Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Zusammenfassung

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Zusammenfassung

Visualisierung von dynamischen Signalereignisse in lebenden Zellen war eine Herausforderung. Wir erweiterten einen etablierten transienten Expressionssystem, wobei das biomolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Test in Tabak Epidermiszellen von Test Protein-Protein-Wechselwirkung, um die Überwachung der räumlichen Verteilung der Signaltransduktion in Pflanzenzellen. In diesem Protokoll verwendeten wir den BiFC Assay zeigen , dass die Wechselwirkung und die Signalisierung zwischen dem Arabidopsis MAPKKK YODA und MAPK6 an der Plasmamembran auftreten. Wenn das Gerüstprotein BASL wurde co-exprimiert, neu verteilt die YODA-MAPK-Interaktion und räumlich kopolarisierte mit GFP-BASL. Dieses modifizierte Tabakexpressionssystem ermöglicht eine schnelle Prüfung von Signal Lokalisierung und dynamischen Veränderungen (weniger als 4 Tage) und kann mehrere von fluoreszierenden Protein Farben (mindestens drei) aufzunehmen. Wir stellten auch detaillierte Methoden Proteinverteilung (asymmetrische räumliche Lokalisierung oder "Polarisierung" zu quantifizieren;) In Tabakzellen. Diese fortschrittliche Tabak-Expressionssystem hat ein Potenzial weit für einen schnellen Test der dynamischen Signalereignisse in lebenden Pflanzenzellen verwendet werden.

Einleitung

Proteine ​​interagieren innerhalb eines verwickelten hierarchischen Netzwerk und bilden Komplexe, die eine zentrale Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen in einer unvorhersehbaren zellulären Umgebung auftreten. Doch von der Entwicklung von Pflanzen Wachstumsreaktionen, hat es einen Mangel an praktischen Tools gewesen, die nicht nur schnell, sondern auch effizient zu identifizieren und diese dynamischen Signalereignisse auf subzellulärer Ebene überwachen.

Die transiente Protein-Expressionssystem in Tabak Blattepidermis aufweist ansprechende Vorteile zur Visualisierung fluoreszierende Proteine ​​in lebenden Zellen. Dieses System bietet halb- in - vivo - Bedingungen , die post-translationalen Lokalisierung Proteinmodifikation und schnelle Untersuchung von Protein ermöglichen. Durch die Untersuchung informiert den ergänzt YFP-Signal, die bimolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Assay die Möglichkeit von Protein-Protein-Wechselwirkung in Pflanzenzellen. Im Vergleich zu anderen Methoden, beispielsweise Hefe-Zwei - Hybrid (Y2H) und co-immunoprecipitation (Co-IP), BIFC stellt auch ein mächtiges Mittel von Fächern zu visualisieren, wo Protein-Protein-Interaktionen auf subzellulärer Ebene auftreten können.

Weil asymmetrische Zellteilung (ACD) Stammzellenpopulation beibehält , während neue Zelltypen für Gewebe- / Organbildung zu erzeugen, ist es ein unverzichtbarer Mechanismus für eukaryotische Vielzelligkeit fördern. Arabidopsis stomatal Entwicklung als Modellsystem verwendet wurde , für die Untersuchung ACD in Pflanzen. Die Vorläuferzelle, meristemoid Mutterzelle teilt sich asymmetrisch zwei verschiedene Tochterzellen zu erzeugen, eine meristemoid (erfährt zellähnliche Divisionen stammen, bevor sie in ein Paar von Schließzellen beendet) und einer Stomata Linie Grundzelle (SLGC) (dividieren kann und differenzieren sich in eine Fahrbahn Zelle), bzw. (Abbildung 1). In Stomata ACD wird das neue Protein Breaking of Asymmetry in der Stomata Lineage (BASL) polarisiert premitotically Division Asymmetrien zu fahren, die include physische Asymmetrie und Zellschicksal Asymmetrie ^1. Eine MAPK Kaskade , bestehend aus dem MAPKKK YODA und den MAPK, MPK3 und 6 ist von zentraler Bedeutung für die Stomata Division Strukturierung und Schicksal Annahme ^{2,3, 4,5.}

