Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Summary

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Abstract

Erstbewertungen großer mikrobieller Bibliotheken für potenzielle Produzenten neuartiger antimikrobieller Proteine erfordern sowohl qualitative als auch quantitative Methoden, um nach Zielenzymen zu suchen, bevor größere Forschungsanstrengungen und Ressourcen investiert werden. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zwei komplementäre Assays für die Durchführung dieser ersten Bewertungen zu demonstrieren. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay bietet einen anfänglichen oder einfachen Nachweisschirm, um die qualitative und schnelle Bewertung der proteolytischen Aktivität gegen eine Reihe von lebensfähigen und hitzeabgetöteten bakteriellen Zielsubstraten zu ermöglichen. Als Gegenstück bietet die erhöhte Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Farbstoff-Release-Assays eine quantitative Plattform für die Bewertung und den Vergleich von Umwelteinflüssen, die die hydrolytische Aktivität von antimikrobiellen Proteinen beeinflussen. Die Möglichkeit, spezifische hitzeabgetötete Zellkultursubstrate mit dem Remazol Brilliant Blue R-Farbstoff zu markieren, erweitert diese Fähigkeit, den Farbstofffreisetzungsassay so anzupassen, dass er die interessierende enzymatische Aktivität charakterisiert.

Introduction

Antimikrobielle Wirkstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei der Bekämpfung einer Vielzahl von Mikroorganismen wie Viren, Pilzen und Bakterien. Die antimikrobiellen Aktivitäten, die von verschiedenen Bakterien produziert werden, reichen in ihrer Zielspezifität von Breitspektrum bis speziesspezifisch, einschließlich klinisch relevanter bakterieller Krankheitserreger ¹. In der Natur stellen antimikrobielle Proteinverbindungen wie Bakteriocine und Lysine ein mikrobielles Arsenal an Werkzeugen zur Selbstverteidigung, Replikation und Nährstoffaufnahme dar ^2,3. Als Vermittler der Populationsdynamik innerhalb mikrobieller Gemeinschaften bieten antimikrobielle Proteine dem produzierenden Organismus einen Wettbewerbsvorteil gegenüber nicht produzierenden, empfindlichen Spezies ⁴. Als rekombinante Enzyme und Probiotika haben diese Proteine auch eine wirtschaftliche und gesellschaftliche Bedeutung, da der Bedarf an neuen Quellen zur Erregerbekämpfung mit jeder neuen Ausbreitung der Antibiotikaresistenz innerhalb der Bakterienpopulation steigt ⁵.

Die ersten Bewertungen von neu entdeckten antimikrobiellen Proteinen beinhalten die Bestimmung der grundlegenden physikalischen Eigenschaften, die dem Enzym inhärent sind. Methoden zum schnellen Screening potenzieller antimikrobieller Wirkstoffe ermöglichen die Auswahl von Kandidaten mit hydrolytischer Aktivität gegen die gewünschten Zielsubstrate. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der quantitative Farbstofffreisetzungsassay ermöglichen die Verwendung einer Vielzahl von Substraten bei der Detektion der enzymatischen Hydrolyse. Bei antimikrobiellen Proteinenzymen mit Aktivität gegen die bakterielle Zellwand ermöglicht die Vielseitigkeit dieser Assays ein schnelles und effektives, qualitatives und quantitatives Screening gegen lebensfähige Bakterienzellen (nur Microslide-Assay), hitzeabgetötete ganze bakterielle Zellsubstrate oder gereinigtes Peptidoglykan aus dem Zielbakterium. Diese Assays sind nützlich bei der Entdeckung antimikrobieller Enzyme für den Einsatz in Bereichen wie alternativen Therapeutika, Nahrungsergänzungsmitteln und Inhibitoren der Biofilmproduktion.

Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay sind demonstrierte Methoden zum Nachweis und zur Charakterisierung neuartiger antimikrobieller Proteine. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay liefert eine relative (qualitative) Abschätzung der antimikrobiellen Aktivität und ermöglicht eine minimale Rückschlüsse auf die Enzymkonzentration und -aktivität. Mit dieser Methode lässt sich Aktivität leicht als die Entwicklung einer Lysezone visualisieren, wobei das Fehlen von Aktivität zu einem Mangel an Zonenbildung führt. Die Geschwindigkeit der Zonenentwicklung und der Zonendurchmesser sind ein Hinweis auf die Menge und Reinheit des in der Probe vorhandenen Enzyms; Diese Geschwindigkeit und die Qualität der Substratreinigung innerhalb der Zone können jedoch auch durch das Vorhandensein von Verunreinigungen, die Vollständigkeit der Hydrolysereaktion und die Art des Substrats beeinflusst werden. Störende Verunreinigungen können die Geschwindigkeit der Enzymdiffusion aus dem Bohrloch beeinflussen, während eine unvollständige Hydrolyse oder eine Variation des Substrattyps zu einer trüben Lysezone führen kann ⁶.

Der Farbstofffreisetzungsassay bewertet quantitativ die Menge an kovalent gebundenen Remacol-Brillantblau-R-Farbstoffprodukten, die aus dem enzymatisch hydrolysierten Substrat in den Reaktionsüberstand freigesetzt werden. Das Verfahren weist nur eine geringe Variabilität auf, die mit einem Unterschied im Substrat verbunden ist, wodurch eine höhere Empfindlichkeit für den Nachweis der Hydrolyse im Vergleich zum Mikroschiebe-Diffusionsassay ermöglicht wird. Diese Eigenschaften ermöglichen es dem Verfahren, bei der Charakterisierung der biochemischen Eigenschaften des Enzyms und bei der Standardisierung des Assays für den Vergleich zwischen verschiedenen antimikrobiellen Enzymen nützlich zu sein.

In diesem Protokoll stellen wir Methoden zur Verfügung, um den grundlegenden Mikroobjektträger-Diffusionsassay und den Farbstofffreisetzungsassay durchzuführen, während wir das Ausmaß der Nachweisgrenzen und die Variabilität für jeden einzelnen demonstrieren. Die Assays werden verwendet, um grundlegende Bewertungen eines unbekannten antimikrobiellen Proteins durchzuführen, das aus dem Kulturüberstand eines nicht charakterisierten Bodenbakterienisolats gereinigt wurde. Die beobachteten Aktivitäten gegen bakterielle Zellsubstrate innerhalb der Assays ermöglichen einen Vergleich der Reaktionsaktivitäten zwischen einem bisher nicht charakterisierten antimikrobiellen Protein und α-Chymotrypsin, einem proteolytischen Kontrollenzym. Diese Protokolle bilden eine Grundlage für die Anwendung der beiden Techniken, die erweitert und modifiziert werden können, um unterschiedlichen Anwendungen gerecht zu werden.

Protocol

1. Herstellung von Bakterien- und Peptidoglycan Substrate

Hinweis: Ganzzellbakterien Substrate und gereinigte Peptidoglykanen verwendet werden als Enzymsubstrate sowohl in der Mikrodia Diffusionstest und dem Farbstoff-Freisetzungstest. Diese Substrate erfordern Vorbereitung vor der Enzymreaktionen durchzuführen. Das folgende Protokoll beschreibt ihre Herstellung.

1. Whole bakterielle Zell Substrat
   1. Produzieren Bakterienzellsubstrat durch Animpfen mit 500 ml Nährlösung mit einer 2 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). bei 30 ° C inkubieren unter Schütteln (125 rpm), bis die Kultur eine exponentielle Wachstumsphase erreicht, als eine schnelle Wachstumsphase definiert, in der Verdoppelung der Bakterienkultur resultiert. Für die Kultivierung von Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), verwenden Nährbrühe als Wachstumsmedium bei 37 ° C unter Schütteln (125 rpm).
   2. Hitze töten jede Kultur durch 10 min Autoklavieren bei 121 ° C unter 3 atm Druck.
   3. Ernten Sie die Hitze abgetötete Bakterien-Substrat durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g. Waschen Sie das Pellet dreimal mit Typ 1 Wasser und Resuspendieren in einer minimalen Menge Wasser. In dieser Studie unterbrechen die Substrate in 1200 ul.
   4. Aliquot 300 ul der Bakterienzellsubstrate zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und lagern bei 20 ° C.
2. Gereinigtes Peptidoglycan Substrat
   1. Reinige Peptidoglycan aus dem Zielsubstrat Bakterium ^7-10 oder zu erwerben , von einem Anbieter (siehe Materialien und Geräte Tabelle). Reinige rohe peptidoglycan Präparate aus Zubehörzellwandpolymere.

