Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Zusammenfassung

Hier beschäftigen wir FISH - Methodik LINE-1 - Retrotransposition an der einzelnen Kerne Ebene in Chromosom Spreads von HepG2 - Zelllinien stabil synthetischen LINE-1 exprimieren , zu verfolgen.

Zusammenfassung

Lange eingestreutes Kernelement-1 (Linie-1 oder L1) macht etwa 17% der im menschlichen Genom vorhandenen DNA aus. Während die Mehrheit der L1s aufgrund von 5'-Trunkierungen inaktiv ist, bleiben ~80-100 dieser Elemente retrotranspositionskompetent und vermehren sich über RNA-Zwischenprodukte an verschiedene Stellen im Genom. Während man davon ausgeht, dass ältere L1-Moleküle auf AT-reiche Regionen des Genoms abzielen, sind die chromosomalen Ziele neuer, aktiverer L1-Moleküle nach wie vor schlecht definiert. Hier beschreiben wir die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (FISH), die verwendet werden kann, um Muster der L1-Insertion und die Raten des ektopischen L1-Einbaus auf Einzelkernebene zu verfolgen. In diesen Experimenten wurden Fluorescein-Isothiocyanat/Cyanin-3 (FITC/CY3)-markierte Neomycin-Sonden verwendet, um die L1-Retrotransposition in vitro in HepG2-Zellen zu verfolgen, die ektopisches L1 stabil exprimieren. Diese Methodik verhindert Fehler bei der Schätzung der durch Toxizität verursachten Retrotranspositionsraten und berücksichtigt das Auftreten mehrerer Insertionen in einen einzigen Zellkern.

Einleitung

Menschliche Lange streute Kern Element-1 (Linie-1 oder L1) ist eine autonome mobile Element , das durch eine im Genom ausbreitet "Kopieren und Einfügen" Retrotransposition Mechanismus. Ein typisches menschliches L1 ~ 6 kb lang und besteht aus einer 5' - UTR (untranslatierte Region), die als Promotor dient, zwei offene Leserahmen (ORFs): L1 -ORF1 und L1 -ORF2 und eine 3'UTR mit einem polyA . Schwanz L1 -ORF1 Protein hat drei verschiedene Bereiche: eine Spule-Coil - Domäne, RNA - Erkennungsmotiv und C-terminale Domäne, während L1 -ORF2 Protein Endonuklease hat, reverse Transkriptase und Cystein reic....

Protokoll

HINWEIS: Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn nicht anders angegeben. Bitte beachten Sie Reagenzien für Details auf, wie einzelne Reagenzien herzustellen.

1. Kennzeichnung L1 Probes

HINWEIS: Die Sonden können durch chemische oder PCR-Kennzeichnung versehen werden.

1. chemische Markierung
   1. Machen 0,7-1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer, Wärme in einer Mikrowelle, bis sie geschmolzen, erlauben das Gel abkühlen, und fügen Ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Gießen Sie in Gelträger, fügen Sie Kämme und lassen Sie das Gel bei Raumtemperat....

Ergebnisse

Ein schematisches Diagramm des L1 Retrotransposition Vektors ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Vektor besteht aus einem Neomycin - Gen in Antisense - Orientierung zu L1 ORFs , die durch ein Globin - Intron in Sense - Orientierung und sandwichartig von SD und SA Seiten unterbrochen ist. Wenn stabil in ein Chromosom integriert ist L1 mRNA aus dem kombinierten CMV transkribiert und L1-5'UTR Promotor (Abbildung 1). Während RN.......

Diskussion

Methodiken wie Sequenzierung ganzer Genome, inverse PCR und Southern - Blotting wurden zu studieren L1 Retrotransposition eingesetzt. Obwohl diese Methoden äußerst wertvoll sind , bei der Suche nach dem L1 Einfügungen treten innerhalb von Genomen, eine verwirrende Herausforderung für alle von ihnen ist die Notwendigkeit für die In-silico - Programmierung zu Sequenzen wieder zusammen. Die FISH - Methodik hier beschrieben entwickelt , um diese Methoden zu ergänzen, insbesondere im Fall von Studi.......

