Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Summary

Die Größenausschlusschromatographie mit Bindestrich mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Veränderungen in der Häufigkeit von Metalloproteinen direkt aus biologischen Proben zu messen. Hier beschreiben wir eine Reihe von Metalloprotein-Standards, die zur Abschätzung der Molekülmasse und der Menge an Metall verwendet werden, die mit unbekannten Proteinen assoziiert ist.

Abstract

Metalle sind essentiell für die Proteinfunktion als Cofaktoren, um chemische Reaktionen zu katalysieren. Eine Störung der Metallhomöostase wird mit einer Reihe von Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht, aber die genaue Rolle, die diese Metalle spielen, ist noch nicht vollständig geklärt. Die Identifizierung von Metalloproteinen stößt auf viele Herausforderungen und Schwierigkeiten. Hier berichten wir über einen Ansatz, der es ermöglicht, Metalloproteine in komplexen Proben zu quantifizieren. Dies wird durch die Größenausschlusschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (SEC-ICP-MS) erreicht. Anhand von sechs bekannten Metalloproteinen kann die Größenausschlusssäule kalibriert und die jeweiligen Spurenelemente (Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Jod) zur Quantifizierung herangezogen werden. SEC-ICP-MS-Spuren des menschlichen Gehirns und Plasmas werden vorgestellt. Die Verwendung dieser Metalloproteinstandards bietet die Möglichkeit, die Metalloproteinhäufigkeiten zwischen biologischen Proben quantitativ zu vergleichen. Diese Technik ist bereit, die Rolle von Metalloproteinen bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie bei anderen Krankheiten, bei denen ein Ungleichgewicht der Spurenelemente eine Rolle spielt, zu beleuchten.

Introduction

Wesentliche Metalle spielen eine entscheidende Rolle bei der normalen biologischen Funktionen, einschließlich der sekundären Botenwege, Stoffwechselwege und Organell Funktionen. 30% aller Proteine ​​sind gedacht , Metalloproteine ^​​1 und 50% aller Enzyme ² sein. Metalloenzyme nutzen diese Spurenmetalle als Cofaktoren chemische Reaktionen zu katalysieren, Proteinstruktur und für regulatorische Funktionen wie sekundäre Botenstoffe stabilisieren. Einige der untersuchten Spurenelemente in Bezug auf die Neurodegeneration sind Kupfer, Eisen und Zink - ^3. Sie sind gedacht, in vielen Krankheitswegen beteiligt werden, in denen durch dyshomeostasis haben negative Auswirkungen. Beispielsweise die Metallstatus von Superoxid - Dismutase (SOD) wirkt sich direkt auf die Lebensdauer und Phänotyp der transgenen Mausmodellen von familiärer Art von amyotropher Lateralsklerose (ALS) ^4. Bei der Alzheimer-Krankheit, wurden metalloproteomics Techniken verwendet, um eine Abnahme in der Metallstand von Transferrin in p zu entdecken⁵ LASMA. Diese Studien unterstreichen die wichtige Rolle Metalloproteine ​​in Krankheit spielen kann.

Die Studie von Metalloproteinen direkt aus biologischen Geweben ist ein Entwicklungsfeld. Obwohl einige Metalloenzyme charakterisiert worden sind, bleiben die meisten immer noch nicht charakterisierten oder unbekannt ^6. Eine der großen Herausforderungen bei der Messung Metalloproteine ​​ist die Forderung , den nativen Zustand des Proteins ⁷ zu halten. Klassische Bottom-up-Proteom-Techniken stützen sich auf die Verdauung der Proteine ​​in Peptide. Dieser Vorgang unterbricht die nichtkovalente Interaktion von Metallen und deren Proteine. Somit wird keine Information über das Metall Status eines Proteins gewonnen.

Eine Möglichkeit , dieses Problem zu überwinden , ist die Verwendung von Grßenausschlußchromatographie mit induktiv gekoppeltem Plasma gepaart - Massenspektrometrie ^8,9 (SEC-ICP-MS). Dies erzeugt Informationen über die ungefähre Größe des Proteins sowie alle Metalle, die Assoc sindverbundes mit ihm ^10. Ferner ist Größenausschluss eine sanfte chromatographische Technik, die den nativen Zustand eines Enzyms oder Protein-Protein-Komplex erhalten kann. Ein Vorteil induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist die quantitative Natur der Technologie. Mit einer Reihe von Metalloproteinen Standards ist es möglich , absolute Quantifizierung von Metalloproteine ​​aus biologischen Proben ^9,11 bereitzustellen. Dies wird durch Erzeugen einer Standardkurve durch Injizieren bekannter Metalloproteine ​​über einen Bereich von Metallkonzentrationen erreicht.

Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel, wie dies für eine Vielzahl von Metalloprotein Standards erreicht werden. In diesem Papier wollen wir Standardkurven für Metalle zu schaffen, die in biologischen Gebieten, einschließlich Eisen weitgehend untersucht (Fe), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Jod (I) und Cobalt (Co).

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Proben

1. Bereiten 500 ml Puffer, 200 mM Ammoniumnitrat pH 7,6-7,8 (pH mit Ammoniumhydroxid eingestellt (NH ₄ OH)) mit Cäsium (Cs) und antinomy (Sb) zu einer Endkonzentration von 10 ppb. Verwenden Cäsium und antinomy als interne Standards für jede Drift in der Reaktion von ICP-MS zu überwachen. Filter Puffer vor durch ein 0,22 um-Filter zu verwenden.
2. Bereiten Probe in Abhängigkeit von der Art der Probe: flüssig, Gewebe- oder Zellkultur.
   1. Für Proben , die Homogenisierung erfordern (zB Gewebe oder Zellen), stellen Sie sicher , dass sie nicht enthalten Reinigungsmittel. Verwenden Tris-Puffer für die Probenvorbereitung. Alternativ können Phosphatpuffer , aber sie können sich negativ auf die metalloproteome im Laufe der Zeit oder mit Gefrier - Auftau - Zyklen ¹² beeinflussen.
   2. Homogenisieren Gewebe- oder Zellkulturproben durch manuelle Dounce oder Beschallung für 5 min unter Verwendung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid(NaCl) + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Inhibitoren freie Protease).
   3. Klärung Homogenate durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 5 min. Sammeln Sie die resultierende Überstand. Halten Proben bei 4 ° C.
      Hinweis: Alle Proben müssen vor dem Laden in die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Fläschchen zentrifugiert werden Partikel zu verhindern, dass der Grßenausschlußchromatographie (SEC) Säule blockiert.
3. Normalisieren der Gesamtmenge an Protein auf der Säule für die Proben geladen. Bestimmen Proteinkonzentrationen bei 280 nm ein Mikrovolumen UV - Spektralphotometer ^13. Last zwischen 20 und 150 & mgr; g Protein. Verwenden Sie typische Injektionsvolumina im Bereich von 2 bis 80 & mgr; l in Abhängigkeit von der Probenkonzentration.
   1. Reinigen Sie den Probenarm des Mikrovolumen UV-Spektrophotometer mit destilliertem Wasser vor der Probenbeladung. Der Probenarm ist, wo die Proteinproben geladen werden.
   2. Blank das Instrument gegen 2 ul the-Probenpuffer. Dann Last 2 ul jeder Probe auf den Arm und messen der Extinktion bei 280 nm.
   3. Bestimmen Sie die Konzentrationen. Rohprotein Proben, einen Extinktionskoeffizienten von 1 Abs = 1 mg / ml verwendet werden. Um die Konzentration von Protein in den Proben zu bestimmen, verwenden das Beer-Lambert Gesetz, A = ε xlxc, wobei A die Extinktion ist, ε der Extinktionskoeffizient ist, L die Weglänge in Zentimetern und c ist die Konzentration.

