Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine schnelle und einfache Methode zur Bleomycin direkt in die Luftröhre Maus über Intubation verabreicht wird. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass sie in hohem Maße reproduzierbar, leicht zu beherrschen ist, und nicht spezialisierte Ausrüstung oder langwierige Wiederherstellungszeiten erfordern.

Zusammenfassung

Trotz einiger anatomischer und physiologischer Unterschiede sind Mausmodelle weiterhin ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung menschlicher Lungenerkrankungen. Die Bleomycin-Toxizität ist ein häufig verwendetes Modell, um sowohl akute Lungenschäden als auch Fibrose zu untersuchen, und es wurden mehrere Methoden zur Verabreichung von Bleomycin (und anderen toxischen Wirkstoffen) in die Lunge entwickelt. Viele dieser Ansätze, wie z. B. die transtracheale Instillation, haben jedoch inhärente Nachteile, einschließlich der Notwendigkeit starker Anästhetika und Überlebensoperationen. In dieser Arbeit wird über eine schnelle, reproduzierbare Methode der intratrachealen Intubation berichtet, die eine milde Inhalationsanästhesie, die Visualisierung der Luftröhre und die Verwendung eines Surrogat-Spirometers zur Bestätigung der Exposition umfasst. Als Wirksamkeitsnachweis wurde 8-12 Wochen alten C57BL/6-Mäusen entweder 2,0 E/kg Bleomycin oder ein gleichwertiges Volumen PBS verabreicht, und sowohl die Schadens- als auch die fibrotischen Endpunkte wurden nach der Exposition gemessen. Dieses Verfahren ermöglicht es den Forschern, eine große Kohorte von Mäusen in relativ kurzer Zeit mit geringen Kosten und minimaler Nachsorge zu behandeln.

Einleitung

Trotz einiger anatomischen und physiologischen Unterschiede, ^ein Mausmodell weiterhin für die Modellierung menschlichen Biologie und Pathogenese der Erkrankung. ^{2 von einer} Haltung Standpunkt, Mäuse sind leicht zu handhaben, haben eine geringe Brutzeit, eine beschleunigte Lebensdauer und sind relativ preiswert von unschätzbarem Wert sein unterzubringen. Mit der Entwicklung der verschiedenen genetischen Stämme und Strategien (z. B. bedingte Knock-outs, Reporter Mäusen Abstammung-Tracing-Ansätze, etc.), sowie die große Auswahl an erhältlichen Reagenzien (z. B. Antikörper, rekombinante Proteine, Inhibitoren, etc.), Mäuse sind zu einem wesentlichen Modell wirbel~~POS=TRUNC-Organismus aufzudecken menschliche Homöostase und Krankheitsprozesse geworden. ³

Mäuse haben besonders wertvoll gewesen Lungenstudienbedingungen, einschließlich akutem Lungenversagen (ALI) und Lungenfibrose. ⁴ ALI beim Menschen können durch ein Trauma, Verletzungen hervorgerufen werden, oder Sepsis und wird von epithelialen gekennzeichnet undendothelialen Leck (dh., Ödem), Entzündung und werdende Fibrose. Bei vielen Patienten schreitet ALI seiner schweren Form, akutem Atemnotsyndrom (ARDS), die oft in Fibrose und Tod durch Atemstillstand führt. ^5,6 Lungenfibrose eine progressive, fatale Pathologie ist durch das überschüssige Ablagerung von extrazellulärer Matrix gekennzeichnet geben, vor allem I-Kollagen, was zu einer Beeinträchtigung der Lungenfunktion. ^7,8 Verabreichung von Bleomycin (BLM) ist die am weitesten verbreitete und am besten charakterisierte Modell zur Induktion ALI und Fibrose bei Versuchstieren. ⁹ Obwohl Lungenfibrose bei Nagetieren-BLM induziert tut rekapitulieren nicht vollständig die menschlichen fibrotische Phänotypen, ¹⁰ Maus-Studien mit diesem Modell zur Entdeckung von vielen wichtigen Faktoren geführt haben das Auftreten und Fortschreiten der Erkrankung zu beeinflussen. ¹¹

