Retroductal Submandibulardrüse Einträufeln und Lokalisierte fraktionierten Bestrahlung in einem Rattenmodell von Speichel- Unterfunktion

Sicherheiten Zerstörung von gesundem Gewebe entfallen eine Reihe von nachteiligen Nebenwirkungen von Krebsbehandlungen. Ein Teil oder die Gesamtheit der großen Speicheldrüsen, die mit den Strahlungsfeldern liegen, werden unweigerlich zerstört. Daher sind die meisten Patienten Strahlentherapie bei Kopf- und Halskrebs, Gebärmutterhalskrebs - Lymphom unterziehen, oder Ganzkörperbestrahlung vor der Transplantation des Knochenmarks leiden eine der häufigsten und persistent negativen Auswirkungen der Strahlung, Speicheldrüsenunterfunktion ^2-6.

Die Fluid produzierenden Azinuszellen der Speicheldrüsen sind äußerst empfindlich gegenüber Strahlung. Eine Schädigung der Speicheldrüsen bewirkt eine drastische Verminderung der Speichelfluss, eine Bedingung als Speichelunterfunktion bezeichnet. Die chronische Verringerung der Speichelfluss beeinträchtigt Schlüssel mündliche Aktivitäten wie Kauen, Schlucken, Sprechen und Geschmack, aber die krankhafte Folgen von starken Schmerzen, Schleimhaut Tränen, Dysphagie, opportunistischen Infektionen und Karies verschlechtert sich einPatienten Wohlbefinden und die Funktion ^2,3.

Da Strahlentherapie-assoziierte Verlust Speichel Zelle irreversibel ist, gibt es keine korrigierende Behandlung von Xerostomie. Aktuelle Behandlung , die auf beschwichtigende Symptome , die mit künstlichen Speichelersatzmittel und prosecretory Medikamente unwirksam zur Linderung langfristigen Fokus ^6. Obwohl verbesserte Strahlungsabgabetechniken , um die Schwere der Erkrankung zu verringern haben dazu beigetragen, normalen Gewebetoxizität und ihre Komplikationen bleiben ein limitierender Faktor bei der Krebsbehandlung ^6,7. Präventive Maßnahmen Strahlentherapie-assoziierten Komplikationen zu vermeiden sind daher immer die Norm. Radio - Schutzmittel , die durch freie Radikale Sauerstoffspezies, Pflege Zelle Neubesiedlung scavenge oder verbessern die DNA - Reparatur werden erforscht ^11.08 Speichelunterfunktion zu verhindern.

Sekrete von exokrinen Speicheldrüsen münden in den Mund durch die Hauptausführungsgänge. Intraorale Kanülierung the Ausführungsgänge zur Injektion von Kontrastmitteln wird routinemäßig als ein ambulantes Verfahren durchgeführt. Unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes können Speicheldrüsen direkt für lokalisierte ¹² Behandlung ausgerichtet sein. Neben der Verringerung des Risikos von systemischen Nebenwirkungen hat retroductal gland Instillation Vorteile gegeben. Die einschichtigen Anordnung von Speichelzellen um den duktalen Baum aller Speichel Epithelzellen ermöglicht Targeting und die faserige Verkapselung der Drüse wirkt als Barriere unerwünschte therapeutische Ausbreitung zu reduzieren. Im Wesentlichen sind Speicheldrüsen für die gezielte Behandlung von Drüsen Beschwerden optimal geeignet wie strahlungsinduzierte Speichelunterfunktion.

(- 2,5 Gy / Fraktion / Tag, fünf Tage die Woche 1.8) für einen Zeitraum von Wochen konventionellen Strahlentherapie zur Behandlung von Krebs wird in kleinen Dosen geliefert. Daher ist ein Radio-Schutz therapeutischen, die Wirksamkeit gegen ein langwieriger Strahlung Schema in experimentellen Modellen zeigt eine größere klinische Lager. compromiert Speichelfunktion nach fraktioniert Strahlung hat bei kleinen Tieren aufgezeichnet worden, aber Strahlungsquelle, Dosisfraktion und verwendeten Protokolle sind vielfältig ^9,10,13.

