Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkripten auf genomweiter Basis. Aus diesem Grund bietet dieses Protokoll ein optimiertes technisches Verfahren in einem zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarray unter Verwendung von Rinderembryonen am Tag 7, um die Machbarkeit der Verwendung einer geringen Menge an Gesamt-RNA zu demonstrieren.
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Methodenartikel
Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Die
Zusammenfassung
Frühlicher Embryonalverlust trägt wesentlich zur Unfruchtbarkeit bei Rindern bei. Darüber hinaus wird das Rind aufgrund seines ähnlichen Entwicklungsprozesses zu einem interessanten Modell für die Untersuchung der Präimplantationsembryonalentwicklung des Menschen. Obwohl bekannt ist, dass genetische Faktoren die frühe Embryonalentwicklung beeinflussen, war die Entdeckung solcher Faktoren eine ernsthafte Herausforderung. Die Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkriptspiegeln auf genomweiter Basis. Eine der wichtigsten Entscheidungen, die bei der Planung eines Microarray-Experiments getroffen werden müssen, ist die Frage, ob ein ein- oder zweifarbiger Ansatz verwendet werden soll. Das zweifarbige Design erhöht die technische Replikation, minimiert die Variabilität, verbessert die Empfindlichkeit und Genauigkeit und ermöglicht Loop-Designs, die die gemeinsamen Referenzproben definieren. Obwohl Microarrays ein mächtiges biologisches Werkzeug sind, gibt es potenzielle Fallstricke, die seine Leistungsfähigkeit schwächen können. Daher demonstrieren wir in diesem Fachbeitrag ein optimiertes Protokoll für die RNA-Extraktion, Amplifikation, Markierung, Hybridisierung der markierten amplifizierten RNA mit dem Array, Array-Scanning und Datenanalyse unter Verwendung der Zwei-Farben-Analysestrategie.
Einleitung
Frühe embryonale Verlust in hoher produzierenden Milchkühe ist eine der größten Herausforderungen in der Milchindustrie 1, 2. Bovine hat sich ein interessantes Modell menschlichen preimplantation Embryoentwicklung zu studieren aufgrund ihrer ähnlichen Entwicklungsprozess 3, 4. Jedoch ist mehr Forschung erforderlich besseres Verständnis über Gene in bovinen frühen Embryonalentwicklung beteiligt zu haben.
Nach zwanzig Jahren seit Technologie der ersten Microarray 1995 entwickelte 5, ....
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Protokoll
Das Tier Teil dieser Studie wurde an der Metabolic Research Unit der University of Alberta, Edmonton, Kanada, mit allen tierexperimentellen Verfahren genehmigt (Protokoll # AUP00000131) von der University of Alberta Animal Care und Use Committee, geleitet und Tiere betreut nach an den Canadian Council of Animal Care-Richtlinien (1993).
1. Embryo Produktion, Isolierung von Gesamt-RNA und DNase-Behandlung
- Für die Tierversuchsprotokolle und Embryo - Entnahme beziehen sich in unseren bisherigen Publikationen 17, 18.
- Pool und Snap einfrieren ähnliche Stufe Embryonen aus jeder Kuh in fl....
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Ergebnisse
Ein repräsentatives Ergebnis der Gesamt - RNA und verstärkt aRNA von Tag 7 Rinderembryonen ist in Abbildung 3 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt.
RNA-Integrität und das Profil kann nach der RNA-Extraktion beurteilt werden. Qualitätsbewertung von RNA könnte durch Bioanalyzer (3A) und nur diesen Proben mit RIN - Wert höher als 7,0 sind qualifiziert werden verwendet für.......
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Diskussion
Das erste Problem, Microarray-Analyse unter Verwendung von Tag 7 Rinderembryonen durchzuführen, ist nicht ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA immer Genexpression für das Studium. Traditionellen Phenol / Chloroform-RNA-Extraktion und Ethanol-Fällungsverfahren ist nicht für den Tag 7 Embryonen empfohlen, was zu einer geringen Ausbeute und mögliche Überbleibsel phenol inhibierende RNA-Amplifikationsreaktion. Stattdessen wird eine Standard-Spalte-basierte Methode ist besser Gesamt-RNA zu isolieren und dann di.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Forschung unterstützt von Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PicoPure RNA-Isolationskit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-freies DNase-Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA-Siebband | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluoreszenz-Markierungskit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Kundenspezifische Genexpressions-Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Genexpressions-Waschpuffer 1 | Agilent Technologies | Teil #5188-5325 | |
| Agilent Genexpressions-Waschpuffer 2 | Agilent Technologies | Teil #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridisierungspuffer | Agilent Technologies | Teil #5190-0403 | |
| 25x Fragmentpuffer | Agilent Technologies | Teil #5185-5974 | |
| 10x GE Blocker | Agilent Technologies | Teil #5188-5281 | |
| Stabilisierungs- und Trocknungslösung | Agilent Technologies | Teil #5185-5979 | |
| Dichtungsschieber aktiviert durch Agilent SureHyb-Technologie | Agilent Technologies | G2524-60012 | Packung mit 20 Dichtungsschiebern, 4 Microarrays/Objektträger |
| Zweifarbiges RNA-Spike-In-Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B Array-Scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 GAL-Datei | |
| Agilent Technologies | - |
Referenzen
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
