr;, CD4, CD8, TCRγδ oder Ameiseibodies der Wahl) nach den Anweisungen des Herstellers.
6. Waschen Sie die Zellen mit kaltem FACS-Puffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
7. Sanft vortexen das Zellpellet zu stören.
8. Fix die Zellen mit 2% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur.
9. Waschen Sie die Zellen mit kaltem FACS-Puffer, Zentrifuge bei 4 ° C, 314 xg für 5 min und Flecken zur intrazellulären Zytokine.
   1. Füllt die FACS-Röhrchen mit einer Lösung aus kaltem 0,5% Saponin verdünnt in FACS-Puffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
   2. Hinzufügen von 300 & mgr; l von 0,5% Saponin Lösung für die FACS-Röhrchen, Inkubieren für 15 min im Dunkeln bei 4 ° C und dann zentrifugiert bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
   3. Stain die Zellen für die intrazelluläre Marker (IL-17A und IFNy oder Cytokine der Wahl) nach den Anweisungen des Herstellers. Waschen Sie die Zellen mit 0,5% Saponin-Lösung und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
   4. Waschen Sie wieder mit FACSPuffer und Zentrifuge bei 4 ° C, 314 × g für 5 min.
   5. Wieder die Zellen in 300 ul FACS-Puffer.
10. Analysieren Sie die Ergebnisse auf einem Durchflusszytometer.

4. Durchflusszytometrie Analyse

1. Visualisieren Zellen analysiert auf zukunfts (FSC) und Seitenstreuung (SCC) und Gate werden Trümmer auszuschließen.
2. Wählen Sie einzelne Zellen mit Vorwärtsstreubereich (FSC-A) vs. Höhe (FSC-H) Parameter.
3. Gate-Zellen, die unter Spannung stehen (wie von Lebensfähigkeit Färbung angedeutet) und positiv für die hämatopoetischen Marker CD45 ⁺ für weitere Analysen (2A und 2C).
4. Weiter Analyse von spezifischen Markern wie in 2 und 3 dargestellt.

Ergebnisse

Zur Anwendung des Protokolls veranschaulichen, zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Immunzellennetz in das Zahnfleisch von Mäusen mit und ohne Parodontitis untersucht (WT vs. LFA ^{- / -} 2A - C). Repräsentative FACS Plots zeigen Live-CD45 ⁺ hämatopoetische Zellen im Zahnfleisch (2A, 2C). Isolation und Verarbeitung von Immunzellen mit diesem Protokoll liefert genügend Zellen ex vivo Stimul...

Diskussion

Die aktuelle Technik erfolgreich eine große Zahl von Immunzellen führt (aus einer einzigen Maus) geeignet, nicht nur für die phänotypische Charakterisierung, sondern auch für funktionelle Studien ex vivo. Eine andere Gruppe war zuvor ein Protokoll veröffentlicht zu isolieren und murine gingival Immunzellen zu charakterisieren und stellte den Wert der mehrfarbigen mit Durchflusszytometrie in der Studie von Parodontitis in Tiermodellen ^9. Nach erheblichen Fehlersuche den Schlüssel Änderung in diesem Pr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Feine Schere	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	14058-11
Skalpellgriff #3	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10003-12
Skalpellklingen #10	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10010-00	Sterile
Splitterzange	Integra Miltex	6-304
Nadeln mit normaler Fase	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm Länge
Monoject Spritzen	Covidien	8881513934	Luer-Lock-Spitze, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Ohne Calcium und Magnesium
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Ohne L-Glutamin
DNase I aus der Rinderbauchspeicheldrüse	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Kollagenase Typ IV	Gibco (von Life technologies)	17104-019
Fötales Rinderserum	Gemini Bio-products	100-106
Gentamicin 50 mg/ml	Qualität biologisch	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (von Life technologies)	15140-122
L-Glutamin	Gibco (von Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualität biologisch	351-027-721EA
50 ml Röhrchen	Corning	352070	Polypropylen, steril
70 μ M Zellsiebe	Corning	352350
Petrischalen	Corning	351029	Steril
5 ml FACS Röhrchen	Corning	352052	Steril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Enthält Brefeldin A-Lösung
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomycin Calciumsalz	Sigma-Aldrich	13909
Saponin aus Quillaja-Rinde	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34957
Anti-Maus CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Maus CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Maus TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Maus gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Maus IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Maus IFN-& gamma; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Maus NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Maus CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Maus CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Maus CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Maus CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Maus CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Maus TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Maus Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Maus Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104