2. Massenanalyse von Metalloprotein Standards mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie

1. Warm-up und stimmen die Instrumentenherstellers Protokolle.
2. Sobald Instrument wird erwärmt und abgestimmt, führen Sie Bulk-ICP-MS.
   Hinweis: Auf Lösungen von gereinigtem Metalloproteine ​​im Allgemeinen vor der Messung verdünnt werden müssen. Metall Stöchiometrien und der geschätzten Protein concentra: die Metallkonzentration des Standards kann aus der bekannten Protein abschätzbartion. Diese Informationen können verwendet werden, um die Verdünnung zu bestimmen, die geeignet sein wird, erzeugt im Bereich der Standardkurve fallen.
   1. Verdünnte Metalloprotein Standards, Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B _12, um sicherzustellen , dass sie im Bereich von 0 fallen - 500 ug / l, mit 1% Salpetersäure. Um das zu erreichen Standards in diesem Bereich, verwenden Sie keine Verdünnungen von mehr als 1 in 20 in Wasser durchführen Reihenverdünnungen die Bestände vor, dies zu verdünnen, falls erforderlich.
   2. Legen Sie die Reihenfolge der Injektionen auf. Zunächst analysieren die sieben Kalibrierniveaus, Konzentrationen im Bereich von 0 bis 500 ug / l, die von den Metalloprotein Standards gefolgt. Die sieben Kalibrierungswerte sind 0, 1, 5, 10, 50, 100 und 500 ug / L.
   3. Wählen Sie Elemente von Interesse. Hier verwenden Fe, Cu, Zn, Co und I, da sie die Elemente sind, dass die Protein-Standards gebunden. Wählen Sie die Elemente in der Erwerbsmethode durch die Elementauswahl Registerkarte Öffnen und Hinzufügen der eleme nts und ihre jeweiligen Isotopenmassen, die analysiert werden sollen.
   4. Führen Sie die Probenanalyse mit dem Instrument und der Geräte-Software erstellt automatisch die Kalibrierungskurven für jedes der Elemente analysiert. Die Eichkurven werden durch die Software erstellt, indem die Zählungen / sec der gegen die Menge an Metall detektiert Metall aufgetragen, die den Standard gemeint ist enthalten, in ug / l. Mithilfe der Eichkurven die Konzentration des Metalls in den unbekannten Proben zu bestimmen.
      Anmerkung: Unter Verwendung der Kalibrierungskurve, bestimmt die Software, um die Konzentration des Metalls in jedem der Metalloprotein Standards.
   5. Aus den bulk Analyseergebnisse Metalloprotein Standards, die die drei am häufigsten vorkommenden Spurenelemente in Säugetiergewebe unter Verwendung einer Mischung von Cu, Zn-Superoxid-Dismutase (SOD), verdünnt auf 200 ug / L von Kupfer und Zink und Ferritin (FTN) an einer abschließenden umfassen erzeugen Konzentration von 2000 ug / l Eisen.

jove_title "> 3. HPLC System-Setup und Grßenausschlußchromatographie Äquilibrierung der Säule

Anmerkung: Dieser Abschnitt sollte parallel zum vorhergehenden durchgeführt werden, da sie beide etwa 1 erforderlich - 1,5 Stunden durchzuführen.

1. Purge HPLC-Pumpen mit Puffer in Schritt 1.1 und reinigen die Pumpen für 5 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min.
2. Sobald das System gespült wird, stellen Sie den Durchfluss bei 0,1 ml / min und schließen Sie die Größenausschluss-Säule (4,6 x 300 mm, 3 & mgr; m, 150 Å).
   Hinweis: Eine nasse Verbindung zwischen dem Rohr und der Säule vermeidet jegliche Luftblasen während der Verbindung der Säule eingefangen wird.
3. Verbinden Sie das andere Ende der Säule mit dem UV-Detektor eingestellt Absorption bei 280 nm zu messen PEEK Schläuche verwenden.
4. Nach und nach die Geschwindigkeit in Schritten von der Säulenfluss erhöhen von 0,05-0,1 ml / min bis zu einer endgültigen Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml / min erreicht wird. Während dies geschieht, überprüfen Sie die Schlauchverbindungen auf die Säule auf Lecks. Überwachen Sie den Druckes überschreitet nicht die Spalte Anforderungen sicherzustellen des Systems durch das Chromatogramm in der Software der Druckverlauf zu beobachten.
5. Lassen Sie die Spalte mit der erforderlichen Strömungsgeschwindigkeit über 5 äquilibrieren - 10 Säulenvolumen. Nachdem sie ins Gleichgewicht gebracht wird, schließen Sie die Instrumente Probenanalyse auftreten zu lassen.
6. Stellen Sie die HPLC-Methode nach oben nach oben Puffer A über die Säule bei 0,4 ml / min für 15 min zu pumpen.

4. Einrichten und Größenausschluss Running - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie

Hinweis: Betriebsverfahren kann variieren zwischen den Instrumenten und Modellen. Kontaktieren Sie das Instrument technischer Spezialist mehr darüber zu erfahren, wie die ICP-MS verwendet zu konfigurieren ist.