Dieser Bericht stellt Methoden für retroductal Lieferung und lokalisierte Strahlung von Submandibulardrüse Ratte unter Verwendung von patientenrelevanten Strahlungsquelle und Dosisanteil.

Alle Verfahren wurden von der LSU Health, Shreveport, Tierpflege und Use Committee und waren in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. Kanülierung der Ratte Submandibular Speicheldrüsen

1. Herstellung von Spritzenschlauch Montage
   1. Schneiden Sie ein 10 cm Länge von PE10 Polyethylenschlauch mit einem Skalpell. Halten beide Enden der Rohrleitung zwischen dem Zeigefinger und dem Daumen. Heizen Sie den mittleren Abschnitt des Rohres über eine sanfte Flamme und sanft die weiche Schläuche dehnen ihre Länge zu verdoppeln, indem beide Seiten ziehen.
   2. Schneiden Sie den Schlauch in der Mitte mit einem Skalpell in einem Winkel von 45 ^o 2 Kanülen zu erhalten - jeweils mit einem verjüngten Ende. Erweitern des nicht verjüngten Ende der Kanüle, indem er über eine 29 G Nadel von 0,5 cc Insulin-Spritze paßt.
   3. Entfernen Sie die Kanüle, und 220 & mgr; l Salzlösung in die Spritze zu ziehen. Tippen Sie, um Luftblasen entfernen. Den cannulein über die Nadel und den Spritzenkolben drücken Luft auszutreiben und einen freien Fluss der Lösung durch die Kanüle zu gewährleisten. Stellen Sie die Lautstärke auf 200 & mgr; l.
2. Intra-Oral Kanülierung von Submandibulardrüse Duct
   HINWEIS: Autoclave Instrumente vor dem Eingriff, und zwischen Verfahren in einem heißen bead Sterilisator zu sterilisieren.
   1. Wiegen Sie das Sprague Dawley Ratte und verzichtet das berechnete Volumen von Ketamin (42 mg / kg) / Xylazin (8 mg / kg) / Acepromazin (1,4 mg / kg) Mischung in einer Injektionsspritze.
   2. Zurückhalten, das Tier durch die Basis des Schwanzes zwischen dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand greifen und mit der anderen Hand über den Körper gleitenden es zu erfassen. Legen Sie das Zeige- und Mittelfinger an den Seiten des Kopfes, während der Rumpf mit dem Daumen und dem restlichen Finger halten.
   3. Spritzen Sie das Anästhetikum in den hinteren Gliedmaßen Muskulatur. Bestätigen Tiefe der Anästhesie durch toe Prise und Augenlidreflexe. Bewerben Auge Schmiermittel Trockenheit während zu verhindernTier unter Narkose.
   4. Legen Sie das Tier auf einem speziell konzipierten Plattform (Abbildung 1), und greifen in die oberen Schneidezähne auf der Querstange. Ziehen Sie den Unterkiefer nach unten durch ein Gummiband um die unteren Schneidezähne Looping und sie auf die Plattform zu verankern.
   5. Übergeben Sie einen sterilen Faden durch die Zunge und heben Sie sie an den Boden des Mundes zu erhöhen. Klemmen Sie die Nähte mit einem hemostat, und gibt sie über den Querbalken.
   6. Erweitern Sie die Wangen mit einem speziell angefertigten Wangenspreizer (Abbildung 1), und unter einem Binokular die sublinguale Papillen auf dem Boden des Mundes finden.
   7. Fassen Sie das verjüngte Ende des vorgeformten PE10 Schlauch, eine empfindliche Pinzette. manipulieren Sie vorsichtig die Spitze der Kanüle in die Gangöffnung auf der sublingualen Papillen. Bestätigen Sie die Platzierung der Kanüle durch Einfädeln von 3 bis 5 mm in den Kanal; sicherzustellen, daß sie ohne Behinderung hindurchgeht.
3. Submandibulardrüse Instillation
   1. Injizieren Atropin (0,5 mg / kg) subkutan in das Genick des Halses, und warten Sie 10 Minuten für eine Verringerung der Speichelsekret.
   2. Sichern Sie die Kanüle in die Kanalöffnung mit einem Tropfen Cyanacrylat (Kleber) und trocknen lassen. Vermitteln die Lösung in der Drüse (200 ul / gland) langsam den Spritzenkolben mit einer Rate von ~ 50 & mgr; l / min drücken.
   3. Crush den Schlauch mit einem hemostat und vorsichtig die Spritze entfernen. Bewahren Sie den Schlauch in den Kanal für 30 - 60 min, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt. Entfernen Sie die Naht, die die Zunge hält.
   4. Übertragen Sie das Tier in einen separaten Käfig und einer Wärmelampe verwenden Sie es während der Wiederherstellung warm zu halten. Nicht das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein zu halten sternal recumbence wiedergewonnen hat.
   5. Nachdem das Tier vollständig ambulante, Haus es im Vivarium mit uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser.

