Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Summary

Wir haben ein Verfahren zur Isolierung, phänotypische Charakterisierung und funktionelle Analyse von Immunzellen aus murinen Gingiva etabliert.

Abstract

Immunzellnetzwerke in Geweben spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der lokalen Immunität und der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase, dennoch ist wenig über die ansässigen Immunzellpopulationen in der Mundschleimhaut und Gingiva bekannt. Wir haben eine Technik für die Isolierung und Untersuchung von Immunzellen aus murinem Zahnfleischgewebe etabliert, einem Bereich ständiger mikrobieller Exposition und einer anfälligen Stelle für eine häufige entzündliche Erkrankung, die Parodontitis. Unser Protokoll ermöglicht eine detaillierte phänotypische Charakterisierung der Immunzellpopulationen, die in der Gingiva leben, auch im stationären Zustand. Unser Verfahren liefert auch genügend Zellen mit hoher Lebensfähigkeit für den Einsatz in funktionellen Studien, wie z. B. der Beurteilung der Zytokinsekretion ex vivo. Diese Kombination aus phänotypischer und funktioneller Charakterisierung des gingivalen Immunzellnetzwerks soll dazu beitragen, die Mechanismen der oralen Immunität und der parodontalen Homöostase zu untersuchen, aber auch unser Verständnis der Mechanismen der lokalen Immunpathologie zu verbessern.

Introduction

Zahnfleischgewebe umgeben den Menschen und der Maus Gebiss und werden ständig auf die komplexe Biofilm des Zahnes ¹ ausgesetzt. Die Immunzellennetz der Zahnfleischschutz Überwachung ist entscheidend für Gewebeintegrität zu gewährleisten, mit den lokalen kommensale Bakterien gewährleisten Homöostase und, zur gleichen Zeit, ^zwei wirksame Immunität gegen pathogene Herausforderung bietet. Um das zu erreichen Homöostase wird das Immunsystem sorgfältig auf die Zahnfleischumgebung zugeschnitten eine hoch spezialisierte Immunzellen Netzwerk zu schaffen, noch so kleine Detail wird von den Zahnfleischimmunzellpopulationen bekannt und ihre Rolle bei der Au....

Protocol

Alle experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschrieben gefolgt erforderlichen Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee, NIDCR / NIH genehmigt.

1. Bereiten Sie im Voraus

1. Bereiten Sie die komplette Medien: RPMI mit 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FBS.
2. Bereiten DNase Mittel: 50 ml RPMI-Medium mit 7,5 ug DNase ergänzt (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
3. Bereiten Collagenase-DNase Medien: 5 ml DNase Medium plus 3,2 mg / ml Collagenase Typ IV (Make frisch, auf Eis halten zu allen Zeiten).
4. Pre-kühlen FACS-Puffer: 0,5% FBS in ....

Results

Zur Anwendung des Protokolls veranschaulichen, zeigen wir repräsentative Ergebnisse der Immunzellennetz in das Zahnfleisch von Mäusen mit und ohne Parodontitis untersucht (WT vs. LFA ^{- / -} 2A - C). Repräsentative FACS Plots zeigen Live-CD45 ⁺ hämatopoetische Zellen im Zahnfleisch (2A, 2C). Isolation und Verarbeitung von Immunzellen mit diesem Protokoll liefert genügend Zellen ex vivo Stimul.......

Discussion

Die aktuelle Technik erfolgreich eine große Zahl von Immunzellen führt (aus einer einzigen Maus) geeignet, nicht nur für die phänotypische Charakterisierung, sondern auch für funktionelle Studien ex vivo. Eine andere Gruppe war zuvor ein Protokoll veröffentlicht zu isolieren und murine gingival Immunzellen zu charakterisieren und stellte den Wert der mehrfarbigen mit Durchflusszytometrie in der Studie von Parodontitis in Tiermodellen ^9. Nach erheblichen Fehlersuche den Schlüssel Änderung in diesem Pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Feine Schere	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	14058-11
Skalpellgriff #3	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10003-12
Skalpellklingen #10	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	10010-00	Sterile
Splitterzange	Integra Miltex	6-304
Nadeln mit normaler Fase	BD Medical	305109	27 G, 12,7 mm Länge
Monoject Spritzen	Covidien	8881513934	Luer-Lock-Spitze, 3 ml
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-049	Ohne Calcium und Magnesium
RPMI 1640	Lonza	12-167F	Ohne L-Glutamin
DNase I aus der Rinderbauchspeicheldrüse	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Kollagenase Typ IV	Gibco (von Life technologies)	17104-019
Fötales Rinderserum	Gemini Bio-products	100-106
Gentamicin 50 mg/ml	Qualität biologisch	120-098-661EA
Pen Strep	Gibco (von Life technologies)	15140-122
L-Glutamin	Gibco (von Life technologies)	25030-081
0,5 M EDTA pH 8,0	Qualität biologisch	351-027-721EA
50 ml Röhrchen	Corning	352070	Polypropylen, steril
70 μ M Zellsiebe	Corning	352350
Petrischalen	Corning	351029	Steril
5 ml FACS Röhrchen	Corning	352052	Steril
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	Enthält Brefeldin A-Lösung
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Ionomycin Calciumsalz	Sigma-Aldrich	13909
Saponin aus Quillaja-Rinde	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34957
Anti-Maus CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
Anti-Maus CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
Anti-Maus TCR beta APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
Anti-Maus gamma delta TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
Anti-Maus IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
Anti-Maus IFN-& gamma; PE	eBioscience	11-5931-82
Anti-Maus NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
Anti-Maus CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
Anti-Maus CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
Anti-Maus CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
Anti-Maus CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
Anti-Maus CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
Anti-Maus TCR beta FITC	eBioscience	11-5961-82
Anti-Maus Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
Anti-Maus Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104