2. Qualitative Mikrodia Diffusionstest [Geändert von Lachica, et al. ^11]

Hinweis: Der Mikroobjektdiffusionsassay istein qualitatives Verfahren zur in einer Probe die Anwesenheit von antimikrobiellen Enzym zu detektieren. Da das Enzym durch eine Agarose-Matrix enthält Substrat diffundiert, entwickelt sich eine Zone von Clearing als das Enzym das Substrat hydrolisiert. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Mikroobjektdiffusionsassay für qualitativ die Anwesenheit von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren.

1. Bestimmung der Konzentration des antimikrobiellen Enzym zu evaluierenden eine Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll.
2. Verwenden phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Enzympuffer; jedoch empirisch den Puffer angemessen für das jeweilige Enzym bestimmen.
3. Durchführen einer seriellen Verdünnung der antimikrobiellen Enzym Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) als Reaktionspuffer. Die serielle Verdünnung in diesen Mikrodia Diffusions Assays verwendet produziert endgültigen Testproteinmassen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 & mgr; g und 10 ug pro Reaktionsvolumen.
4. Dispense Proteinmassen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Proteinmengen bis 20 & mgr; l unter Verwendung von PBS in Vorbereitung für das Hinzufügen Reaktionsvertiefungen zu Mikrodia.
5. Machen Sie eine 0,5% Agarose-Lösung durch Auflösen von 0,25 g Agarose in 50 ml PBS. Die Lösung wird zum Sieden, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bestimmen Sie Wasser während des Schmelzprozesses durch Gewicht verloren und zu der Lösung zurück.
6. Werden 50 ul 10% Natriumazid in Wasser zu der Agarose-Lösung und Einstellen der Temperatur der Lösung auf 50 ° C in einem Wasserbad. Das Natriumazid zugegeben während der Inkubation des Mikroobjektdiffusionsassay bakterielles Wachstum kontaminierender zu hemmen. Wenn lebende Zellen als Substrat verwendet werden, lassen Sie das Natriumazid aus der Agarose-Lösung.
7. Auftauen durch Hitze abgetötete Bakterien Substrat auf Eis.
8. Re-suspendieren des bakteriellen Substrat in 12 ml der Agarose-Lösung auf etwa die Trübung einer 2,0 McF übereinarland Äquivalenz - Standard (siehe Materialien Tabelle). Vergleichen Sie die Trübungen der Lösungen durch eine schwarze Linie auf weißem Hintergrund durch die Lösungen zu visualisieren, das Hinzufügen bakterielle Substrat zu dem Agarose, bis die ungefähre Trübung erreicht wird.
9. Pipettieren sofort 3 ml der Agarose-Substratlösung zu jedem Mikroobjekt (25 x 75 x 1 mm ^3).
10. Nachdem die Objektträger zu verfestigen, Punsch drei Brunnen in der Agarose-Substratschicht jedes Mikrodia eines Korkbohrers (4,8 mm Durchmesser) verwenden. In 20 ul jeder eingestellten Protein serielle Verdünnung auf ihre jeweiligen Vertiefungen.
11. Verwenden PBS (20 ul) oder Rinderserumalbumin (5 ug in 20 ul PBS) in einer negativen Kontrollvertiefung. Verwenden bekannt bakteriolytischen Enzyme geeignet für das Substrat, beispielsweise Lysozym, als eine positive Kontrolle.
12. Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C oder die optimale Aktivierungstemperatur des Enzyms. Die Länge der Inkubation ist abhängig von der Konzentration undspezifische Aktivität des antimikrobiellen Enzyms. Eine typische Reaktionszeit ist über Nacht (ca. 16 h).
13. Nach der Inkubation beobachten die Folien unter indirektem Licht und die Aufnahmen des Entwicklungs Assay eine digitale Spiegelreflexkamera mit einem 60-mm-Objektiv mit einer Brennweite von ca. 30 cm verwendet wird.
    Anmerkung: Die enzymatische Aktivität des Proteins antimikrobielle für das gegebene Substrat wird mit der Entwicklung einer klaren Zone der Hydrolyse korreliert, die um das Bohrloch bildet, wie das Enzym in die Agarose diffundiert.
14. Um die enzymatische Aktivität zu qualifizieren, beachten Sie die Größen der Zonen, die gut um jeden bilden. Hohe enzymatische Aktivität bezieht sich qualitativ auf eine größere Zone, während niedrige enzymatische Aktivität qualitativ zu einem kleineren Bereich bezieht.