Während der genaue Mechanismus (n) hinter BLM-induzierte Fibrogenese unbekannt sind, das auslösende Verletzungvermutlich aus Kontakt-abhängigen DNA-Strangbrüche in den Epithelzellen entstehen die leitenden Atemwege und Lungenbläschen auskleiden, und insbesondere, Typ-1-Pneumozyten. ¹² Die Notwendigkeit für den direkten Kontakt zwischen BLM und die Lungen Epithel unterstreicht die Bedeutung eines robusten Lieferroute und diese Bedenken sind auch für eine breite Palette an Anwendungen auf die Atemwege distal ausgerichtet, einschließlich rekombinanter Proteine, Antikörper, siRNA, Viren, Bakterien, Teilchen und mehr relevant. Oropharyngealen Aspiration (OPA) wurde zu diesem Zweck ^13, aber ein Haupt Ein Nachteil OPA ist, dass ein Teil der Mittel kann geliefert werden Verschlucken in den Magen-Darm-Trakt, was zu Ungenauigkeiten in der verabreichten Dosis eingesetzt. Eine andere verbreitete Ansatz ist transtracheal Einträufeln, die die Luftröhre und die Applikation von einem Agenten aufzudecken direkt in die Atemwege Tracheotomie unter starker Betäubung beinhaltet. ¹⁴ Aber nicht nur kann soeine Prozedur aufgrund seiner Invasivität unerwünscht sein, aber es ist auch zeitaufwendig und erfordert ein gutes Stück der Ausbildung, und verursacht eine starke Schädigung der Atemwege. ^15,16 verschiedene Protokolle, die die direkte Verabreichung von Wirkstoffen in die entwickelt wurden, umfassen Luftröhre ohne die Notwendigkeit für einen chirurgischen Eingriff, ^{16,17,18,19,20} aber diese Verfahren erweitert Erholungszeiten von mächtigen Anästhetika verursacht beinhalten, die Verwendung von teuren Geräten (dh., Otoskop / Laryngoskop, im Handel erhältliche Verfahren Platten, Glasfaser Drähte, etc.), ein Überschuß der Manipulation in der Mundhöhle, und der Unsicherheit in Bezug auf die Dosierung.

Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode zur Verabreichung über Intubation, die ein Forscher, preiswert, schnell ermöglicht und zuverlässig ein Reagens in die Mäuselunge mit begrenztem Risiko von Rest Schäden an den umgebenden Gewebe vermitteln.

Protokoll

Die Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) an der University of Washington und Cedars-Sinai Medical Center haben das Tier Arbeit notwendig für diese Studien zugelassen.

1. Vorbereitung

1. Sterilisieren sowohl dem stumpfen Ende einer Pinzette und den Niederhalter über Autoklaven.
2. Mit einem biologischen Sicherheitsschrank, bereiten eine Arbeits Lager von BLM in PBS aus dem gefriergetrocknetes Pulver. Beschallen die Lösung für 10 min bei 35 kHz auch sicherzustellen Mischen.
   Hinweis: Ein Gesamtvolumen von 30 bis 45 & mgr; l wird empfohlen Pipettieren Variation am unteren Ende zu verhindern, und Erstickung mit größeren Volumina.
3. Bereiten einer sauberen Arbeitsbereich, der sich etwa ^{1 m 2} für das Verfahren umfasst, sowie vorgesehenen Stellen für Käfige vor und nach dem Eingriff.
4. Befestigen Sie die Basis des Verfahrens Bord der Bank unmittelbar vor dem Forscher durch Verlegung 2 oder 3 Streifen von Labor Band über der Basis und underlying Bank. Siehe Abbildung 1 für weitere Angaben auf ein Brett zu schaffen.
5. Binden Sie eine Einzellänge von Größe 4,0 Faden zwischen den beiden Stellschrauben des Verfahrens Bord.
6. Generieren Sie einen provisorischen Spirometer durch Entfernen und Verwerfen des Kolbens von drei 1 ml Spritzen und Ablegen 60 ul PBS in der Spitze jedes Fass eine luftdichte Abdichtung zu bilden. Sichern Sie die Nabe des Katheters lose an einer der Spritzen und legen Sie es auf der einen Seite der Platine.
7. Saugen Sie 300 ul von Luft in einer 1-ml-Spritze und legen Sie es auf der einen Seite der Platine.
8. Schneiden Sie ein zusätzliches Stück Band ca. 6 cm in der Länge und zur Seite legen. Diese werden verwendet, um das Tier zu dem Brett in Schritt 2.4 zu sichern.
9. Stellen Sie eine Isofluran Kammer auf. Bringen _{O 2,} Isofluran und Vakuum an die entsprechenden Anschlüsse sowohl auf der Belichtungskammer und der Frei Vakuum. Alternativ verwalten Betäubung in eine Isofluran-kompatibel biologischenSicherheitswerkbank.

