Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Summary

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Abstract

Während der neuronalen Entwicklung dehnen sich wachsende Axone auf mehrere synaptische Partner aus, indem sie axonale Äste ausarbeiten. Die Axonverzweigung wird durch extrazelluläre Leitsignale wie Netrin-1 gefördert und führt zu einer dramatischen Vergrößerung der Oberfläche der axonalen Plasmamembran. Die Netrin-1-abhängige Axonverzweigung beinhaltet wahrscheinlich eine zeitliche und räumliche Kontrolle der Plasmamembranexpansion, deren Komponenten durch exozytäre Vesikelfusion zugeführt werden. Diesen Fusionsereignissen geht die Bildung von SNARE-Komplexen voraus, die aus einem v-SNARE bestehen, wie z. B. VAMP2 (vesikelassoziiertes Membranprotein 2), und den Plasmamembran-t-SNAREs, Syntaxin-1 und SNAP25 (synaptosomal-assoziiertes Protein 25). Detailliert hierin ist ein mehrgleisiger Ansatz, der verwendet wird, um die Rolle der SNARE-vermittelten Exozytose bei der Axonverzweigung zu untersuchen. Die Stärke des kombinierten Ansatzes liegt in der Datenerfassung mit einer Reihe von räumlichen und zeitlichen Auflösungen, die von der Dynamik einzelner Vesikelfusionsereignisse in einzelnen Neuronen bis hin zur SNARE-Komplexbildung und Axonverzweigung in Populationen kultivierter Neuronen reichen. Dieses Protokoll nutzt etablierte biochemische Ansätze zur Bestimmung von endogenen SNARE-Komplexen und die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) von kortikalen Neuronen, die VAMP2 exprimieren, das mit einem pH-empfindlichen GFP (VAMP2-pHlourin) markiert ist, um Netrin-1-abhängige Veränderungen der exozytären Aktivität in einzelnen Neuronen zu identifizieren. Um das Timing der Netrin-1-abhängigen Verzweigung aufzuklären, wird die Zeitraffer-Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) einzelner Neuronen über die Größenordnung von Stunden verwendet. Fixierte zelluläre Immunfluoreszenz gepaart mit Botulinum-Neurotoxinen, die die SNARE-Maschinerie spalten und die Exozytose blockieren, zeigt, dass die Netrin-1-abhängige Axonverzweigung eine SNARE-vermittelte exozytäre Aktivität erfordert.

Introduction

Jüngste Schätzungen deuten darauf hin, dass das menschliche Gehirn 10¹¹ Neuronen mit 10¹⁴ synaptischen Verbindungen¹ enthält, was die Bedeutung der Axonverzweigung in vivo unterstreicht. Extrazelluläre Axonführungssignale wie Netrin-1 leiten Axone zu geeigneten synaptischen Partnern und stimulieren die axonale Verzweigung, wodurch die synaptische Kapazität^{erhöht wird 2-5}. Die Netrin-1-abhängige axonale Arborisierung beinhaltet eine erhebliche Plasmamembranexpansion⁶, von der wir angenommen haben, dass sie die Abgabe zusätzlicher Membrankomponenten über die vom SNARE-Komplex abhängige exozytäre Vesikelfusion erfordert⁷.

Die Untersuchung der Rolle der SNARE-vermittelten Exozytose bei der Netrin-1-abhängigen Axonverzweigung wird durch mehrere Faktoren erschwert. Erstens erhöht die Heterogenität der kortikalen Neuronen die Stichprobengröße, die erforderlich ist, um signifikante Effekte zu identifizieren, was Einzelzelltechniken wie die Bildgebung erschwert. Zweitens ermöglichen biochemische Techniken zwar die Beobachtung von Veränderungen, die auf Populationsebene auftreten, aber es fehlt ihnen die zeitliche und räumliche Auflösung, die erforderlich ist, um die Ausdehnung der Plasmamembran auf das Axon im Zeitrahmen der Axonverzweigung zu lokalisieren. Schließlich, obwohl sich Axonäste über Stunden bilden, können die zellulären Veränderungen, die zur axonalen Ausdehnung beitragen, innerhalb von Minuten beginnen und in der Größenordnung von Sekunden auftreten, wodurch der zeitliche Spielraum für experimentelle Betrachtungen erweitert wird.

