Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion

10.3K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/53758

⸱

22. Januar 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein biochemisches und verhaltensbezogenes Protokoll zur Bewertung der Wirksamkeit von wasserlöslichen Verbindungen, die auf Mitochondrien abzielen, zur Behandlung von spinozerebellärer Ataxie Typ 1 (SCA1) und anderen zerebellären neurodegenerativen Erkrankungen.

Zusammenfassung

Mitochondriale Dysfunktion spielt eine bedeutende Rolle im Alterungsprozess und bei neurodegenerativen Erkrankungen, darunter mehrere erbliche Spinozerebelläre Ataxie und andere Bewegung durch eine progressive Degeneration des Kleinhirns markierten Störungen. Das Ziel dieses Protokolls ist mitochondriale Dysfunktion in spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) und Bewertung der Wirksamkeit von pharmakologischen Targeting von Stoffwechselatmung über die wasserlösliche Verbindung Bernsteinsäure zu beurteilen, Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen. Dieser Ansatz ist auf andere cerebellar Krankheiten und kann zu einer Vielzahl von wasserlöslichen Therapien angepasst werden.

Ex - vivo - Analyse der mitochondrialen Atmung wird verwendet , um zu erkennen und krankheitsbedingte Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien zu quantifizieren. Mit genetischen Beweis (nicht veröffentlichte Daten) und Proteomik Beweise für mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 Mausmodell bewerten wir die Wirksamkeit der Behandlung mit dem wasserlöslichen metabolischen Booster succinic Säure durch diese Verbindung direkt in den Käfig Trinkwasser auflösen. Die Fähigkeit des Medikaments, die Blut-Hirn-Schranke passieren kann mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) abgeleitet werden. Die Wirksamkeit dieser Verbindungen können dann mehrere Verhaltensparadigmen einschließlich der Beschleunigungs Rotarod, Schwebebalken Test und Fußabdruck-Analyse unter Verwendung getestet werden. Cytoarchitectural Integrität des Kleinhirns kann mit Immunfluoreszenztests bewertet werden, die Purkinje Zellkerne und Purkinje Zelle Dendriten und soma erkennen. Diese Verfahren sind robust Techniken zur Bestimmung mitochondriale Dysfunktion und die Wirksamkeit der Behandlung mit wasserlöslichen Verbindungen in cerebellar neurodegenerative Erkrankung.

Einleitung

Mitochondrien sind die wichtigsten Produzenten von Adenosintriphosphat (ATP), ein essentielles Coenzym für die Zellenergie, mit der Mehrheit der mitochondrialen ATP durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt die Elektronentransportkette verwendet wird. Das Gehirn, angesichts der hohen metabolischen Anforderungen und sein Vertrauen auf die oxidative Phosphorylierung für neuronale Aktivität antreibt, ist auf mitochondriale Dysfunktion sehr anfällig. Als Ergebnis wird die mitochondriale Funktionsstörung während des Alterungsprozesses ausgelöst 1 und ist in die Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen 2, 3, 4 gebracht. Daraus folgt, dass Mitochondrien attraktive therapeutische Ziele für die Neurodegeneration sind.

In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) als Modell neurodegenerative Erkrankung zur Untersuchung von Mitochondrien angenommenenl Dysfunktion und die Entwicklung der Mitochondrien zielgerichtete Therapien. SCA1 wird durch eine Polyglutamin (polyQ) Repeat - Expansion Mutation im Ataxin-1 - Genprodukts verursacht , die progressive Degeneration der Purkinje - Neuronen des Kleinhirns löst und Neuronen aus anderen Hirnregionen. Die transgene Mauslinie hier (bezeichnet als SCA1 Maus) verwendet, die eine polyQ-Mutante unter der Kontrolle einer Purkinje-Zelle spezifischer Promotor Ataxin-1 - Transgen exprimiert, ermöglicht die gezielte Analyse der Purkinje-Zellkomponente von SCA1 5. SCA1 Mäuse unterziehen allmähliche Purkinje Zelldegeneration und entwickeln ataxic Gangart 6.

Mitochondriale komplexe Dysfunktion und mitochondriale gezielte Wirksamkeit der Behandlung kann mit einer Batterie von molekularen und Verhaltenstests bewertet werden. Mitochondriale komplexe Dysfunktion gemessen ex vivo durch die Atmung Assays , die veränderte Sauerstoffverbrauch innerhalb des Kleinhirns Gewebe erkennen indas Vorhandensein von Elektronentransportkette Substrate und Inhibitoren 7. Respiration Assays mit permeabilisierten Gewebe, mitochondriale Isolate und ganze Gewebe 7, 8, 9 verwendete vorher. Sie ermöglichen eine direkte Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Gegensatz zu morphologischen Methoden der Datenerhebung wie Transmissionselektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenzanfärbung. Die Verwendung von ganzen Gewebe anstatt isolierten Mitochondrien verhindert vorgespannte Auswahl an gesunden Mitochondrien , die 7 während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Wenn das Protokoll angepasst, wie dargestellt, ist die Atmungs Assay eine wertvolle Methode für mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheitszustände zu detektieren.