Vor kurzem Zhang et al. die Polarität Protein BASL zur YDA-MAPK - Signalweg in Arabidopsis Stomata ACD ⁶ verbunden. Die kanonische YODA-MAPK-Weg, durch MPK3 / 6, phosphoryliert BASL und aktiviert seine Polarisation. Phosphoryliert BASL Funktionen als Gerüst und rekrutiert YODA (YDA) und MPK3 / 6 einen Proteinkomplex zu bilden , und die Signalisierung an der Zell cortex ⁶ konzentrieren. Polarisierung der MAPK-Komponenten und die positive Rückkopplungsschleife zwischen BASL und dem YDA-MAPK-Weg stellt einen neuen Mechanismus für die Protein Polarisierung in Pflanzenzellen. Vor Ort angereicherte MAPK - Signalisierung wird vermutet , eng mit Zellschicksal Differenzierung in Stomata ACD ⁶ (Abbildung 1) zu werden. Einer der key experimentellen Daten , die dieses Modell unterstützt kamen aus den Tabak Assays , die die räumliche Umverteilung von MAPKs durch die Expression von BASL ⁶ induziert demonstriert.

Im allgemeinen ist es nicht leicht zu überwachen, wo MAPK Signalisierung tritt auf, weil MAPK Moleküle oft überall innerhalb einer Zelle gefunden wurden. In dieser Studie verwendeten wir die Split-YFP System die Wechselwirkung zwischen der stromaufwärts-Kinase und den stromabwärtigen visualisieren vorzuschlagen, wo die Melderelais auftritt. Wir verlängert weiter die Verwendung des BiFC System durch Co-Exprimieren eines dritten Protein (CFP-tagged) mit dem geteilten YFP Paar (suggestiv von Protein-Protein-Wechselwirkung) sichtbar zu machen, ob und wie die ergänzt YFP räumlich durch die co- moduliert werden könnten ausgedrückt GFP-Protein. Auf diese Weise haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von GFP-BASL induzierte räumliche Reorganisation von Wechselwirkungen zwischen YDA und MPK6, aus gleichmäßige Verteilung zu polarisierte Strukturierung an der Zellrinde des Tabak epidermal Zellen. Dieses System hat daher das Potential , zur Überwachung dynamischer Signalereignisse in Pflanzenzellen unter Bedingungen entwickelt werden , wenn die Zellen durch die internen oder externen Stimuli (zB Co-Expression von anderen Proteinen, chemischen Anwendung Pathogenbefall oder Umgebungsänderungen herausgefordert werden, etc. ).

Protokoll

1. Plasmidkonstruktion

1. Generieren Sie die Konstrukte durch Technologie Klonen wie zuvor ^1,6 beschrieben.
   1. Verwenden Sie zuerst eine High Fidelity DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primer die kodierenden Sequenzen von BASL zu verstärken, YDA und MPK6 und Unter klonen sie in Eintrag Vektoren. Hier finden Sie die ausführliche Protokoll in ^7.
   2. Um die dominant negative Versionen von MPK6 und YDA erzeugen (DNmpk6 ⁸ und DNyda bzw. ^4), verwenden Sie den Eintrag Plasmide von MPK6 und YDA als Matrize und einzuführen , um die Punktmutationen durch eine ortsgerichtete Mutagenese - Methode ^9.
2. Um die Konstrukte für Tabak transienten Assays bauen, führen Standard LR (attL x attR- Rekombination) Reaktionen (detailliertes Verfahren in ⁷⁾ BASL in pH35CG zu integrieren ^10, DNyda und DNmpk6 in pXNGW und pXCGW Vektoren ^11.
   1. Bestätigen Sie die resultierenden Plasmide durch Enzym-Verdauung und Sequenzierung. Sobald successful, verwandeln die binären Konstrukte in die Agrobacterium - Stamm tumefaciens GV3101 ¹² und wachsen sie auf Selektionsplatten bei 28 ° C für 2 - 3 Tage.