Wir skizzieren einen Multi-Technik-Ansatz, der diese verschiedenen zeitlichen und räumlichen Skalen der Exozytose und Axonverzweigung adressiert und somit unser Verständnis der grundlegenden zellulären Mechanismen erweitert. Die Verwendung dieser Ansätze liefert Hinweise auf eine entscheidende Rolle der SNARE-vermittelten Exozytose bei der Axonverzweigung.

Protocol

Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche Tiere hierin unterliegen den Regeln und Vorschriften des UNC - Ausschusses für Tierpflege und NIH - Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren detailliert beteiligt sind .

1. Herstellung und Beschichtung von Dissociated kortikalen Neuronen

1. Euthanize timed-trächtige Weibchen durch CO ₂ Inhalation durch Genickbruch folgte. Entfernen Sie ganze Gehirn aus den Schädeln embryonaler Tag 15.5 (E15.5) Mäuse und microdissect Rinden von jeder Hemisphäre. Eine ausführliche Anleitung über die Mikrodissektion von embryonalen Maus Kortex bitte Viesselmann et al ⁸ zu sehen.
2. Legen nicht mehr als 4 cortices in 1 ml Sezieren Medien in einem sterilen 1,6 ml Microtube. In 120 ul 10x Trypsin und wird das Röhrchen 3 bis 5-mal zu mischen.
3. Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen Zellen Zellkulturschalen auf Saatgut. Anmerkung: 1 kortikalen Hemisphäre liefert ca.oximately drei Millionen Zellen.
   1. Für die SDS-resistenten SNARE-Komplex Biochemie Assay Platte sechs Millionen Zellen pro 35 mm-Schale und verwenden zwei Gerichte pro Zustand. Hinweis: Dies wird durch Verwendung von 6-Well-Platten wird vereinfacht, wenn mehrere Bedingungen zu vergleichen.
   2. Für Verzweigungs Assays Platte Neuronen auf Salpetersäure gewaschen Kreisdeck bei einer Dichte von 250.000 Zellen pro 35 mm-Schale, für die DIC-Bildgebung von Axon Verzweigung Platte mit einer Dichte von 150.000. Diese Dichten vermeiden Übervölkerung und Analyse zu vereinfachen.
4. Für die Live-Zelle TIRF Mikroskopie, resuspendieren zwei Millionen Neurone pro Transfektion in Nukleofektion Lösung bei RT.
   1. Zugabe von 100 ul Zellsuspension zu Microtube 10 ug VAMP2-pHlourin Expressionsplasmid enthält , und mit einem elektroporieren Nucleofector nach Herstellerprotokoll ^9.
   2. Nach Transfektionen sofort 500 ul Trypsin Löschmedium hinzufügen, entfernen Suspension von Küvetten und Platte Zellen in einer Höhlesität von 400.000 Zellen pro 35 mm PDL-beschichtete Glasbodenschale.
5. Platte alle kortikalen Neuronen in 2 ml Serum-freien Medien.

2. SNARE-Komplexbildung Assay

Hinweis: SDS-resistenten SNARE - Komplexe wurden verarbeitet und analysiert , wie ursprünglich ¹⁰ beschrieben mit den Änderungen , die nachstehend beschrieben. Für validierte alternative Antikörper gegen die hier verwendet wird, finden Sie im Abschnitt Materialien.