3. Substrat Beschriften - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Geändert von Zhou ^12]

Anmerkung: In dem Farbstoff-Freisetzungsassay ist das Substrat kovalent linked REMAZOL Brillantblau R-Farbstoff. Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung von gefärbten Enzymsubstrate.

1. Machen Sie eine 250 mM Natriumhydroxid (NaOH) Lösung durch Auflösen von 1 g NaOH in 99 ml Typ I Wasser werden zur Herstellung einer 200 mM Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) Lösung eingesetzt.
2. Machen Sie eine 200 mM RBB-Lösung durch Auflösen von 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml einer frischen 250 mM NaOH-Lösung (Schritt 3.1).
3. Hitze abgetöteten Bakterienzellen bei einer Konzentration von 0,5 g Naßgewicht in 30 ml RBB Lösung Re-suspendieren. Für gereinigte Peptidoglycan, resuspendieren die Peptidoglycan in einer Konzentration von 0,3 g Naßgewicht in 30 ml RBB-Lösung.
4. Inkubieren des Reaktionsgemisches in einem Erlenmeyerkolben auf einer rotierenden Plattform für 6 h bei 37 ° C unter vorsichtigem Mischen.
5. Übertragen das Reaktionsgemisch auf eine 4 & deg; C-Inkubator, und Inkubation für weitere 12 h unter vorsichtigem Mischen.
6. Nach der Inkubation ernten das gefärbte Substrat durch Zentrifugation bei 3000 · gfür 30 min. Man dekantiert die Farbstofflösung aus dem Substrat Pellets.
7. Entfernen nicht-kovalent gebundene lösliche Farbstoff aus der Substrate durch Waschen der farbstoffmarkierten Zellen oder Peptidoglycan wiederholt (etwa 3-5 Waschungen) mit Typ I Wasser, gefolgt von Zentrifugation. Mit jeder Wasserzugabe wieder aussetzen gründlich das Pellet.
   Hinweis: Wenn Sie nicht gebundenen, löslichen Farbstoff in der Wasserwäsche nach dem Zentrifugieren nicht mehr sichtbar ist. Das Substrat sollte eine zusätzliche Wäsche gegeben werden. Beachten Sie, dass das Substrat blau bleiben wird, während der Überstand der letzten Wäsche klar sein wird.
8. Speichern der gefärbten Substrate in einer minimalen Menge Wasser bei -20 ° C suspendiert für die spätere Verwendung.

4. Quantitative Dye-Release-Assay

Anmerkung: Während der Farbstoff-Freisetzungsassays, die Hydrolyse von RBB-gefärbtes Substrat in der enzymatischen Reaktion Meldungen Produkte in die Reaktionsüberstand gefärbt. Kolorimetrische Messung der Menge an Farbstoff freigesetzt zeigt die amount der enzymatischen Aktivität, die innerhalb der Probe für ein bestimmtes Enzym. Die quantitative Methode erlaubt den Vergleich verschiedener Enzyme auf Substrate und ermöglicht eine Variation der Umgebungsbedingungen um die enzymatische Reaktion zu beeinflussen (zB Temperatur, Salzgehalt und pH - Wert). Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Leistung des Farbstoff-Freisetzungsassay zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Protein antimikrobiellen Mitteln zu detektieren.