2. Herstellung der Agrobacterium Infiltrationslösung

1. Beimpfen einige frisch transformierten Agrobacterium - Kolonien in 10 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit geeigneten Antibiotika (Gentamycin 25 ug / ml, Rifamycin 25 ug / ml, Spectinomycin 100 ug / ml für pH35CG, pXNGW und pXCGW Konstrukten, die gleichen Konzentrationen Gentamycin und Rifamycin mit Kanamycin 50 ug / ml für P19 (Proteine ​​gegen transgenen Silencing exprimieren) ^13.
2. Wachsen Agrobacterium - Kulturen in einem 28ºC - Schüttler mit der Geschwindigkeit von 200 Upm für etwa 16 h und messen dann die OD ₆₀₀ (geschätzt zu erreichen 1,5-1,8) (2A-B). Spin down die Kulturen bei 2.500 × g für 10 min. Re-suspendieren und wash der Zellpellets mit 10 mM MgCl ₂ (die Infiltrationslösung).
3. Spin down die Kulturen wieder und wieder aussetzen , die Pellets mit einer geeigneten Menge des Infiltrationslösung , die die endgültige OD ₆₀₀ = 0,5 (2C-D) zu erreichen. Vor dem Pflanzen zu infiltrieren, lassen Sie die Zellmischungen bei Raumtemperatur mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt hilft Zellhomöostase zu halten.

3. Tabakpflanze Blatt Injection

1. Verwenden Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) gewachsen 4 - 5 Wochen alten in einem Standard - Pflanzenwachstumskammer (23 ° C mit Zyklen von 16 Stunden Licht / 8 h-dunkel) ¹⁴ für Blatt Injektion.
   Anmerkung: In diesem Stadium Tabakpflanzen weisen in der Regel 6 Blätter (2 groß, 2 mittel und 2 klein). Die beiden mittelgroßen Blätter sind die optimal für die Blatt Injektion (die beiden Großen zu alt sind, während die beiden Kleinen oft zu jung sind).
2. Vor der Infiltration Tag, Wasser, um die tobacco Pflanzen, den Boden zu sättigen.
3. Auf der Infiltration Tag, Inkubation vorge die Pflanzen im Dunkeln mit 1 - 3 Stunden. Dieser Schritt ermöglicht Stomata in der Epidermis weit zu öffnen, die groß die Agrobacterium erleichtert , wenn sie in den Blatt epidermalen Zellen eindringen.
4. Mit Farbbändern mit Daten gekennzeichnet, Fahne, um die Blätter infiltriert werden. (; Die infiltrierten Bereiche sichtbar sind nach infiziert optional.) Markieren Sie die Bereiche mit einem schwarzen dicken Sharpie zu infiltriert.
5. Nehmen Sie gleiche Volumina der Agrobacterium Resuspension und mischen sie in einem 100 x 15 mm Petrischale unter leichtem Schwenken (Abbildung 2E). Hinweis: In unserem Fall vermischt man 1 ml p19 mit 1 ml GFP-BASL, 1 ml DNyda-NYFP und 1 ml DNmpk-cYFP.
6. Im Prozess der Infiltration, eine 3 ml Spritze ohne Nadel mit dem Infiltrationsmischung füllen (1 - 2 ml) und schieben Sie in die Unterseite (abaxial) des Tabakblattes (2F). Während infiltrieren, ist es hilfreich,einer Hand zu bedienen zu schieben und die andere Hand sanft die Oberseite (adaxial, gegen die Schubkraft) zu unterstützen.
   Hinweis: Sobald die Infiltration Mischung erfolgreich injiziert wird, werden die infizierten Gebieten in der Epidermis leicht erkennbar werden. Jedoch kann die Infiltration nicht aufgrund der rauen Injektion (Gewebeschaden) oder unzureichende push (kein Eindringen von Flüssigkeiten). Für jeden Test schlagen wir mindestens zwei Einspritzungen in zwei unabhängige Blätter (von verschiedenen Pflanzen).
7. Legen Sie die infizierten Pflanzen wieder in die Wachstumskammer. Im Allgemeinen Proteinexpression nachweisbar sind nach 48 h folgende Infiltration.