1. Stimulieren E15.5 kortikalen Neuronen 2 Tage in vitro (DIV) mit 250 ng / ml Netrin-1 oder Schein - Kontrolle für 1 Stunde vor der Lyse.
2. Vor der Verarbeitung von Proben, kühle Zentrifuge bis 4 ° C, und setzen Wasserbadtemperatur auf 37 ° C und Wärmeblock auf 100 ° C.
3. Entfernen Sie Zelle Gerichte aus Inkubator und auf Eis.
   1. Absaugen Medien aus Zellen, ersetzen mit ~ 2 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) sanft 2 mal mit 1 - 2 min pro Wasch.
   2. Für diesen Test verwenden zwei Vertiefungen pro Ltgition.
   3. Absaugen PBS aus der ersten Vertiefung einer Bedingung und ersetzen mit 250 ul Homogenisierungspuffers. Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann eine Zelle Lifter, homogenisieren Zellen auf Eis.
   4. Saugen Sie das PBS aus dem nächsten gut von den gleichen Bedingungen und zu der auch die vor kurzem homogenisierte Mischung. Dies wird die Proteinkonzentrationen erhöhen. Wiederholen Sie dies für alle Bedingungen.
   5. Nach der Fertigstellung homogenisiert Pipettenlösung auf ein vorgekühltes 1,6 ml Mikroröhrchen auf Eis und füge 20% TritonX-100 auf eine Endkonzentration von 1% TritonX-100 zu erreichen. 10-mal mit 1000 ul Pipette Man reibt mischen, während Blasen zu minimieren.
4. Die Röhrchen auf Eis für 2 min, um Proteine ​​zu solubilisieren. Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 6010 rcf bei 4 ° C pelletiert nicht-solubilisierten Material. Bewegen Sie Lysatüberstand in neue gekühlte 1,6-ml-Röhrchen auf Eis.
5. Führen Proteinkonzentration Analyse unter Verwendung von Bradford - Test ¹¹ und verdünnten Proben auf eine final Proteinkonzentration von 3 bis 5 mg / ml mit Puffer-Rest Homogenisieren, supplementiert mit 1% TritonX-100 und 5-fach Probenpuffer, ergänzt mit B-Mercaptethanol (BME).
6. Teilen Sie jede experimentelle Probe gleichmäßig in zwei Röhren. Inkubieren einer Probe bei 37 ° C für 30 min (SNARE-Komplexe), und das andere bei 100 ° C für 30 min (SNARE Monomere). Invert Röhren intermittierend Proben in Lösung zu halten.
7. Frieren Proben bei -20 ° C bis bereit, über SDS-PAGE zu trennen. Vor der Proben mittels Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden, Aufkochen vorher gekochten Proben für 5 min bei 100 ° C, aber auftauen 37 ° C Proben bei RT.
8. Führen Sie Duplikate der Proben (30 - 40 & mgr; g Protein pro Probe) sowohl auf einem 8% und 15% Gel; die 8% bietet ideale Abtrennung des Komplexes, während die 15% verwendet wird SNARE-Protein-Monomere (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, Syntaxin-1 ~ 35 kDa) zu quantifizieren. Pflegen Stromquelle bei 70 V bis der Farbstoff Linie durch die stac istKönig Gel und Erhöhung Spannung 90V. Führen Sie Gele, bis der Farbstoff abläuft.
9. Um Monomere zu erhalten, übertragen Proteine ​​bis 0,2 um Nitrocellulosemembran auf Eis mit kaltem Transferpuffer mit 20% Methanol (MeOH) zugegeben, bei 70 V für 45 min.
10. Dry Membran in einer Schale mit Deckel für 2 Stunden auf O / N bei RT (O / N liefert die besten Ergebnisse).
11. Block SNARE-Komplex-Membranen in 10% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei RT.
12. Bereiten Sie primäre Antikörper (Erkennung spezifischer SNARE-Komplex-Komponenten) in einer Verdünnung von 1: 1000 und Sonde O / N bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler.
    1. Spülen Blots in Tris-gepufferter Salzlösung plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 mal für jeweils 5 Minuten.
13. Bereiten Sie fluoreszierenden sekundären Antikörperlösungen in einer Verdünnung von 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T und Sonde für 1 Stunde bei RT abgedeckt. Wiederholen Sie Schritt 2.12.1 nach 1 Stunde.
14. Bild Flecken auf einem fluoreszierenden Scan-Maschine mit Software Suite ausgestattet und zu quantifizieren, sowohl die SNARE-Protein complex (immunoreaktive Banden oberhalb 40 kDa) und Monomer Bänder (immunoreaktive Banden bei 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa für SNAP-25, Syntaxin und VAMP2-1 bezeichnet) unter Verwendung von Anweisungen des Herstellers zum Zeichnen rechteckigen ROIs.