1. Legen Sie die ICP - MS in den Standby-Modus, bevor Sie die Hardware-Einstellung zu ändern.
   1. Im Standby-Modus, schalten Sie die Kommunikation für die Autosampler aus und ändern Sie die Probe Einführung in die "andere".
      Hinweis: Je nach Software und hartware Konfigurationsauswahl "HPLC" als Probeneinführungsquelle kann verwendet werden. Kontaktieren Sie das Instrument technischen Spezialisten zu lernen, wenn diese Option verfügbar ist.
2. Verwenden Sie PEEK-Schlauch (ID 0,13 mm), um den Ausfluss aus dem UV-Detektor zum direkten Anschluss an den Zerstäuber auf dem ICP-MS.
3. Schalten Sie den ICP sichern - MS und lassen Sie das Gerät für 10 zum Aufwärmen - 20 min.
4. Nachdem das Plasma gezündet hat, schließen Sie das Remote-Kabel von der ICP - MS auf der Rückseite des HPLC-Autosampler. Tun Sie dies einmal das Plasma gezündet hat; andernfalls wird das HPLC-System automatisch, da die ICP heruntergefahren - MS nicht eingeschaltet ist.
5. Ändern Sie die ICP-MS-Methode zur Erfassung von Daten für die LC-ICP-MS.
   1. Alter der Erwerbsmethode von Spektrum zu Zeit resolve Erfassung (TRA).
   2. Wählen Sie die Elemente analysiert werden, Fe, Cu, Zn, Co, I sowie andere Elemente von Interesse, und setzen Integrationszeiten (in der Regel zwischen 0,05 bis 0,3 sec). Nachdem die Elemente von Interesse einRe gewählt, stellen Sie die Erfassungszeit die Laufzeit für die Chromatographie zu entsprechen (zB 900 sec für eine 15 - min - Chromatographie - Lauf).
   3. Manuelles Einstellen der ICP - MS für die Empfindlichkeit und Kollisionszelle Helium (He) Gasflussraten mit dem Puffer-Chromatographie fließt unter Verwendung von Cs und Sb in dem Puffer enthalten. Die He Strömungsraten liegen typischerweise ~ 1 ml / min weniger als die für die Massenanalyse verwendet. Sobald die Metallionenzählungen stabilisiert haben und die relative Standardabweichung (RSD) Werte unter 5%, ist das System betriebsbereit.
6. Machen Probe laufen Listen sowohl in der HPLC und ICP-MS-Software-Programme. Die Probe Laufliste enthält die Reihenfolge, in der jeder der Proben ist ebenso wie der Name injiziert werden, mit dem die Daten gespeichert werden. Überprüfen Sie, dass die Gesamtzahl der Proben, die in der Liste Übereinstimmung zwischen den beiden Programmen.
7. Starten Sie den Probencharge für das ICP-MS vor der HPLC, wie die Injektion der Probe durch HPLC wird das ICP auslösen - MS zu starten SammelDaten. Wenn dies nicht in der richtigen Reihenfolge durchgeführt wird, wird es in fehlenden Daten führen.
8. Generieren Kalibrierungskurve Punkte durch Variation Volumina der SOD und FTN gemischten Standard von 200 ug / l bis 6000 ug / l Injektion injiziert auf Spalte für Cu & Zn und 2000 ug / l bis zu 60.000 g / L für Fe. Injektionsvolumina im Bereich von 1 bis 30 & mgr; l.
   Anmerkung: Diese Konzentrationsbereiche umfassen, die Konzentrationen von Fe, Cu und Zn in der Regel komplexe Homogenaten beobachtet. Bei Proben, die nur gereinigte Proteine ​​die maximale Reichweite der Kurve enthalten sollte entsprechend angepasst werden. Da die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, einen kleineren oder größeren Bereich erfordern, da es weniger Verunreinigung in der Probe von anderen Faktoren.
9. Analysieren jedes der unbekannten Proben Gewebe, Plasma oder Zellkultur.