2. Lokalisierte fraktionierten Bestrahlungvon Submandibulardrüse

1. Zurückhalten, das Tier, wie zuvor beschrieben, und betäuben mit intramuskulären Verabreichung von Ketamin (33 mg / kg) / Xylazin (6 mg / kg) / Acepromazin (1 mg / kg) Mix in der hinteren Gliedmaßen. Bestätigen Tiefe der Anästhesie und Schmiermittel auf die Augen.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem Linearbeschleuniger Tischplatte, und verlängern den Hals durch den Kopf kippen. Kollimieren das Strahlungsfeld (3 cm Spaltbreite), um den Bereich von der unteren Grenze des Unterkiefers an die Spitze des Brustbeins zu umfassen.
3. Legen Sie eine 1 cm gewebeäquivalenten Bolus über die Region, und stellen Sie den Abstand zwischen der Strahlungsquelle und der Oberseite des Bolus zu 100 cm.
4. Bestrahlen, um das Tier (2,5 Gy), um eine 6 MV Photonenstrahl von einem Linearbeschleuniger verwendet wird. Dosisleistung, Feldgröße und Abstand von der Strahlungsquelle Oberfläche Bolus wird die Belichtungszeit diktieren. In der aktuellen eingerichtet wurden die Tiere mit einer Dosisrate von ~ 1 Gy / min bestrahlt.
5. Wiederholen Sie Belichtung; 2,5 Gy / Tag für insgesamt 8Tage; 4 Tage / Woche mit einem 2-Tage-Intervall dazwischen. Halten Sie das Tier warm und während der Genesung. Übertragen Sie das Tier auf das Vivarium nachdem sie vollständig ambulante ist.
6. Sammeln Sie stimulierte Submandibulardrüse Speichel 8 Wochen nach der Strahlung ¹⁴ Drüsenfunktion zu messen. Euthanize Tiere unter Narkose durch Herzperfusion von kaltem 4% Paraformaldehyd / Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2. Ausrotten Submandibulardrüse zur histologischen und immunhistochemischen ¹⁴ analysiert.

Anpassung eines minimal-invasiven Sialographie Technik ist die lokale Behandlung der großen Speicheldrüsen möglich. Retroductal Verabreichung in submandibular Speicheldrüsen der Ratte wurde von intraoralen Kanülierung der Kanäle Wharton versucht (Abbildung 2). Die Speichelgänge von Wharton offen auf dem sublingualen Papillen auf dem Boden des Mundes, aber die Öffnungen sind nicht ohne weiteres sichtbar. Einführen der Kanüle wurde daher durchgeführt durch vorsichtiges Sondieren. Um unerwünschte Blutungen oder Kanal Perforation zu vermeiden, wurde keine Kraft verwendet, während die Kanüle legen. Glatte widerstandsfreien Durchgang der Kanüle in dem Kanal wurde durch sanftes Hin-und Herbewegung des Schlauches bestätigt.