3. Imaging Exozytose-Events über TIRF Mikroskopie

Hinweis: Dieses Protokoll erfordert spezielle Mikroskopie Ausrüstung einschließlich einer Klimakammer Temperatur, Feuchtigkeit und CO _2, ein umgekehrtes TIRF - Mikroskop ausgestattet mit einer epifluoreszenten Beleuchtung, hoher Vergrößerung / hoher numerischer Apertur (NA) TIRF Ziel, eine automatisierte XYZ - Plattform zu halten und ein empfindliches Charge Coupled Device (CCD) -Detektor. Dieses Protokoll verwendet einen vollständig inverses Mikroskop mit einem 100x 1.49NA TIRF Ziel einen festen Zustand 491-nm-Laser und einem Elektronenvervielfachungs CCD (EM-CCD) ausgestattet automatisiert. Alle Geräte werden durch Bildgebung und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Beginn der Bildgebungsprotokoll Leistung auf der environmental Kammer, Bühne, Lampe, Computer und Kamera.

1. Wählen Sie Ziel innerhalb Imaging-Software. Sobald das Ziel vorhanden ist, befestigen Sie den Objektivheizer um den Kragen.
2. Bestätigen Sie, dass Ziel abgesenkt wird vollständig, bevor die Bühne Inkubator in der Stufe Schlitz zu sichern. Gießen Sie destilliertes Wasser in die Stufe Inkubator Einlässe gleichmäßig Spill zu verhindern.
3. Schalten Sie das Inkubationssystems. Öffnen Sie das Ventil in die CO ₂ Tank und bestätigen der Druck für das System den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Warten Sie einige Zeit Kammer zu erreichen , 5% CO ₂ und 37 ° C. Vor der Zugabe des Abbildungsschale, legen Sie eine leere Schale in den Inkubator Kondensation von Wasser auf dem Ziel zu vermeiden.
4. Einschalten der Laserquelle.
5. Offene Bühne Inkubator und Sionsöl auf die Linse hinzuzufügen. Legen Probe in Inkubator und zu stabilisieren, mit Stabilität Armen oder einem Teller Gewicht. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit dem Boden der Probe macht. switch Durchlichtbeleuchtung und neuronale Fokusebene durch die Okulare finden.
6. Starten Lasersoftware und eine Verbindung mit dem Lasersteuerungssoftware. Set Beleuchtung Weitfeld ein und wählen Sie das Ziel verwendet wird (100X 1,49 NA TIRF wird empfohlen). Eingestellt Brechungsindex der Probe (Zellen ~ 1,38). Passen Laserintensität von "TTL" für die 491-nm-Laser deaktivieren. Stellen Sie den Schieberegler auf 100 dann bringen sie zurück nach unten auf einen Wert zwischen 20 bis 40%. Überprüfen Sie nochmals "TTL".
7. Konzentrieren Sie sich auf Probe wieder in Durchlichtbeleuchtung. Zum Imaging-Software und wählen Sie 491-nm-Laserbeleuchtung und offener Blende. Die Feineinstellung der Brennpunkt des Lasers an der Decke und in der Mitte den Punkt zu der Mitte des geschlossenen Feldblende mit dem Kühler entfernt. Legen Kondensator Oberseite nach unten auf der optischen Bank, um nicht zu kratzen Objektiv.
8. Ersetzen Kondensator und gehen Sie zu TIRF-Software und stellen Eindringtiefe (PD) bis 110 nm. Wechseln Sie von Weitfeld-Beleuchtung zu TIRF illumination Modus für die Bildgebung.
9. Finden VAMP2-phluorin Zellen durch die Okulare mit Weitfeld- Epifluoreszenz mit epifluoreszenten Lichtquelle zum Ausdruck.
   1. Justieren Sie Bildparameter (Belichtungszeit, Verstärkung und Laserleistung) zu maximieren Signal-Rausch-Verhältnis und der Dynamikbereich Intensität die minimale Belichtungszeit und Laser Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren (zum Beispiel: Exposition zwischen 50 bis 100 ms, mit einem 15 - 30 bei 30% gewinnen maximale Laserleistung).
   2. Stellen Sie den Serienautofokus pro Zelle. Erwerben Sie ein Timelapse Bild gesetzt mit dem Erwerb alle 0,5 Sekunden für 5 Minuten auftreten. Für die Netrin-1 stimuliert Zustand, 500 ng / ml Netrin-1 zu Schale von Zellen in einer Laminar-Flow-Haube und Rück die Schale in den Inkubator für 1 Stunde vor der Bildgebung.
10. Die Häufigkeit der Exozytose - Ereignisse pro Zelle Fläche und der Zeit, offen Bildstapel in ImageJ , indem Sie die Datei in das Fenster oder gehen Sie zu Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung normalisiert zu quantifizieren0; 2A Inset 1).
    1. Durchschnittliche Intensität: Um eine stabile Fluoreszenzsignale zu entfernen, die eine durchschnittliche z Projektion des gesamten Stapels mit Bild> Stapel> Z-Projekt> Projektionstyp nicht Vesikelfusion Ereignisse darstellen, erstellen. Subtrahieren dieses mittlere Bild von jedem Bild im Timelapse mit Prozess> Bild Rechner> Bild1: Ihr Stack-Betrieb: subtrahieren Image2 neu geschaffenen Durchschnitt z Projektion. Dies unterstreicht Exozytose - Ereignisse (2A Inset 2 - 3).
    2. Graf Exozytose-Fusionsereignisse mit dem Auge. Exozytose - Ereignisse werden als das Auftreten eines beugungsbegrenzten Fluoreszenzsignal definiert , das schnell diffundiert als VAMP2-phluorin diffundiert innerhalb der Plasmamembran (2A Inset 6).
    3. Verwenden Sie den Befehl Schwellenwert das erste Bild unter Verwendung von Bild zu markieren> Anpassen> Schwelle> einstellen Regler , bis die gesamte Zelle Schwelle markiert (2A Inset 7 - 8).
    4. Unter AnaLyze, wählen SetMeasurements und überprüfen Bereich und Anzeige Etikett. Wählen Sie den schwellenZellBereich mit dem Zauberstab - Tracing - Tool und klicken Sie auf 'm' zu messen (2A Inset 7 - 8).
    5. Transfer - sowohl die Exozytose - Fusionsereignisse zählen, die Zellbereichsmessungen und die verstrichene Abbildungszeit in ein Tabellenkalkulations Anzahl von Exozytose - Ereignisse / mm ² / Zeit (2A Inset 9) zu berechnen.

4. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Timelapse Mikroskopie von Axon Branching

Hinweis: Eine vollständige Protokoll und Demonstration für einen allgemeinen Ansatz zur DIC - Bildgebung ¹² zur Verfügung steht. Während dieses Protokoll DIC nutzt, andere Durchlichtmikroskopie Methoden für die gleichen Zwecke werden können (: Phasenkontrast zum Beispiel) verwendet.

1. Bei 2 DIV, Ort Glasboden Bildgebung Schale untransfizierten Neuronen in vorgewärmten Klimakammer, die eine feuchte env zu haltenironment mit 5% CO ₂ und 37 ° C. Nutzen Sie ein Mikroskop mit einem 60x Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC Objektivlinse und hoher NA Kondensator für beste Bildqualität und Auflösung.
2. Stellen Sie die Fokusebene zu finden Neuronen durch die Okulare Durchlichtbeleuchtung verwendet wird.
3. Mit Hilfe der Multizonen-Erfassungsfunktion auf Imaging-Software, zu finden und die XYZ-Positionen von mindestens 6 Zellen speichern. Positionieren Sie die Bühne, so dass Neuronen von Interesse passen in das Sichtfeld für die besten Ergebnisse.
   1. Stimulieren Sie mit 250 ng / ml Netrin-1 und drücken Sie "Start Multizonen-Akquisition". alle 20 s für 24 Stunden erwerben Sequenziell Bilder an jeder Position, pausieren Erwerb und Refokussierung wie nötig.
4. Überprüfen Sie Bilder in Imaging-Software Apps verwenden> Überprüfen Sie Multi Dimensional Daten> öffnen Dateinamen. Identifizieren stabiler Axon Zweige (20 & mgr; m lang), dass Form während der Imaging-Sitzung. Verwenden Sie die Linienzeichenwerkzeug eine stableaxon branc zu messenh von der Basis an der Axon an der Spitze, um sicherzustellen, die 20 & mgr; m Länge Qualifikation erfüllt ist.
   1. In einer Tabelle, die Rahmennummer nach Netrin Stimulation aufzuzeichnen, wenn Membranausstülpungen in Bereichen initiieren, wo Äste später sowie die Rahmennummer nach Netrin Stimulation bilden, wenn sie im Entstehen begriffenen Zweige 20 & mgr; m in der Länge erreichen.
   2. Multiplizieren Sie die Anzahl der Frames zwischen Vorsprung und Zweigbildung um 20 sec die Bildungszeit pro Zweig zu berechnen.