Die nicht-spezifische Aktivatoren des Stoffwechsels verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion in transgenen Mäusen Modellen neurodegenerativer diseas ableitene und die Hilfe bei der Entwicklung neuer Therapien. Quercetin, Coenzym Q10 und Kreatin wurden alle neurodegenerative Krankheitspathologie in Patienten und in Tiermodellen für neurodegenerative Krankheits 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 verbessern gezeigt. Hier stellen wir eine neue Stoffwechselaktivator, Bernsteinsäure, den Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondrien bei neurodegenerativen Erkrankung steigern. Um sicherzustellen , dass der Aktivator die Blut - Hirn - Schranke überquert, wurde HPLC verwendet Lieferung an Nervengewebe zu erkennen , in behandelten Mäusen 17.

Um die therapeutischen Wirkungen von metabolisch gezielte wasserlösliche Verbindungen, wie Bernsteinsäure, eine Batterie von Verhaltensparadigmen und immunpathologische Studien bewerten können verwendet werden. Due zu den in Kleinhirns neurodegenerative Erkrankung gefunden Defizite der motorischen Koordination, sind der Ausleuchtzone Runway - Assay, Strahl - Assay und Beschleunigung rotierenden Stab - Test verwendet 6 Rettung von Verhaltens Pathologie zu erkennen, 18, 19. Diese Maßnahmen sind mit immunopathologischen Beurteilung cerebellar Zytoarchitektur ergänzt durch molekulare Schichtdicke (definiert als Purkinje Zelle dendritischen Dorn Länge) Beurteilung und Purkinje Zellsoma Zählwerte innerhalb eines definierten lobule von zerebellären Gewebe 6, 20, 21. Hier präsentieren wir mehrere neuropathologischen und Verhaltens Methoden zur Erkennung und Behandlung von mitochondriale Dysfunktion mit metabolisch gezielt wasserlösliche Verbindungen.

Wir verwenden ex vivo Analyse der mitochondrialen Atmung mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 tran zu analysierensgenic Maus. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Krankheitssymptome und Pathologie durch die wasserlöslichen mitochondrialen Booster Bernsteinsäure verbessert werden, weitere mitochondriale Dysfunktion in SCA1 Krankheitsprogression Verwicklung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den IACUC Richtlinien bei Skidmore College für mit Mäusen arbeiten.

1. Die Behandlung mit wasserlöslichen Verbindungen

  1. Auflösen Bernsteinsäure in einer Konzentration von 0,75 mg / ml in cage Trinkwasser. Beachten Sie, dass jedes wasserlösliche Verbindung von Interesse in der gewünschten Konzentration in diesem Stadium ersetzt werden könnte. Stir-Lösung, um sicherzustellen, dass die Verbindung vollständig gelöst ist.
  2. Nach Mäusen, denen das gewünschte Alter der Behandlung zu erreichen, ersetzen Sie den Käfig Trinkwasser der Behandlungsbedingung Gruppe mit der Lösung in Schritt 1.1.
  3. Messen Sie das Gewicht beider Behandlungs- und Kontrollgruppe Wasserflaschen täglich, um sicherzustellen, dass beide behandelten und Kontrollmäusen die gleiche Menge an Wasser trinken. Verwenden Sie diese Messungen gesamten Wirkstoffdosis pro Käfig zu berechnen. Fortsetzung der Behandlung während des gesamten Experiments und Monitor Flaschengewicht.

2. Footprint-Analyse

  1. Legen Sie die Start- und Landebahn auf den Boden odereine Tabelle, in einem geschlossenen Raum. Stellen Sie die Start- und Landebahn in einem leichten Winkel nach oben in Richtung der Heimat - Box mit Bettwäsche und Belohnung Nahrung gefüttert (zB zuckerhaltig Getreide). Zeichnen Sie die Länge der Start- und Landebahn mit einem weißen Blatt Papier. Lassen Sie das Thema in der Heimat-Box für 5 min zu akklimatisieren.
  2. Entfernen Sie das Thema aus dem Hause Box und malen linken und rechten Hinterfüße jeweils mit blauen und roten ungiftig Farbe auf Wasserbasis. Die Farbdrucke verwendet werden, um mehrere Ausgangsverhaltensmessungen berechnen.
  3. Platzieren Sie das Motiv am Anfang der Piste und lassen Sie das Thema zu Hause Feld zu gehen. Sobald das Thema für die Heimfeld erreicht hat, schließen die Falltür, und lassen Sie den Gegenstand für eine Minute im Heimfeld zu bleiben, bevor sie an den jeweiligen Heimat Käfig zurück. Reinigen Sie die Start- und Landebahn und Home-Box mit 30% Ethanol und ersetzen Sie die Bettwäsche, belohnen Essen und Landebahn Papier für das nächste Thema.
  4. Quantifizierung Anzahl von Schritten, die Breite des Gatters, Winkel der Stufe und Anzahl der Windungen ergriffennach Thema nach den analytischen Methoden bisher 6 beschrieben. Eine erfolgreiche Fußabdruck Studie wird als ein Minimum von 5 aufeinanderfolgenden Fußspuren definiert, in dem sich das Objekt ohne sich umzudrehen Richtung Tor Box zu Fuß oder zu stoppen.