Materialien

Vorbereitung von Chromosomen-Spreads

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Markierungssonden
Go Tag DNA-Polymerase	Promega	M3178
GO Tag 10x farbloser Puffer	Promega	M3178
Individual dNTP	Sigma	DNTP10	Passen Sie die Konzentration von dATP, dGTP, dCTP auf 2  mM und dTTP bis 1,5  mM in nukleasefreiem Wasser.
dUTP-16-Biotin (0,5  mM)	Roche	11093070910
dUTP-FITC (0,5  mM)	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3 (0,5  mM)	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH Markierungskit	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH Markierungskit	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR Clean-Up Kit	Qiagen	1410/0030	Jedes PCR-Reinreagenz kann anstelle des NucleoSpin PCR Clean Up Kit
PCR-Geräts			verwendet werden. Jedes Thermocycler-Gerät kann zur Amplifikation des Etikettenprodukts verwendet werden.
Agarose	Sigma	A9539<
Colcemid	Life Technologies	15212-012	Colcemid direkt zu Wachstumsmedien bis zu einer Endkonzentration von 0,4 μ2 zugeben; &Mikro; g/ml
1  M KCl	Sigma	P9541	Verdünnung 1  M KCl-Lösung bis 75  mM Lösung zur Herstellung der hypotonischen Lösung
Carnoy Fixierlösung			Mischen Sie 3 Volumen Methanol und 1 Volumen Essigsäure, um die Carnoy Fixierlösung herzustellen. Machen Sie es jedes Mal frisch.
Methanol	Sigma	322415
Essigsäure	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Lösen Sie Hoechst-33342 in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1  mg/ml.
Diamant-Punktmarkierer	Thermo Scientific	750
Frosted Slides	Thermo Scientific	2951-001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	R001100	Um Zellen zu detechnieren, inkubieren Sie die Zelle 5 Minuten lang in Trypsin und inaktiv mit dem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.
Objektträger	VWR	48366067
Coplin Dosen	Thermo Scientific	107
Wärmeblock			Wärmeblock kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl Blöcke empfohlen werden, die für Heizobjektträger geeignet sind.
Becher (600  ml)	Sigma	CLS1003600	Füllen Sie das Becherglas mit Wasser, erhitzen Sie es zum Kochen, verwenden Sie den heißen Dampf, um die Chromosomen zum Platzen zu bringen.
Nikon Mikroskop	Nikon	125690	Jedes Mikroskop kann verwendet werden, um die Spread-Qualität zu betrachten.
Reagenzien und Materialien für FISH
Trinatriumcitrat	Sigma	S1804
Natrium Chroride	Sigma	S3014
Formamid	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
Detran Sulfat	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
Lachs Sperma DNA	Life Technologies	15632-011
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A8531
HCl (N)	Sigma	38283
Ethylalkohol	Sigma	459844
Methanol	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
Rnase A	Sigma	R4642
Pepsin	Sigma	P6887
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	Hoechst-33342 in PBS auflösen bis zu einer Endkonzentration von 1  mg/ml.
Gummizement/Cytobond-Dichtstoff		1.00.2020
Seven Coplin Gläser	Thermo Scientific	107
Dunkle Befeuchtete Kammer	Sigma	CLS2551
Objektträger	VWR	48366067
Dry Digital Heat Block	VWR	13259
Fluoreszenzmikroskop
20x Kochsalz-Natriumcitrat (20x SSC)			Kombinieren Sie 175 g NaCl und 88,2 μμl; g Trinatriumcitrat mit 800 ml H2O. Unter Einstellung auf pH 7 umrühren. Sobald sich alle Salze aufgelöst haben, stellen Sie das Volumen auf 1 l ein und filtern Sie durch 0,22 & Mikro; m Filterpapier. Bei 4 °C lagern.
1  mg/ml Rnase A			20x SSC-Puffer auf 2x SSC-Puffer verdünnen. RNase A in 2x SSC-Puffer auf eine Endkonzentration von 1  mg/ml. Stellen Sie jedes Mal eine frische Lösung her.
1% Pepsin Pepsin			(W/V) in 10 mM HCl bis zu einer Endkonzentration von 1% iger Lösung auflösen. Jedes Mal frisch machen.
4% Paraformaldehyd (4% PFA)			4,0 g PFA im Abzug abwiegen, 50 ml 1xPBS zugeben, auf 60  erhitzen; ° C unter Rühren und stellen Sie den pH-Wert mit Tropfen NaOH ein, bis sich das gesamte PFA aufgelöst hat und die Lösung klar wird. Stellen Sie die Lautstärke auf 100  ein ml, Filter durch 0,22 &Mikro; m Filtern Sie das Papier und lagern Sie 5 ml Aliquots bei -20  °C. Auftauen aliquot von PFA bei 37 ° C für 10-15 min für spätere Anwendungen. Passen Sie die Filtergröße in Abhängigkeit von der Menge an Paraformaldehyd an.
Wash Buffer			Kombinieren Sie 100 ml Formamid (20%) mit 2,5 ml 20x SSC, stellen Sie es mit 1,0 M HCl auf pH 7 ein und bringen Sie das Volumen auf 500 ml mit H2O.
Hybridisierungspuffer			Kombinieren Sie 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 0,1 % SDS und 300 ng/ml Lachsspermien-DNA in 2x SSC-Puffer. Die Menge an Formamid bestimmt, wie fokussiert die Chromatiden sind; Titrieren Sie den Betrag.
Nachweispuffer			Verdünnen Sie den 20-fachen SSC-Puffer auf das 4-fache und fügen Sie 0,2 % Tween-20 hinzu, um einen Nachweispuffer herzustellen.
Kombinieren			Sie 5 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,2 % Tween-20 in 4x SSC-Puffer.
Dehydratisierungslösung			Stellen Sie 70 %, 80 % und 95 % ige Ethanollösungen her.

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