2. Intubation

1. Betäuben die Maus mit Isofluran in der Kammer, bis er das Bewusstsein verliert und die Atmung verlangsamt zu einer angemessenen Geschwindigkeit. Eine typische Belichtung enthält 4% Isofluran und 2% _{O 2} für 3 bis 4 min, und das ideale Ergebnis ist 2 bis 2,5 min der Sedierung. Dies entspricht einer Atemfrequenz von 1 Luft alle 2 sec.
2. Während des Wartens auf Sedierung in zu setzen, aspirieren zwischen 30 und 45 & mgr; l der BLM in eine Pipette und zur Seite legen.
3. Wenn Sie bereit sind, unterbrechen die sediert Maus mit seinem oberen Schneidezähne aus der zu den Stellschrauben des Verfahrens Plattform befestigt Faden. Stellen Sie sicher, dass das Tier die Rücken liegt flach auf der Plattformoberfläche.
4. Man aufpassen, nicht Lüftung zu beschränken, legen Sie ein Stück Klebeband lose über die untere (kaudale) Teil der Brusthöhle, direkt über der Membran. Eine Platzierung sollte fest genug sein, die richtige Ausrichtung während der Prozedur zu haltenEDURE, aber nicht so eng, daß sie die Atmung einschränkt.
5. Schalten Sie den Illuminator auf zwischen 80% und 100% Intensität und orientieren den Schwanenhals, so dass es 1 bis 2 cm von der Oberfläche der Haut ist in der Nähe des Sonnengeflecht. Überprüfen Sie regelmäßig die Spitze der Schwanenhals für Wärme, um sicherzustellen, dass es nicht die Maus nicht verletzen.
6. Hinter der Plattform mit Hilfe der sterilen, stumpfen Ende Zange die Zunge zu lokalisieren. Wobei darauf geachtet, die unteren Schneidezähne, sanft Griff und ziehen die Zunge in der Mundhöhle zu vermeiden.
7. Mit dem restlichen Hand, legen Sie die Niederhalter und es verwenden, um die Zunge gegen den Boden der Mundhöhle zu glätten. Lassen Sie die Zange, aber die Niederhalter an Ort und Stelle für die nächsten beiden Schritte lassen.
8. Richten Sie das Licht, so dass die Luftröhre durch die Führung des Schwanenhals proximal von der Höhe des Solarplexus sichtbar ist, bis sie das Niveau des Hauptbronchus Bronchien erreicht.
   Anmerkung: Die Luftröhre kann durch die Wirkung der Atmung leicht unterschieden werden, WHIch bewirkt, dass das emittierte Licht in Intensität schwankt. Wenn richtig positioniert, wird diese Struktur in der axialen Ebene als einer zentral angeordneten Stift von Licht mit minimaler Umgebungslicht in der Mundhöhle selbst erkennbar sein.
9. Winkeln Sie die Spritze so, dass sie den natürlichen Weg der Luftröhre folgt, und die 22-G Katheterspitze senken, mit dem angebrachten Spritze das Tröpfchen, gerade in das Lumen enthält. Die PBS-Blase beginnt mit jedem Atemzug bei erfolgreicher Platzierung zu steigen und fallen.
   Hinweis: Diese Aktion kann durch mehrere Sekunden infolge der tiefen Sedierung verzögert werden.
10. Führen Sie den Katheter in einem zusätzlichen 5 mm. Entfernen Sie den Spatel.
11. Schieben Sie die Spritze mit der anderen Hand, und Greifen der Nabe, sanft gegen die Spritze entfernen.
12. Ablagerung zwischen 30 und 45 & mgr; l von BLM in der Mitte des Inneren des Katheteransatzes, der zweite Spritze befestigen und 300 & mgr; l von Luft in der Nabe verzichtet werden.
13. Setzen Sie die zweiteSpritze mit dem zunächst die Blase PBS mit. Die Blase wird weiter steigen und fallen, wenn das Verfahren erfolgreich durchgeführt worden ist.