3. Strahlanalyse

  1. Richten Sie Strahlgerät nach den Stabquer Spezifikationen zuvor beschriebenen 6 mit den folgenden 6 Balken: Balken 1 = rechteckig, 28 mm Breite; Strahl 2 = rund, 28 mm Durchmesser; Strahl 3 = rechteckig, 12 mm Breite; Strahl 4 = rund, 12 mm Durchmesser; Strahl 5 = rechteckig, 6 mm Breite; 6 Balken = rund, 6 mm Durchmesser. An einem Ende des Balkens, stellen Sie einen abgedunkelten Heimfeld mit Belohnung Nahrung auf.
  2. Um Themen auf dem Balken zu trainieren, montieren die Vorrichtung mit Strahl 3. Ziehen Sie platzieren das Motiv auf dem Ende des Trägers gegenüber dem Heimfeld und lassen Sie das Thema über zu gehen. Lassen Sie jedes Thema bis zu drei 2-min Studien, die einen erfolgreichen Lauf zu erreichen, Definiert als der Strahl und Eingabe der Home Box innerhalb von 2 min kreuzen. Dazwischen Studien für 2 min, das Thema Erholung in der Heimat-Box lassen. In zwischen den Themen, reinigen Sie den Strahl und Home-Box mit 30% Ethanol und ersetzen Sie die Belohnung Essen in Vorbereitung auf das nächste Thema.
  3. Wiederholen Sie Schritt 3.2 einmal pro Tag für die nächsten zwei Tage in insgesamt drei aufeinanderfolgenden Trainingstagen zur Folge hat. Der Testtag, Tag 4, sollte der Reihe nach die Trainingstage folgen.
  4. Um zu testen, die Themen am Tag 4, montieren zunächst die Vorrichtung mit Balken 1 und die Heimfeld einrichten, wie in Schritt 3.1 beschrieben. Legen Sie eine Videokamera vor dem Gerät und stellen Sie sicher, dass die volle Strahlgerät deutlich auf Video festgehalten werden. Starten Sie die Aufnahme und legen Sie das erste Thema auf dem Balken gegenüber dem Heimfeld, so dass bis zu drei 2-min Versuche, um erfolgreich eine Studie abzuschließen. Dazwischen Studien lassen für 2 Minuten im Heimfeld Rest Thema.
  5. Weiter zu testen Thema auf jeder der sechs Strahlen in numerischer Reihenfolge,so dass das Motiv für 2 Minuten in die Heimat Feld zur Ruhe, bevor der nächste Strahl beginnt. Zwischen Themen, reinigen jeden Strahl und das Heim-Box mit 30% Ethanol und ersetzen für jedes Fach die Belohnung Essen in Vorbereitung.
    1. Videokassette jeder Versuch und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen Versuche pro Fach pro Strahl wie folgt: '1' zeigt das Thema auf dem ersten Versuch erfolgreich war, "2" zeigt das Motiv auf dem zweiten Versuch erfolgreich war, "3" zeigt das Thema war erfolgreich auf der dritten und letzten Versuch, und "4" zeigt das Thema auf einer der drei Versuche nicht erfolgreich war.
  6. Verwenden Sie Videoaufnahmen von Studien messen footslips von scorers, die den experimentellen Bedingungen des Subjekts geblendet werden. Definieren Sie eine footslip als Rückfuß, die in direktem Blick auf die Kamera Tauchen unterhalb einer theoretischen Mittellinie über die gesamte Länge des Balkens ist. Durchschnittlich footslip Noten von mehreren scorers.
  7. Um die Anzahl der s analysierenuccessful Studien und die Anzahl der footslips Daten, den Mittelwert und Standardabweichung in jedem Genotyp und experimentellen Bedingungen Kohorte. Zuführen one-way ANOVA und multiple Vergleiche post-hoc - Analyse , um zu bestimmen , ob es eine Wirkung der Behandlung und Genotyp von der Anzahl von erfolgreichen Versuchen und der Anzahl der footslips ist.