5. Datenanalyse, Manipulation und Visualisierung

1. Speichern Sie die Daten im Comma Separated Value (CSV) Dateiformat und laden into Verarbeitungsprogramme wie erforderlich.
2. Damit Instrument Drift zu steuern, teilen Sie die Zählungen pro Sekunde für jedes Element durch die Zählungen pro Sekunde für entweder Cs oder Sb.
3. Erzeugen Eichkurven für jedes der Elemente.
   1. Bestimmung der Fläche unter der Metall peak, der dem entspricht, der Metalloprotein es für jede der Einspritzungen durch Ausführen Peakintegration in der bevorzugten Datenanalyse-Software gebunden ist.
   2. Plotten der Fläche unter dem Peak Metall gegen die Gesamtmenge des Metalls, die auf die Säule in jedem Durchlauf injiziert wurde, 200 - 6,000 ug / l für Cu und Zn und 2,000 - 60,000 & mgr; g / L für Fe. Führen der linearen Regressionsanalyse nach der Software-Protokoll.
   3. Verwenden Sie die Steigung ergibt sich aus der linearen Regressionsanalyse als Faktor zählt zu konvertieren pro Sekunde pg / sec. Teilen jede der Zählungen pro Sekunde Datenpunkte über das Chromatogramm, das durch den Gradienten des Linienwert.
4. Graph, der die Daten inpg / s gegen das Chromatogramm Zeit. Die Fläche unter den Peaks von Interesse. Die Fläche unter dem Peak repräsentiert die Gesamtmenge an Metall, das das Protein gebunden ist, in pg.
5. Generieren eines Kalibrierungs bezogen auf das Molekulargewicht der bekannten Metalloproteine ​​und dem Zeitpunkt, zu dem sie eluieren. Hier können Sie die Größe der Proteinpeaks in komplexen Proben zu schätzen.

Results

Die Verwendung von Metalloprotein Standards ermöglicht die Kalibrierung der Grßenausschlußsäule. 1A zeigt das Elutionsprofil für die Standards Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B ₁₂ , bezogen auf das Metall , das sie gebunden sind (Fe, Co, Cu, Zn und I). 1B zeigt die Eichkurve für die Spalte Grßenausschluß basierend auf dem Molekulargewicht der Proteinstandards und deren Elutionszeit, in dem Format von Elutionsvolumen dargestellt (Ve) , geteilt durch das Leervolumen der Säule (Vo). Die Proteine ​​verwendet, um dieses Standardkurve zu erzeugen, sind Concanavalin A, Conalbumin, Ceruloplasmin, Ferritin, SOD und Thyreoglobulin.

2A zeigt die Elution von Ferritin über einen Bereich von 2.000 - 60.000 pg Fe injiziert auf Spalten- und 2D ist die Regressionsanalyse durchgeführt unter Verwendung von peak Bereich. 2B und 2C sind die Elutionsprofile für Cu / Zn SOD für Cu und Zn und 2E und 2F sind die Regressionsanalyse unter Verwendung von Peakflächen erzeugt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse verwendet, um die Rohdaten in Counts / sec zu pg / sec zu konvertieren, so dass die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, quantitativ bestimmt werden. Die Umwandlung wird durch Division des Counts / sec durch die Steigung der linearen Regression durchgeführt (zB 334,6 (Counts / s) x (s / pg) Kupfer).

Wie bereits erwähnt, kann diese Technik verwendet werden, Metalloproteine ​​in komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Menschliche Gehirn und Plasma wurden zu dieser Technik unterzogen und Figuren 3 bzw. 4 erhaltenen Ergebnisse zeigen. Menschliche Gehirn getrennt durch SEC-ICP-MS ist in den 3A bis 3C gezeigt, von denen jede repräsentieren eine andere Metall der Interesse (Cu, Zn oder Fe). 4A-4C die Spuren erhalten zeigen , wenn Humanplasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und die Fülle der Probe wird die Anzahl der Spitzen auswirken, die zu sehen sind. Wie erwartet Plasma wird durch ein paar Metalloproteine ​​einschließlich Ceruloplasmin und Transferrin bestimmt.