4. Die konfokale Imaging

1. Bei 48 Stunden nach der Infiltration, verwenden Sie ein Loch Puncher eine Blattscheibe aus dem injizierten Bereich auszuschneiden ( in der Regel 3 bis 4 Scheiben / Bereich erzeugt werden kann) (2G). Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Blattscheiben auf einen Objektträger übertragen (die abaxial Seite nach oben) und montieren sie mit Wassertropfen. Vermeiden Sie drücken zu hard auf dem Deckglas , weil gequetscht / geschädigten Zellen nicht gut zeigen unter dem konfokalen Mikroskop (Abbildung 2H).
2. Bevor die konfokale Abbildung, scannen die montierten Proben auf einer Epi-Fluoreszenz-Mikroskop Verbindung die Expressionsniveaus zu überprüfen. Hinweis: Basierend auf unserer Erfahrung, die Zellen, die Zwischenexpressionsniveaus zeigen, werden am besten unter dem konfokalen Mikroskop dargestellt.
3. Beginnen Sie mit dem 40X (NA 1.3) Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Stellen Sie die Folie in die gewünschte Position, so dass die Zellen mittlerer Ebenen fluoreszierendem Protein verbleiben im Zentrum ausdrückt. Die Anregungs- / Emissionsspektren für CFP und YFP sind 458 nm / 480-500 nm und 514 nm / 520-540 nm.
4. Aktivieren Sie die "Live", um die Bilder dann in der Vorschau Laserintensität und intelligente Verstärkung für die ausgewogenste Fluoreszenzintensität / Rausch-Verhältnis einzustellen. Bildqualität, erhöhen Scan Pixel und / oder Rahmen / Linie Durchschnitt zu verbessern. Schließlich stellen Sie den Fokussierknopf zu reach die mittlere Fokusebene und klicken Sie auf "Aufnahme", um das Bild zu nehmen.
   Hinweis: Die GFP und YFP Bilder können nacheinander oder gleichzeitig auf oder von der Option durch die Überprüfung von "sequential" Scan-Modus erfasst werden, respectively.
5. Wenn Z-Projektion für die in tiefen Einblick in die Zellen gewünscht, wählen Sie "xyz" Bildgebungsmodus definieren die Tiefe des Scanbereich (10 bis 15 & mgr; m) und die Bilder von oben nach unten der Zielzelle sammeln . Stellen Sie die erhaltenen Bilder mit der Leica Software mit der rechten Maustaste auf die Bilddatei "Umbenennen" und Export von Bildern als TIFF-Dateien auszuwählen.
6. Bild 30 - 40 Zellen für die Quantifizierungsanalyse.