4. Beschleunigte Rotarod

  1. Akklimatisieren Themen zum Testraum 10 Minuten vor dem Beginn der Studie. Während dieser Eingewöhnungszeit, bereiten Sie die RotaRod Gerät, jede Spur der Vorrichtung mit 30% Ethanol reinigen.
  2. Öffnen Sie die RotaRod Software und stellen Einstellungen bis 4 min, Beschleunigung Einstellungen bis 5 min und Endgeschwindigkeit Einstellungen bis 40 Umdrehungen pro Minute starten. Diese Einstellungen sorgen für eine konstante Beschleunigung 4-40 Umdrehungen pro Minute über einen Zeitraum von 5 min. Mäuse können für weitere 5 min über die Beschleunigungsperiode für eine maximale Lauflänge von 10 min bei 40 rpm auf dem Rotarod bleiben.
  3. Post-Akklimatisierung Ort Themen onto dem Rotarod in ihren jeweiligen Bahnen, während der Stab bei 4 rpm dreht. Sobald alle Fächer in ihren jeweiligen Bahnen sind, beginnen die ersten Versuch. Notieren Sie sich die Latenzzeit mit der Gerätesoftware zu fallen; eine sekundäre Zeitgeber kann als Backup verwendet werden.
  4. Nach Abschluß der klinischen Prüfung, lassen jedes Thema ruhen in ihren jeweiligen Fahrspur Reservoire für zehn Minuten vor dem nächsten Versuch Ermüdung zu verhindern.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 und 4.4 für insgesamt vier Studien.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 für insgesamt vier aufeinander folgenden Tagen, Fortsetzung der Behandlung während des gesamten Versuchszeitraums. Nach der Fertigstellung quantifizieren Latenz der Drehstab für jeden Versuch pro Objekt 6 zu fallen.

5. Zerebelläre Extraktion und Fixierung

  1. Euthanize Mäuse über Erstickung Kohlendioxid nach institutionellen IACUC Richtlinien. Legen Gegenstand in die Kohlendioxidkammer, und lassen Sie Kohlendioxid in die Kammer. Uhrdas Tier jederzeit während des euthanizing Schritt und lassen Sie nicht das Tier unbeaufsichtigt.
  2. Sobald die Atmung aufgehört hat und Spender zeigten keine Wahrnehmung verbleibenden Schmerzen, die durch Hinter Fußdruck, Gegenstand aus der Kammer zu entfernen und eine überragende Mittelschnitt durch das Epithelgewebe aus der Mitte des Schädels kaudal an der Basis des Schädels durch Epithelgewebe machen.
  3. Mit Dissektion Schere, schneiden Sie den Schädel von der Basis am Rückenmark durch die Pfeilnaht zu Bregma. Schneiden seitlich durch jede Kranznaht vor der Stirn-, Scheitel- und interparietal Knochen mit stumpfen Pinzette abziehen.
  4. Verwenden Sie stumpfen Pinzette Knochen lateral des Kleinhirns zu brechen. Verwenden einer Pinzette, das Kleinhirn von der Colliculi und brainstem zu trennen und zu extrudieren sie vom Rest des Gewebes. Trennen Sie das Cerebellum in linke und rechte Hemisphäre mit einer Pinzette.
  5. Unmittelbar rechts cerebelli in flüssigen Stickstoff Platz für HPLC ana zu sparenLyse und linken cerebelli in vorgekühlte 4% Paraformaldehyd (PFA) zur Gewebefixierung. Ernten Sie andere Gewebe von Interesse vor der Aorta Abtrennen und Verwerfen der Karkasse nach institutionellen IACUC Regeln.
    ACHTUNG: PFA ist ein hochgiftiges, entzündlich und korrosiv.
  6. Vierundzwanzig Stunden nach der Extraktion, Waschen Gewebe in PFA fixiert (4% in PBS) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (dreimal 5 min / Wäsche), bevor das Gewebe in 30% Saccharose bei 4 ° C für bis zu platzieren 2 Wochen.