Abbildung 1. Kalibrierung der Größe Chromatographie Ausschluss - Massenspektrometrie unter Verwendung bekannter Metalloproteins (A) Elutionsprofil für die Metalloprotein Standards auf der Grundlage ihrer jeweiligen Metalle - Induktiv Plasma gekoppelt ist .. (B) Molekulargewichtskalibrierungskurve für Proteinstandards Thyroglobulin (i), Ferritin (ii), Ceruloplasmin (iii), Conalbumin (iv), Cu / Zn - SOD (v) und Concanavalin A (vi)."Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Verwendung von Ferritin und Cu / Zn - SOD als Metalloprotein Standards zur Bestimmung der Menge an Cu, Fe oder Zn Verbunden mit Metalloproteins in einer komplexen biologischen Probe (A) Elutionsprofil für Ferritin über den Injektionsbereich 2000 -. 60.000 ug / l Eisen. (B) und (C) Elutionsprofil für Cu / Zn SOD auf die Injektionsbereich von 200 - 6000 g / L von Kupfer und Zink, respectively. (D), (E) und (F) zeigen die Regressionsanalyseergebnissen für die Metalle Eisen, Kupfer und Zink sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Cu, Fe und Zn Metalloproteome des menschlichen Gehirns. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht unter dem Diagramm angezeigt dargestellt ist. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Cu, Fe und Zn Metalloproteome für Humanplasma. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall wird durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht gezeigt indicated unter dem Graphen. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Gewährleistung der nativen Zustand des Proteins bedeutet, besondere Aufmerksamkeit auf die Puffer verwendet und Lagerung der Probe erforderlich sind. Nicht alle chromatographischen Techniken oder Probenpräparationstechniken können eingesetzt werden. Es ist wichtig, dass die Puffer im gesamten Probenvorbereitung und Chromatographie verwendet frei sind von Metallchelatoren und Puffer, die Verwendung physiologischen pH-Wert und Salzkonzentrationen nachahmen. Andere Bedingungen zu vermeiden , umfassen Erwärmen der Probe oder die Zugabe von Proteindenaturierungsmitteln (zB Harnstoff). Es ist wichtig, die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren. Die Fähigkeit des gewählten Puffers zweiwertiger Metalle zu binden, ist ebenfalls wichtig und ist ein Grund dafür, daß Tris oder Ammoniumnitrat Puffer über Phosphatbasis Puffern ausgewählt werden.

Die niedrige Auflösung und Peakkapazität der Grßenausschlußchromatographie relativ zu anderen Formen der Chromatographie ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik. Doch die sanfte Art der Größenausschluss chromatography ist wichtig, den nativen Zustand des Proteins aufrecht zu erhalten und damit die relativ schwache Metall-Protein-Bindungen zu erhalten. Die Anforderung , den nativen Zustand der Proteine ​​erfordert besondere Aufmerksamkeit auf die Behandlung der Proben zu erhalten , einschließlich der Anzahl der Gefrier - Auftau - Zyklen zu begrenzen, die Vermeidung Metallchelatbildner (zB EDTA) oder chaotropen Salzen und Detergenzien.

Diese geringe Auflösung dieser Technik wirkt sich auf die Fähigkeit, die Menge an Metall mit einem bestimmten Protein zu quantifizieren, wenn sie in einer komplexen Probe wie die Peaks wird mehr als ein Protein angesehen enthalten. Daher bestimmt die Menge an Metall, um die Peak-Integration unter Verwendung wäre ein Hinweis auf die Gesamtmenge an Metall zu diesem Zeitpunkt und nicht nur ein spezifisches Protein mit allen der Proteine ​​eluierenden Verbindung gebracht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden würde das Protein von Interesse müssen weiter unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Dies würde für die Quantifizierung vondas Metall mit diesem Protein in Verbindung mit einem höheren Grad an certainity gemeldet werden. Eine weitere potentielle Einschränkung dieser Technik würde der Verlust an Protein aufgrund nicht reversible Bindung an die Säule. Um festzustellen, ob dies ein Rückgewinnungsexperiment geschieht sollte durchgeführt werden, wobei die Menge an Protein aus der Säule eluiert wird analysiert, um zu bestimmen, ob dies die Menge übereinstimmt injiziert. Das gleiche kann durch Messung des Metallgehalts des Eluierung Materials und des Ausgangsmaterials durch bulk ICP-MS durchgeführt werden. Spaltenrückgewinnung kann in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen unterscheiden, aber es hat sich gezeigt , daß eine vollständige Rückgewinnung von Proteinen aus einer Größenausschlusssäule ist möglich ^9. Daher ist es wichtig, ob oder nicht zu überprüfen ist der Verlust unter den Betriebsbedingungen verwendet werden.