1. Testvorbereitung Farbstoff-Freisetzung
   1. Erlauben es dem gefrorenen gefärbten Substrates auf Raumtemperatur zurückkehren und zweimal mit Assaypuffer (PBS) waschen, die empirisch für die gegebene Enzym bestimmt wird.
   2. Berechnen des Volumens der Substratsuspension, die durch Multiplizieren der 200 & mgr; l Reaktionsvolumen durch die Anzahl der Farbstofffreisetzungsassays benötigt wird, durchgeführt werden.
   3. Vorbereiten der Substratsuspension durch gefärbten Substrates zum Volumen des Assaypuffer Zugabe, bestimmt in 4.1.2, bis eine optische Dichte (OD) von 2,0 bei 595 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers erreicht. Bleiben innerhalb der funktionellen Grenzen des Spektrophotometers, messen die 2,0 OD ₅₉₅ als 1,0 für eine 1: 1 - Verdünnung der konzentrierten Lösung. Verwenden Sie Testpuffer als leer.
      Hinweis: Das Substrat Trübung für die Reaktion kann über 2,0 angehoben werden, um die Aktivitätsniveaus von hoch effizienten Enzymen passen.
   4. Suspendiere das Protein antimikrobielle werden in Assaypuffer bei einer geschätzten Konzentration von 1 mg / ml bewertet.
   5. Verwendung des Mikroplatten-Assay eines BCA Protein Assay Kit nach Herstellerprotokoll entsprechend bestimmen die tatsächliche Konzentration der Proteinprobe untersucht werden. Stellen Sie die Konzentration der Stoffsuspension zu 1 mg / ml Testpuffer verwendet.
2. Unter Verwendung des Dye-Release-Assay, um die optimale Inkubationsbedingungen Bestimmen Sie für ein Protein Antimicrobial
   1. Von der Stamm Protein antimikrobielle Suspension auf 100 ng / ul. Diese Konzentration gibt afMasse inal Reaktion von 1 ug Protein pro Volumen (10 ul) hinzugefügt, um die Testreaktion.
   2. Ermitteln des thermischen Bereich für das bakteriolytisch Protein zu bewerten. Der thermische Bereich in diesen Assays eingeschlossen 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C und 65 ° C.
   3. Führen Sie die Reaktionstests in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für jeden thermischen Zustand, mit 10 & mgr; l des Aktien Protein zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension.
   4. Inkubiere in einem Thermozykler für 8 h unter Mischen durch Inversion einmal pro Stunde.
   5. Nach der Inkubation verhaften die Reaktionen durch Zugabe von 25 & mgr; l Ethanol.
   6. Entfernen unverdauten, unlösliches Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min und übertragen 150 & mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets von unverdauten Substrat zu stören.
   7. Messung der enzymatischen Aktivität des Proteins Antimicrobial für das gegebene Substrat durch die Menge an löslichem Farbstoff RBB Bestimmung dissoziiert von dem Substrat nach der enzymatischen Hydrolyse. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt ist eine quantitative Messung der enzymatischen Aktivität.
      Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse in einer 0,01 Zunahme der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Die optimale enzymatische Temperatur liefert die Spitzenaktivität Einheit Messung.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.7 verschiedene Inkubationspuffer verwendet, um die optimalen Pufferbedingungen für die antimikrobielle Enzyms zu bestimmen. in tiese Assays verwenden PBS.
3. Unter Verwendung des Dye-Release-Test zur Bestimmung der minimalen Wirkstoffkonzentration bei der optimalen Inkubationstemperatur für ein Protein Antimicrobial
   1. Führen Sie eine serielle Verdünnung der Stamm antimikrobiellen Proteinsuspension unter Verwendung von Assay-Puffer. Die Verdünnungsreihe Bereich wird mit der Aktivität des antimikrobiellen Enzym variieren. Die serielle Verdünnung in diesen Assays verwendet hergestellten endgültigen Testproteinmengen von 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug und 10 ug.
   2. Führen Sie jede Reaktionstest in einer 48-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Für jeden Test erhalten, fügen Sie 10 ul der jeweiligen Proteinsuspension zu 200 ul der vorbereiteten Substratsuspension. Einstellen Variation des Volumens der Proteinlösung zu dem Reaktions bis 10 & mgr; l Reaktionspuffer verwendet.
   3. Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit Plattensiegelfolie Volumenänderung durch Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei der ermittelten optimalen incubation Temperatur für die gegebene Protein antimikrobielle für 16 Stunden unter Schütteln.
   4. Nach der Inkubation verhaften, die Reaktion durch 25 & mgr; l Ethanol Zugabe zu jeder Vertiefung und entfernen unverdaute Substrat durch Zentrifugation bei 3000 × g für 2 min.
   5. Übertragung von 150 & mgr; l des Reaktionsüberstand für jede Reaktionsmischung auf eine 96-Well-Flachboden-Mikroplatte, dabei nicht des Pellets des unverdaute Substrat zu stören.
   6. Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, messen die Absorption des Überstands bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer verwendet wird. Eine Blindreaktion, wobei alle Reaktionskomponenten außer Enzym inkubiert wird verwendet, um alle Farbstoff zu subtrahieren, die durch die Inkubation aus der RBB-markiertes Substrat freigibt. Erhöhte Absorption durch den Farbstoff löslich in den Überstand von dem markierten Substrat freigesetzt liefert ein quantitatives Maß der enzymatischen Aktivität.
      Hinweis: Die Änderung der Absorption von Aktivitätseinheiten (AU) dargestellt wird, wobei 1 AU Ergebnisse ina 0,01 Erhöhung der optischen Dichte der Farbstofffreisetzungsreaktion Überstand bei 595 nm.