6. Immunopathologie Assay

  1. Befestigen Sie den Schlauch von einem Schlitten Mikrotom zu einem Waschbecken Wasserhahn und einer Temperaturregelung Feld. Verwenden Sie die Temperaturregelung Feld das Mikrotom Stufe auf -25 ° C abkühlen lassen. Stellen Sie die Schnittdicke Wahl bis 50 um.
    HINWEIS: Wenn das Rad auf dem Schlitten Mikrotom nicht mehr als 50 & mgr; m erreichen, das Wählrad auf eine dünnere Einstellung und multiplizieren Sie die Dicke, die durch die Einstellung entsprechend verschieben (zum Beispiel festgelegt, die dial bis 10 um und fünfmal verschieben , bevor für eine Gesamtdicke von 50 & mgr; m sectioning).
  2. Dab einen Dime-Größe Teil der optimalen Temperatur Cutting (OTC) Lösung auf die Bühne. Bevor der OTC friert, verwenden Pinzette die Hemisphäre zu positionieren, so dass die mittsagittale Schnittfläche auf der OTC-Schicht nach unten zeigt. Arbeiten schnell orientieren sanft das Gewebe mit einer Pinzette so dass die seitliche Spitze der Halbkugel in Richtung der Klinge gerichtet ist, überlegen auf die Bühne. Lassen Sie den OTC vollständig einzufrieren.
    1. Arbeiten in Schichten, fügen Sie zusätzliche OTC um das Gewebe der OTC ermöglicht vollständig einzufrieren, bevor die nächste Schicht hinzugefügt wird. Fügen Sie eine dünne Schicht von OTC auf der Oberseite des Gewebes und einfrieren.
  3. Abschnitt das Gewebe, gleiche Körpergewicht auf das Schneidmesser zu verteilen, während sectioning. Sammeln Sie Abschnitte mit einem feinen Künstler Pinsel und Platz in einem entsprechend gekennzeichneten gut Platte mit 1x PBS. Zwischen Abschnitten der Schnittstärke auf die neu eingestelltSchlitten-Mikrotom Wahl ggf. bis 50 um.
  4. Ersetzen Sie die PBS in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit Harnstofflösung [0,01 M Harnstoff in PBS] und legen Sie die Platte auf Eis. Wenn Sie bereit sind, entfernen Sie die Platte aus Eis und kochen Abschnitte in Harnstofflösung dreimal für 15 s jedes Mal Epitope für Immunmarkierung zu demaskieren. Dieser Schritt kann leicht durch Plazieren der Platte auf einem Heizblock auf Siedetemperatur eingestellt erreicht werden. Zwischen jeder Kochschritt, kühlen die Platte, die die Gewebeschnitte auf Eis enthält.
    HINWEIS: Wenn die Harnstoff durchgeführt wird, zu blockieren, primärer Antikörper, sekundäre Antikörper und DAPI Schritte in einer 96-Well-Platte, verwenden 100 & mgr; l Volumen im gesamten Gebäude. Wenn eine andere Größe gut verwendet wird, werden entsprechend angepasst, die Reagenzvolumina. Anstelle eines Heizblocks kann eine Mikrowelle verwendet werden Gewebeproben in Harnstoff zu sieden. Mikrowelle Proben auf einem hohen Leistungs für drei 15 s Intervalle einstellen.
  5. Beitrag Kochen, waschen Abschnitte drei Mal, jedes Mal vorliegende Lösung zu entfernen, um die Lösung zu ersetzenmit 1x PBS und für 10 min gerührt wurde.
  6. Blockabschnitte mit Eselsserum-Lösung (3% normalem Eselserum, 0,3% Triton X-100 in PBS) durch Gewebe in Serum eine Stunde lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Entfernen Esel Serumlösung.
  7. Etikettenabschnitte mit 0,2 & mgr; g / ml anti-Calbindin und 1: 2000 anti-Ataxin-1 - Antikörper (11NQ) 16 in Eselserum - Lösung und Inkubieren bei 4 ° C für 72 h unter leichtem Rühren.
  8. Waschen Abschnitte mit PBS wie in Schritt 6.5 vor der Abschnitte in geeigneten sekundären Antikörper inkubiert (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-Ziege und 1: 500 Alexa Fluor-594-anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt in Eselserum-Lösung) bei 4 ° C für 48 h unter leichtem Rühren.
  9. Waschen Abschnitte dreimal mit PBS wie in Schritt 6.5 vor der Markierung Zellkerne mit DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml in PBS verdünnt. DAPI Inkubation sollte nicht mehr als zehn Minuten nicht überschreiten. entfernen solution und waschen mit PBS, wie in Schritt 6.5.
  10. Berg Gewebe auf 2% Gelatine beschichtete Folien mit Eindeckmediums Photobleichens zu reduzieren. Deckglas und Dichtung mit Nagellack.
  11. Mit einem konfokalen Mikroskop suchen Sie den primären Fissur des Kleinhirns unter Hell Licht. Mit einem 10X UIS2 Ziel, Scannen und sequentiell erregt DAPI, AlexaFluor-488 und AlexaFluor-594 Kanäle eine 405 nm Diodenlaser, ein 488 nm Argon-Gaslaser und ein 559 nm-Diodenlaser, jeweils in Verbindung mit einem DM488 / 559 nm dichroitischer Strahlteiler. Separate und sammle Licht emittiert SDM490 und SDM560 Strahlteiler verwendet und ein BA575-675 Bandfilter sind.
    1. Für jeden Kanal, einen z-Stack innerhalb der Primärspalte mit z = 20 & mgr; m und Schritt = 0,1 & mgr; m zu konstruieren. Verwenden Sie die Post-Processing-Software mit dem konfokalen Mikroskop zur Verfügung gestellt in einem Größenmarker auf das endgültige Bild hinzuzufügen.
      HINWEIS: Alternativ-Laser, Filter und Fluorophore auf VERFÜGBARK ersetzt werden basierendty. Wenn AlexaFluor-488 oder AlexaFluor-594 Detektions schwach ist, kann ein Galliumphosphid (GaAsP) hochempfindlichen Detektor verwendet werden, um das Signal zu verstärken, falls verfügbar.