5. Toxin Manipulations und fixierte Zell Immunofluoreszenz

1. Bei 2 DIV, behandeln Neuronen in Versuchsbedingungen mit 250 ng / ml Netrin-1 und / oder 10 nM Botulinum A - Toxin (BoNT), die spaltet die SNARE - Protein SNAP25 und SNARE wirksam hemmt Exozytose ^13, plus 250 ng / ml netrin- 1. Lassen Sie eine Reihe von unbehandelten Neuronen als Kontrollbedingung.
   ACHTUNG: BoNTA erfordert den Einsatz von Augen und Atemschutz bei Herstellung und VerwendungLösungen. Pflegen Sie alle kontaminierten Materialien als infektiöses Material und Autoklaven so schnell wie möglich.
2. Bei 3 DIV (24 Stunden nach der Behandlung) absaugen Medien und sofort mit mindestens 1 ml PHEM fix (siehe Tabelle 1 für weitere Details) ersetzen erwärmt auf 37 ° C. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei RT.
3. Spülen Sie 3x mit PBS (für die zukünftige Verwendung Dichtung mit Parafilm und lagern bei 4 ° C).
4. Ort Deckgläser in dunklen, befeuchteten Färbung Kammer und Permeabilisierung der Zellmembranen für 10 min in frisch verdünnten 0,2% TritonX-100 in PBS (hergestellt aus 10% TritonX-100-Lager).
5. Entfernen Permeabilisierung Lösung und Spülen mit 50 ul 1x mit PBS. Block für 30 min in ~ 50 & mgr; l von 10% Rinderserumalbumin in PBS (BSA-PBS) oder 10% Gekochte Eselserum in PBS bei RT.
6. Spülen Sie mit 1x PBS wieder. Inkubieren Deckgläser in 50 & mgr; l des primären Antikörpers: in 1% BSA-PBS für 1 h bei RT (1 1.000 βIII Tubulin, neuronale Identität zu bestätigen), im Dunkeln.
7. Führen Sie 3x 5 min Waschen in PBS. Inkubieren Deckgläser in 50 ul spektral unterschiedliche Sekundärantikörper für Tubulin (1: 400), und Fluoreszenz Phalloidin (je nach Anregung: 488 Phalloidin bei 1: 400, 647 Phalloidin bei 1: 100) in 1% BSA-PBS für 1 Stunde .
8. Waschen 3x 5 min in 1x PBS und montieren Deck auf Objektträger in Montage Medien.
9. Vakuum überschüssige Eindeckmedien von den Rändern des Deckglases und Dichtung mit klarem Nagellack.
10. Sammeln Sie Weitfeld- Epifluoreszenz- Bilder auf einem inversen Mikroskop mit einem 40x 1.4NA Ziel, epifluoreszenten Fähigkeiten und EM-CCD.
    1. Manuell analysieren ImageJ Verzweigung verwenden. Öffnen Bildstapel in ImageJ indem Sie die Datei in das Fenster ziehen oder auf Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung 4A Einschub 1).
    2. Mit line> segmentierte Linie, verfolgen Sie die Axon, als die längste Neuriten erstreckt definiert von der soma (4A Einschub 2 - 3).
    3. Mit Analysieren> Tools> ROI-Manager, speichern Sie die Axon als eine Region von Interesse zu verfolgen. Trace und jedes Axon Zweig speichern, definiert als Neuriten ≥20 & mgr; m in der Länge. Nur primäre Zweige (Auswüchse direkt aus dem Axon sprießen) in der Analyse (Abbildung 4A Einsatz von 3 bis 4).
    4. Drücken Sie 'm' die gespeicherten Bereiche von Interesse zu messen und übertragen Längen in Pixeln in eine Tabelle, die Länge in & mgr; m zu berechnen.
    5. Unterteilen, die Anzahl der Zweige axon ≥20 um in der Länge, um die Länge des Axons in & mgr; m geteilt durch 100 Anzahl der Axon Verzweigungen pro 100 & mgr; m Länge erhalten.

Results

Verwendung in vitro biochemischen Techniken , um die Menge von SDS-resistenten SNARE - Komplexe in einer Population von Neuronen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt die resultierende Western - Blot nach Beendigung der SDS-resistenten SNARE - Komplex Assay für SNAP-25 sondiert, syntaxin1A und VAMP2.