5. Bildverarbeitung und Quantifizierung Analyse

1. Verwenden Sie Fidschi-Software (http://fiji.sc/Fiji) Bilder zu verarbeiten und die Quantifizierung durchzuführen.
   1. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität Graphen.
      1. Um noch besser zu visualisieren, ob die CFP / YFP Ausdruckgleichmäßig verteilt, verwenden Fiji die Signalstärke von CFP und YFP entlang der Zellperipherie zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, starten Sie zuerst Fidschi wählen Sie dann "Datei" und "Öffnen", um das Bild zu starten. Klicken Sie auf "Linie" auf dem Werkzeugmenü und wählen Sie "Segmented line" mit einem rechten Mausklick. Entscheiden Sie, die Region von Interesse und eine Linie entlang der Zellperipherie ziehen die GFP oder YFP - Signal (3A-C) zu verfolgen.
         Hinweis: Fidschi misst die absolute Fluoreszenzintensität Wert entlang der segmentierten Linien.
      2. Wählen Sie das Dropdown-Menü "Analysieren" und "Plot-Profil", um eine Grafik mit Position und Intensitätswerte erzeugen, die die Ebenen von CFP / YFP entlang der segmentierten Linie darstellen. Falls gewünscht, zu vervielfältigen, die Intensitätswerte (über das Menü "Kopieren" auswählen) in EXCEL oder andere Grafik-Software vergleichbarer Intensität Graphen zu erzeugen.
   2. Quantifizieren Polarität Grad.
      1. Sammeln Sie ca. 20 Vertretive Zellen von 3 Wiederholungsversuchen die Polarität Grad der CFP und YFP in Tabakzellen zu bewerten. Berechnen der Polaritätsgrad basierend auf dem Verhältnis der hohen Fluoreszenzintensität (definiert als H) über die niedrige Fluoreszenzintensität (als L definiert ist). Hinweis: Das Quantifizierungsverfahren ist in 3 erläutert.
         1. Um die H- und L-Werte zu messen, eine segmentierte Linie entlang der interessierten Region an der Zellperipherie ziehen (wie oben beschrieben), klicken Sie auf "Analyze" aus dem Drop-Down-Menü, und wählen Sie dann "Messen". Wenn ein Fenster "Ergebnisse" erscheint, verwenden "Mean" Werte Quantifizierung durchzuführen.
         2. Aus den Zellen eine relativ gleichmäßige Expression von GFP und YFP, zB GFP-BASL (3A) oder die YFP ergänzt von Co-Expression von DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3B), erhalten die H- und L - Werte Anzeige von Mess zwei zufällig periphere Segmente mit gleicher Länge ausgewählt.
         3. Aus den Zellen offensichtlich polare Ansammlung von fluoreszierenden Proteinen aufweisen, in diesem Fall ist die Co-Expression von GFP-BASL, DNyda-NYFP und DNmpk6-cYFP (3C), sammeln Sie die H - Werte aus den peripheren Regionen mit angereichertem Fluoreszenzsignale und die Ls aus den Regionen mit niedriger / kein Fluoreszenz Akkumulation.
         4. Pool die sich ergebenden Verhältnisse von H / L aus 20 Zellen zusammen und Test auf Normalverteilung. Berechne die p - Werte durch den T - Test nach Student (für Normalverteilung) , oder die Kolmogorov-Smirnov (KS) Test (für Nicht-Normalverteilung).

Ergebnisse

Um zu verhindern, induzierten Zelltod durch die hyperaktiv MAPK-Signalisierung, die Kinase-inaktiver Versionen YDA (DNyda) und MPK6 (DNmpk6) wurden in der Coexpression Assay in Tabakzellen verwendet. Weder die Interaktion zwischen DNyda und DNmpk6 enthüllt durch BIFC noch GFP-BASL selbst erzeugt ungleichmäßige Verteilung Muster (3A-B). Wenn jedoch GFP-BASL in die DNyda-DNmpk6 Wechselwirkungspaar eingeführt wurde, sowohl CFP und YFP - Signale wurden auf einer stark polari...

Diskussion

Allgemeine Verwendung und mögliche Modifikationen des Transient Expression System Tabak für die Signalübertragung: Eine Überexpression von Fluoreszenzprotein (FP) -markierte Proteine ​​in den Tabak Epidermis wurde für die schnelle Untersuchung von Protein subzelluläre Lokalisierung in Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt. Jedoch ist das Studium dynamischer Signalverteilung der Proteinkomplex in planta ein herausforderndes Thema aufgrund der komplizierten subzellulären Kontexte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phusion DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Site-directed Mutagenese Kit	Agilent Technology	200521
LB Bouillon	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Schlitten	VWR	16004-382
24 x 50 mm Deckglas	VWR	48393-241
Laserscanning Konfokalmikroskop	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite Software
40X Objektiv	Leica	HCX Plan APO	HCX  Plan APO, NA 1.30
Zentrifuge	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Locher	Klammern
50 ml Falcon Tubes	Genesee Scientific	21-108
Nr. 5 Pinzette	Canemco & Marivac	205EQA-Spec