7. Quantifizieren Molecular Schichtdicke und Purkinje-Zellen-Nummern

  1. Mit ImageJ, öffnen Sie einen Z-Stapel Bild von gefärbten primären Fissur und spaltete jedes Bild in seine roten, blauen und grünen Kanäle von 'Bild' in der Menüleiste der Auswahl "Farbe" aus der Registerkarte Bild und 'Split Channels' von der Farbe Tab.
  2. Erstellen Sie eine max Z Projektion eines jeden Kanals, die geteilt wurde. Wenn der Kanal Bild von Interesse offen ist, wählen Sie 'Bild' in der Menüleiste "Abschnitte" aus der Registerkarte Bild und "Z-Projekt" auf der Registerkarte "Bereiche". Innerhalb der "Z-Projekt" Befehlsmenü wählen Sie "Max Z Projektion" und klicken Sie auf "OK". Wiederholen Sie dies für jeden Kanal.
  3. Öffnen Sie den Zellzähler-Plugin, indem Sie 'Plugins' von the-Menüleiste "Analysieren" aus dem Reiter Plugins und "Zellzähler" auf der Registerkarte Analysieren.
    HINWEIS: ImageJ und die ImageJ Zellzähler-Plugin kann auf die in der Tabelle der Materialien und Geräte zur Verfügung gestellt Websites heruntergeladen werden.
  4. Quantifizierung die Anzahl der Purkinje-Zellen durch Zählen Ataxin-1-markierten Kerne, die entlang einer vorbestimmten Strecke von 200 um anteriore und posteriore Längen der Primärspalte liegen. Über die Schwelle Karte von 'Bild' in der Menüleiste auswählen, "Anpassen" aus der Registerkarte Bild und 'Threshold' aus dem Anpassen Registerkarte einen Schwellenwert Karte des Kanals von Interesse (rot im Fall von Ataxin-1 markierten Kerne zu machen ).
    1. Wähle einen Pixelbereich, die während der Quantifizierung normiert werden (31 bis 225 Pixel zum Beispiel). Entsorgen Sie Rauschen aus den Bildern von den "dunklen Hintergrund" Box in der Threshold-Fenster zu überprüfen. Bildsignal kann für eine einfache Zählung invertiert werden.
  5. Quantifizieren molekulare Schicht thickness im grünen Kanal die "Split-Kanäle" und "Threshold Map 'Werkzeug wie in den Schritten 7.1 und 7.2 verwenden. Mit der Größe Markierung auf jedem Bild als Führer, messen zufällig drei molekularen Schicht Längen in jedem von zwei Designated 200 & mgr; m erstreckt sich jeder primären Fissur Bild. Stellen Messungen von dem proximalen Ende des Purkinje dendritischen Dorn an der Basis des Purkinje soma zum distalen Ende des dendritischen Dorn Purkinje.
  6. Nehmen Sie Purkinje-Zellzahlen und molekularen Schichtdicke als Mittel plus oder minus der Standardfehler. Führen one-way ANOVA mit multiple Vergleiche post-hoc - Analyse der Wirkung von Behandlungsbedingungen oder Genotyp von der Anzahl der Zellen und der Länge der dendritischen Dorn zu testen.

8. HPLC Analyse von Zerebelläre Bernsteinsäure-Konzentrationen Nachbehandlung

  1. Herstellung der Probe zur Analyse
    1. Wiegen Sie jede geerntet rechten Kleinhirnhemisphäre vorVerwenden Sie in der HPLC-Analyse. Mince hemisphärischen Hälften ein zu einer Zeit in ein vorgekühltes Dounce Homogenisator und 0,5 mL 75:25 (Volumen) Wasser: Methanol - Lösung in jede homogenisiert Hälfte 17.
    2. Mit Hilfe eines schmalen vorgekühlte Homogenisator, grob zerkleinern Gewebe mit 5 Dounce Schlägen. Weiter zu fein jede Gewebeprobe mit einem breiteren Homogenisator Blatt vor den Mund, die Anwendung 20 Dounce Schlaganfällen.
    3. Übertragen Sie die Homogenate zu vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Nach jeder Probe, spülen Sie den Homogenisator mit 0,5 ml eiskaltem Wasser: Methanol-Lösung und die Spülung mit dem Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.
    4. Zentrifuge Homogenat Proben bei 1.300 xg für 30 min bei 25 ° C und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen sammeln.
    5. Filtern Sie die Überstand durch ein Zentrifugal-Filtereinheit untergebracht mit einem regenerierte Zellulosefilter von 10 Kilodalton (kDa) nominalen Molekulargewichtsgrenze. Wenn es nicht sofort HPLC-Analyse läuft, speichern filtrierten Proben bei -80 °C.
  2. HPLC Besetzung Bedingungen
    1. Befestigen eines Ionenausschlusschromatographie Säule mit einer Länge von mindestens 30 cm und einer Teilchengröße von 7 & mgr; m auf eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
    2. Vorzubereiten und zu entgasen, eine ausreichende Menge von 1 mM Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5 eingestellt.
    3. Stellen Sie die HPLC mit einer mobilen Phasengeschwindigkeit von 0,8 ml / min. Wenn ein UV-Vis-Detektor, wählen Sie einen Detektor-Wellenlänge von 224 nm. Typische Elutionszeiten für Bernsteinsäure unter diesen Bedingungen zwischen 10 und 12 min.
  3. Ausführen und Analysieren von Standards und Proben
    1. Bereiten Sie eine Reihe von Standards in Acetatpuffer mobile Phase mit Bernsteinsäure-Konzentrationen zwischen 0 und 250 ppm.
    2. Führen Sie jeden Standard und bereiten von jedem Lauf gemessen, um eine Kalibrierungskurve der Peakfläche verwendet wird.
    3. Sobald eine genaue Standardkurve erhalten wird, laufen die zuvor hergestellten Proben in Acetat-Puffer verdünnt.Für eine höhere Genauigkeit der Messung können Proben mit bekannten Konzentrationen von Bernsteinsäure versetzt werden, die in der mobilen Phase verdünnt wurden. Führen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung.
    4. Analyse HPLC Chromatogramme, die die Bernsteinsäurekonzentration der Proben unter Verwendung der Kalibrierungskurve, und dann Multiplizieren mit Probenvolumen und Division durch ursprüngliche Probenmasse zu bestimmen.