TIRF - Mikroskopie an der basalen Zellmembran liefert hochauflösende Bilder von einzelnen Exozytose - Fusi...

Discussion

Die Axonverzweigung ist ein grundlegender Prozess der neurologischen Entwicklung und untermauert die enorme Neurokonnektivität des Nervensystems von Säugetieren. Das Verständnis der Mechanismen, die an der lokalisierten Plasmamembranexpansion beteiligt sind, ist ein wesentlicher Bestandteil unseres Verständnisses sowohl der normalen als auch der pathologischen Neuroentwicklung. Die Verwendung eines mehrgleisigen Ansatzes, der sowohl Methoden auf Populationsebene als auch auf Einzelzellebene umfasst, verbessert die Reprod...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mit 6-Well-Gewebekulturen behandelte Platten	Olympus Plastics	25-105
Deckgläser aus Glas	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; müssen 24 Stunden lang mit Salpetersäure behandelt, 2x in DI-Wasser gespült und vor der Verwendung getrocknet werden. Muss vor dem Plattieren der Zellen mit 1 mg/ml Poly-d-Lysin beschichtet und gespült werden.
Amaxa Nukleofektionslösung	Lonza	VPG-1001	100 ml/Transfektion
Amaxa Nukleofektor/Elektroporator	Lonza		Programm O-005
35 mm Bildgebungsschalen mit Glasboden für lebende Zellen	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	muss vor dem Plattieren der Zellen mit 1 mg/ml Poly-d-Lysin beschichtet und gespült werden
Olympus IX81-ZDC2 inverses Mikroskop	Olympus
Lambda LS Xenon-Lampe	Sutter Instruments Company
Environmental Stage Top Inkubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF Objektiv	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Wird zum Scannen von Blots
verwendet Bildstudio Software-Suite	LI-COR		Wird zum Scannen auf dem Odyssey Infrarot-System verwendet; Image Studio Lite für die Offline-Analyse von Blots
Metamorph für Olympus	Molecular devices, LLC	Version 7.7.6.0	Software für die gesamte Bildgebung und die Analyse von DIC-Zeitraffern
CELL TIRF-Steuerungssoftware	Olympus		Software zur Steuerung von Lasern für die TIRF-Bildgebung
Fidschi (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA Objektiv	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat Objektiv	Olympus
Neurobasales Medium	GIBCO	21103-049	Basislösung für serumfreies und Trypsin-Quenching-Medium
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum-freies Medium und Trypsin-Quenching-Medium
L-Glutamin		35050-061	1 ml/50 ml Serum-freies Medium
Rinderserumalbumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10%ige Lösung in 1x PBS zum Blockieren von Deckgläsern; 5%ige Lösung in TBS-T zum Blockieren von Nitrozellulosemembranen.
10x  Trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fötales Rinderserum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallat	MP Biomedicals	102747
Glycerin Photometrische Qualität	Acros Organics	18469-5000
Glycerin (nicht optische Qualität)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Destilliertes Wasser	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysin	Sigma	p-7886	Gelöst in sterilem Wasser bei 1 mg/ml
Botulinum-A-Toxin BoNTA-Liste	Biologische Laboratorien	128-A
Kaninchen polyklonales anti-humanes VAMP2-Zell-Signalgebung		11829
Monoklonales Anti-Ratten-Maus-Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnologie	sc-12736
Ziege polyklonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Maus monoklonal anti human β III-Tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 und Alexa Fluor 488 Phalloidin oder Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-Farbstoff Sekundärantikörper	LI-COR	P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 Esel Anti-Maus, 680 Esel Anti Kaninchen, 680 Esel Anti Ziege
0.2 μ m Porengröße Nitrozellulosemembran	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Saccharose	Fisher	scientific S6-212
Paraformaldehyd	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimid	Fisher	scientific BP1408-1
Name	Unternehmen	Katalognummer	>Comments
Alternative validierte Antikörper
Maus Monoklonaler Anti-Syntaxin HPC-1-Klon	Sigma Aldrich	S0664
Monoklonales Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptische Maussysteme	104-211
Monoklonales Maus-SNAP25-Synaptische	Systeme	111-011