3. Post-Verfahrenspflege

1. Entfernen Sie den Katheter und Band, und legen Sie das Tier in einem trockenen warmen Ort, bis er das Bewusstsein wiedererlangt - in der Regel innerhalb von ein paar Minuten.

Ergebnisse

Intubierten Mäusen wurden täglich auf Gewichtsverlust und Not überwacht und getötet, 4, 10 oder 17 Tage später durch eine intraperitoneale Injektion von 2,5% 2,2,2-Tribromethanol. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) wurde in drei Waschungen mit PBS gesammelt, wie an anderer Stelle beschrieben ²¹ und die rechte Lunge wurde in 10% Formalin, Paraffin eingebettet und gefärbt mit Masson Trichrom der von der University of Washington Histology and Imaging ^{Kern 22}

Diskussion

In Fällen, in denen Aerosolisierung aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit Reagenz unpraktisch ist, Sicherheit oder Kosten, ist direkte tracheale Verabreichung eine überlegene Methode zur Abgabe von exogenen Mitteln in die Lungen ¹⁶ Transtracheale Instillation diese weit verbreitet zu bewerkstelligen ist. Jedoch, wie bei allen chirurgischen Eingriff, es führt auch damit das Potential für durch das Verfahren verursachten Komplikationen selbst und nicht notwendigerweise das Mittel eingeflößt wurde. ¹³...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bleomycin zur Injektion, 30 Einheiten/Fläschchen	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	Für beste Ergebnisse sollte BLM in PBS suspendiert, aliquotiert und als lyophilisierte Aliquote für den einmaligen Gebrauch gelagert werden.
Stumpfe Endzange
Zungenspatel (d. h. gebogene Valleylab-Klingenelektrode, 2,4 Zoll)	Covidien	E1551G	Vor Gebrauch eine 45-Grad-Biegung 1,5 cm von der Klingenspitze entfernt. Ein geeigneter Drücker kann auch aus jedem Metallwerkzeug ähnlicher Abmessungen hergestellt werden.
Exel Safelet Katheter 22G x 1"	Exel International	26746
1 ml Einweg-Tuberkulinspritze mit Slip-Tip (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0,2 ml Pipettierer und Filterspitzen
Fiber-Lite Illuminator. Modell 181-1: Modell 180 in Verbindung mit der Standard-Dual-Schwanenhalsbeleuchtung	von Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	LED-Beleuchtungen mit geringerer Leistung werden nicht empfohlen, da sie die Luftröhre nicht ausreichend beleuchten.
Intubationsboard			siehe Diagramm 1.
Farbiges Etikettenband: 0,5  in. Breit	Fisherbrand	15-901-15A
Sauerstoff
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X	Corning	21-040-CV	Das Produkt sollte steril
sein Unsterile Seide Schwarz Geflochtene Nahtspule, 91,4 m, Größe 4-0	Harvard Apparat	517698
Tisch-Anästhesiegerät Isofluran	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induktions-Maus-Isofluran-Kammer	MIP / Anästhesie Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (Isofluran, USP) Flüssigkeit zur Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digitales Pathologiesystem	Hamamatsu
IgM ELISA Quantifizierungskit	Bethyl Laboratorien	E90-101