9. Ex - vivo - Analyse von Zerebelläre Mitochondrial Funktionalität Mit einer Sauerstoffelektrode Control Unit

  1. Erstellen einer Clark-Elektrode ein im Handel erhältliches System , indem zuerst ein Tropfen Kaliumchlorid Anwendung (50% KCl w / v) unter Verwendung von Lösung auf der Platinkathode, eine 1,5 cm 2 Stück kommerziellen Tabak Schneiden von Papier Walzen und das Papier leicht Plazieren über die Platinkathode.
    1. Decken Sie die Kathode und Anode umgibt mit einem 2,5 cm 2 Stück aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Papier und kuschelig sichern sowohl membranes mit O-Ringen, um sicherzustellen, gibt es keine Falten oder Blasen innerhalb der Membranen. Drip 50% KCl-Lösung in das Bohrloch umgibt.
  2. Sichern Sie die premade Elektrode in die Testkammer und füllen sich mit Luft gesättigtem Wasser. Erhitzen Sie die Kammer auf 30 ° C, fügen Sie ein 0,8 cm Rührstab zu der Lösung und rühren bei 70 Umdrehungen pro Minute, das Instrument Software. Kalibrieren Sie die Kammer Null Sauerstoff durch die Einrichtung. Dazu fügen seriell einigen Kristallen des Reduktionsmittels Natriumdithionit in die Lösung.
    1. Sobald die Kalibrierung erreicht wird, waschen Sie die Kammer einmal mit 70% Ethanol und dann sechsmal mit entsalztem Wasser waschen , bevor der Kammer in 1,5 ml Atmungspuffer (5 mM MgCl 2, 60 mM KCl, 100 mM Mannit, 10 mM akklimatisieren KH 2 PO 4, 0,5 mM Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
      HINWEIS: alle Spuren von Natriumdithionit müssen vollständig während der Waschschritte entfernt werden, bevor Sie zu messenSauerstoffkonzentrationen während der Atmung Experimente.
  3. Sanft homogenisieren die gewogenen Kleinhirnhemisphären in 0,5 ml Homogenat-Puffer (0,25 M Saccharose, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Übertragen Homogenat in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und gekühlt zu halten, bis der Durchführung des Tests.
  4. Füge das Homogenat in die Kammer, um ein Endvolumen von 2 ml zu erreichen. Permeabilisieren die cerebellar Homogenat durch 40 ul Digitonin oder Saponin Zugabe (5 mg / ml); erlauben homogenisierte Gewebe für 10 min inkubiert.
    HINWEIS: Digitonin und Saponin toxisch sind, und Inkubationszeiten sollte auf einem Minimum gehalten werden.
  5. mitochondriale Funktion durch die Aktivierung und Hemmung der oxidative Phosphorylierung Kette zu beginnen Sauerstoffverbrauch der Aufnahme bestimmen Substrate und Inhibitoren bzw. (3 min Aufnahmen pro Substrat).
    1. In Substrate mit sauberen Spritzen wie folgt: 10 & mgr; l 2 M Glutamat [Endkonzentration (fc) 0,01 M],5 & ​​mgr; l 0,8 M Malat [fc 2 mM], 20 & mgr; l 0,5 M Adenosindiphosphat (ADP) [fc 5 mM], 1 & mgr; l 1 mM Rotenon [fc 0,5 uM], 20 & mgr; l 1 M Bernsteinsäure [10 mM], 1 & mgr; l 5 Antimycin A mM [fc 2,5 uM], 1 & mgr; l 0,8 M Ascorbat [fc 0,4 mM] und 5 ul 0,2 M Tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD). [Fc 0,5 mM] Wenn Substrate in die Kammer Zugabe vorsichtig sein, keine Luftblasen in das System einzuführen.
      HINWEIS: Detaillierte Informationen über die funktionelle Wirkung induziert durch jedes Substrat und Inhibitor wird in einem zuvor veröffentlichten Protokoll 7 beschrieben. Einzeldosis-Wirkungs-Kurven werden müssen, erzeugt werden, können optimale Konzentrationen der Substrate und Inhibitoren in Zubereitungen / Gewebe / Spezies zu bestimmen, die zuvor nicht untersucht. Ebenso kann das Protokoll für die angeborene Stoffwechsel Tendenzen der Gewebe- / Spezies untersucht, wie Substratpräferenzen optimiert werden.
  6. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, sanft einspirate die zerebelläre Homogenate und reinigen Sie die Kammer mit Ethanol und entsalztem Wasser. Einmal sauber, zusätzliche Kleinhirns Homogenat Proben können so lange ohne zusätzliche Kalibrierung ausgeführt werden, da die PTFE-Membran intakt bleibt. Nach der endgültigen Fertigstellung, saubere Elektrode mit VE-Wasser und Ethanol und Speicher mit Kieselgel oder Trockenmittel.
    HINWEIS: Zwischen selben Tag läuft, füllen Sie die Kammer mit VE-Wasser sichergestellt wird, dass die Membran nicht austrocknet.
  7. Mit Hilfe der Datenblatt von der Gerätesoftware erstellt, Export 40 min von Atmungsdaten beginnend 2 Minuten erstellen Substrat zusätzlich zu einem Tabellenkalkulationsprogramm.