Kanülierung bei ersten Versuchen wurde durch die Infusion der Drüse mit Hämatoxylin oder Trypanblau - Lösung und die Bewertung Drüse Färbung in eingeschläfert Tiere (Abbildung 3) bestätigt. Glund Füllvolumen durch die Visualisierung Färbung des duktalen Baum in extirpated Drüsen ermittelt. Für Tiere mit einem Gewicht von 150 bis 250 & mgr; l-Lösung - 250 g, eine vollständige Füllung der Stopfbüchse mit 200 erreicht. Schnelle Infusion kann Drüse Druck zu erhöhen und das Risiko von Verletzungen und biospread erhöhen. Zur Gewebezerstörung zu vermeiden, wurde die Lösung allmählich mit einer Rate von ~ 50 & mgr; l / min verabreicht

Die Ratten Submandibulardrüse sind vergleichbar mit Parotis in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Strahlung 15. Submandibulardrüse wurden untersucht , weil sie selektiv ohne zu verursachen schwere Nebeneffekte (Abbildung 4) bestrahlt werden kann. Sparing der Mundhöhle und einem großen Volumen der den Einfluss der oralen Mukositis und akute Xerostomie auf die Tiergesundheit und experimentelle Ergebnis minimiert Parotiden. Unsere früheren Studien an Ratten wurden mit einzelnen, großen Dosen von Strahlung 11,16 durchgeführt, aber Fractionated Dosierung ist mehr relevant für die klinische Praxis. Der Halsbereich des Tieres wurde daher täglich kleine Dosen von Strahlung ausgesetzt wird. Um eine gleichmäßige Aufbau der Strahlungsdosis innerhalb der submandibularen Drüsen in der Nähe der Hautoberfläche, ein weiches Gewebe-Äquivalent Bolus aus einem homogenen Gels mit einer Dichte von 1,03 g / cm³ erreichen, wurde über den Hals während Strahlung gestellt.

Die Wirkung der fraktionierten Strahlung Regelung auf den Speichelfluss als post-Strahlung zeigen nach 8 Wochen bestimmt, die den täglichen Umgang mit Schritten von 2,5 Gy jäh Speichelfluss reduziert. 14; A nahe 10-fache Reduktion in Speichel Ausgangs wurde in bestrahlten Tieren im Gegensatz zu nicht-bestrahlten Tieren (5 2-seitig Student-t- Test, p <0,01) aufgezeichnet. Die Ergebnisse bestätigten die Einrichtung von strahlungsinduzierten Speichelunterfunktion bei Tieren.

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Abbildung 2. Kanülierung der Ratte Submandibulardrüse Ausführungsgänge. Die Zunge angehoben , um den Mundboden zu heben und Polyethylen Kanülen wurden in die submandibular Kanalöffnungen befindet sich auf dem Boden des Mundes eingefügt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Abbildung 3. Die Infusion von Hämatoxylinlösung in der Submandibulardrüse zu bestätigen Technik. Gland Färbung bestätigt die erfolgreiche Verwaltung der Lösung in der Unterkieferspeicheldrüse. Beachten Sie, dass die sublinguale Drüse in der linken oberen Ecke nicht verschmutzt ist. Eine nicht-infundiert Steuer Drüse ist auf der linken Seite gezeigt.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Die Platzierung des Tier für die Bestrahlung. Das Tier wird fest liegt auf dem Rücken der Linearbeschleuniger Tisch, und der Kopf dem Titel zurück , um den Hals zu verlängern. Der kollimierte Schlitzbreite betrug 3 cm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Einfluss der fraktionierten Strahlung auf Submandibulardrüse Funktion. Saline wurde in den Submandibulardrüse vor Strahlung eingeflößt. Der Hals des Tieres wurde für 8 Tage in Fraktionen von 2,5 Gy / Tag bestrahlt. Die data gezeigt sind Mittelwert ± SEM von stimulierter submandibular Speichelflussrate von 8 Wochen nach der Strahlung Regelung der Fertigstellung. Die Figur mit dem Urheberrecht Erlaubnis von Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc. Verlag 15 wiedergegeben wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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