Modifikationen des Protokolls können auf die Metalloprotein Standards in Beziehung gesetzt werden, die ebenso wie die untersuchten Elemente verwendet werden. Die Art der Metalloprotein Standard unsed wird in Abhängigkeit von den Elementen unterscheiden, die von Interesse sind. Für Elemente, wie Cu, Fe und Zn-Proteine, SOD und Ferritin verwendet. Jede andere Metalloprotein, die bekannt stoichometries haben, können auch verwendet werden und einige Beispiele wurden hier gezeigt.

Eine Hauptkomplikation, die diese Technik verwenden, ist der Aufbau der Salzkristalle in dem Brenner der ICP-MS entstehen können. 1,000 ml Puffer, der durch das System geleitet wurde, oder wenn es durch visuelle Inspektion festgestellt wird, daß das Brenner gewaschen werden soll - zum Aufbau der Salzkristalle zu verhindern, wird der Brenner mit destilliertem Wasser nach 500 gewaschen. Ein weiteres Problem, das ist ein schneller Rückgang der Sauberkeit der Proben- und Extraktionskegel entstehen können. Diese müssen gereinigt werden regelmäßig folgende Herstellerprotokolle.

Die anfängliche Probenvorbereitung ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Wenn es irgendwelche Änderungen an der Protein - Metallkomplex der informationen erzeugt wird, nicht gültig ist. Dies ist eine der wichtigsten Beschränkungen der Technik; Zusätzlich ergibt die Verwendung der niedrigen Auflösung, Grßenausschlusssäule eine begrenzte detaillierte Ansicht der wahren Komplexität der Metalloproteine ​​in der Biologie.

Die hier beschriebene Technik ermöglicht die Erweiterung des Wissens des metalloproteome eines Organismus. Massenanalyse liefert nur eine grobe Angabe der Änderungen der Menge an Metall in einer Probe. Neben den allgemeinen Überlegungen, die ergriffen werden müssen, bietet diese Technik ein Werkzeug, das verwendet werden kann, die Menge an Metall mit Proteinen sowie die Identifizierung Metalloproteine ​​assoziiert zu quantifizieren, die durch einen Vergleich der Spuren berechnet wurde, abweichen. Die Verwendung dieser Technik kann verwendet werden, Unterschiede zwischen Krankheitszuständen zu identifizieren. Die identifizierten Metalloproteine ​​können dann die Rolle bestimmen zu helfen, untersucht werden sie in Krankheitsprozessen spielen. Die Anwendung von Bindestrichen ICP-MS hat eine wachsendeZukunft die Rolle von Drogen zu bestimmen, die ein Heteroatom wie beispielsweise Platin, Iod oder Kupfer als ICP-MS haben, können verwendet werden, um die Proteine ​​zu identifizieren, die das Medikament bindet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 1290 Infinity Binärpumpe	Agilent	G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler	Agilent	G4226A
Agilent 1200 Serie Autosampler Thermostat	Agilent	G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatisiertes Säulenfach	Agilent	G1316C
Agilent 1290 Infinity Detektor mit variabler Wellenlänge	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
Ammoniumhydroxid Spurenmetall Basis	Sigma	338818
Ammoniumnitrat	Sigma	256064	Stellen Sie am Tag des Experiments eine frische 200-mM-Lösung her
Antinomie	Auswahl analytisch	10002-3
Ceruloplasmin	Sigma
Cäsium	Auswahl analytisch	100011-1
Vollständige, EDTA-freie Proteasehemmer	Roche	11873580001
Conalbumin	Sigma	C7786
Concanavalin A aus Canavalia ensiformis (Jack Bean)	Sigma	L7647
Cu, Zn-Superoxid-Dismutase	Sigma	S9697
Ferritin	Sigma	F4503
ICP-MS Multielement-Kalibrierstandards	AccuStandard		Hergestellt bis zu den erforderlichen Konzentrationen in 1 % Salpetersäure
Mikrovolumen-UV-Spektralphotometer	Thermo Scientific
65% Salpetersäure	Millipore	100441	Zur Verwendung auf 1% verdünnt
Peek-Schläuche	Agilent	5042-6461
Formatausschlusssäule BioSEC-3 SPS. Säule, 4,6 x 300 mm, 3 μ m, 150 & Aring;	Agilent	5190-2508
Natriumchlorid	Chem Supply	SA046
Trishydrochlorid	ICN Biomedicals Inc.	103130
Thyreoglobulin	Sigma	T9145
Vitamin B12	Sigma	V2876