  8. Berechnen Sie die Geschwindigkeit der Atmung pro Substrat oder Inhibitor. Normalisieren Daten, die durch die gesamte Atmung durch die Atmungsrate während des Ascorbat-TMPD Substratzugabe zu teilen.
    HINWEIS: Die Atmungsrate kann weiter normalisiert werden, um den Proteingehalt des Gewebes, die besonders wünschenswert in Neurodegeneration Experimenten sein kannin denen der Gewebegehalt variieren. Dazu reservieren 50 & mgr; l der Probe Homogenat (aus Schritt 9.3) für die Verwendung in einem Standard-Proteintest.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Durch pharmakologische Targeting von zerebellären Mitochondrien mit Bernsteinsäure sind wir mitochondriale Dysfunktion in einem Mausmodell der zerebelläre neurodegenerative Erkrankung SCA1 zu verhindern können. Die kanonische Elektronendonor von Succinat - Dehydrogenase, Bernsteinsäure, wurde einen Monat lang in Käfig Trinkwasser von SCA1 Mäuse gelöst, mit Verhaltensbeurteilung zu Beginn in der zweiten Woche der Behandlung und neuropathologische Beurteilung nach der Behandlung (A...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wenn diese Methoden verwendet werden, wie beschrieben, sind sie in der Lage zu erkennen und Linderung oxidative Phosphorylierung vermittelte mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheit Mäuse-Modellen. Die vereinigten biochemischen und Verhaltenstests sind vielfältig Methoden für das Ausmaß der mitochondrialen Beitrag zur cerebellar neurodegenerative Krankheitspathologie bestimmen. Durch die Mäuse mit Bernsteinsäure Behandlung von Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondrien ste...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir möchten Dr. Harry Orr von der University of Minnesota für seine großzügige Spende an transgenen Mäusen danken. Wir möchten uns auch bei den folgenden Absolventen des Skidmore College für ihre Arbeit bei der Durchführung der vorangegangenen Experimente bedanken: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson und Cheyanne Slocum. Darüber hinaus möchten wir uns beim Skidmore College für die Finanzierung der Entwicklung dieser Methoden bedanken.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdenosindiphosphatSigma AldrichA2754ADP
AscorbatSigma AldrichA7631
RinderserumalbuminSigma AldrichA2153BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindolSigma AldrichD9542DAPI
DigitoninSigma AldrichD141
DithiothreitolSigma AldrichD0632DTT
EselsserumSigma AldrichD9663
GlutamatSigma Aldrich1446600
MalatSigma Aldrich6994
MannitolSigma AldrichM4125
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
KaliumlactobionatBio-Zucker69313-67-3
RotenonSigma AldrichR8875
SaponinSigma Aldrich47036
BernsteinsäureSigma AldrichS3674
N,N,N′,N′ -Tetramethyl-p-phenylendiaminSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
HarnstoffSigma AldrichU0631
Vectashield EindeckmediumVector LabsH-1000
Antikörper
11NQ Antikörper (Anti-Ataxin-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 Anti-Maus-SekundärantikörperLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 Anti-Kaninchen-SekundärantikörperLife TechnologiesA-11012
Calbindin Antikörper (Ziege)Santa CruzC-20
Animals
Kontrolle transgener MäuseHarry Orr, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1-MäuseHarry Orr, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtyp-MäuseThe Jackson Laboratory001800
Equipment
ESM-100L MikrotomERMASledge Mikrotom
Fluoview FV1200 KonfokalmikroskopOlympus
Glycerin-Gelatine-ObjektträgerFD Neuro TechnologiesPO101
Hamilton SpritzeSigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 Oxytherm ElektrodensteuergerätHansatech Instruments
P.T.F.E. PapierCole-ParmerUX-08277-15
Rotaillon RotarodPPP& GKontaktieren Sie den korrespondierenden Autor für Informationen
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (für ImageJ)National Institute of Healthhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (Rotarod-Software)PPP& GWenden Sie sich an den korrespondierenden Autor, um Informationen Phidget21.dll zu erhalten
(erforderlich für Rotarod-Software)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

Referenzen

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Bernsteins urebehandlungVerhaltensuntersuchungenImmunfluoreszenz AssaysHPLC Analysemitochondriale RespirationKleinhirngewebeneurodegenerative Erkrankung
Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.