Results

Der Mikrodia Diffusionstest und die quantitative Farbstoff-Freisetzungstest sind wirksame Methoden für das Screening und erste Untersuchungen neuer Protein antimikrobielle Substanzen zu messen. Jeder Test hat Vorteile und Grenzen; aber wenn sie in Verbindung durchgeführt werden, ermöglichen sie schnelle anfängliche Screening und die grundlegende Charakterisierung eines antimikrobiellen.

Der Mikrodia Diffusionstest ermöglicht es effizient für das schnelle Screening von mikrobiellen Bibliotheken, Protein antimikrobielle Substanzen produzieren. Wenn die Enzymkonzentration bedenklichen Werte sind, die Empfindlichkeit der Detektionsbeschränkungen kann der Test zu begrenzen, eine größere Menge an Enzym erforderlich, um die Reaktion hinzugefügt werden und als der Farbstoff-Freisetzungsassay. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist , erlauben die qualitativen Eigenschaften des Assays der Beobachter relativ Enzymmengen und innerhalb jeder Gegenwart zu vergleichen.

1A (25 & mgr; g Enzym), zeigt die Vorderkante der Zone trübe oder unvollständige Lyse des Substrats, während die Zone zur nächsten gut zeigt ein vollständigeres Substrat Lyse. Dieses Phänomen, das ein Produkt der abnehmenden Konzentration des streuenden Enzyms an der Vorderkante, erschwert die genaue Messung der Zonendurchmesser. Da die Vertiefungen B (15 & mgr; g), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug) und F (0,1 & mgr; g) in 1 beobachtet werden, verflüchtigt sich der Durchmesser der Zone der vollständigen Lyse Extinktion die reduzierte Menge des Enzyms korreliert. Für Zustand F (0,1 & mgr; g) ist die Enzymkonzentration in der Agarose unter der Grenze, die die Diffusions Enzym erlauben wird, sichtbar gemacht werden, wie es durch die Agarose sich bewegt, um das Substrat zu hydrolysieren. Der Mikrodia Diffusionstest wurde durchgeführt , auch gereinigte Bacillus subtilis Pepti mitdoglycan als Substrat (Abbildung 2). Während die Zone als die mit ganzen Zelle Salmonella enterica , um die Reluktanz des Peptidoglycan aufgrund beobachtet weniger definiert ist , gleichmäßig in der Agarose suspendieren, ist die Hydrolyse des Peptidoglycan durch die unbekannte antimikrobielles Enzym offensichtlich.

Der Farbstoff-Freisetzungs-Assay ist ein empfindlicher und vielseitiger Test als der Mikrodia Diffusionstest, eine niedrigere Nachweisgrenze und Variation von Umweltfaktoren ermöglicht die Enzymreaktion zu beeinflussen. In den repräsentativen Assays wurde, die Temperatur , die optimale Temperatur für die antimikrobiellen Enzyms zu bestimmen variiert, bestimmt 35 ° C in PBS werden (Abbildung 3). Dieses Optimum wird als erhöhte Mengen an blauen Farbe (3B) sowie dargestellt in Aktivitätseinheiten , abgeleitet von Absorptionsmessungen bei 595 nm (3A) deutlich in den Reaktionsüberstand gesehen. DasVielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt es dem Forscher nicht nur die Temperaturen variieren, aber die Reaktionspuffer und Pufferkomponenten auch eine optimale Inkubationsbedingungen für ein gegebenes Enzym schnell zu bestimmen.

Das Aktivitätsniveau des unbekannten antimikrobiell Enzym (Abbildung 4) und der α-Chymotrypsin Steuer Enzym (Figur 5) wurden in der bestimmten optimalen Inkubationstemperatur von 35 ° C in PBS gegen RBB-markiertem Bacillus subtilis hitzegetöteten Substrat gemessen. Vergleich der Ergebnisse von 4 und 5 zeigt an, daß das unbekannte antimikrobielles Enzym hat fast die doppelte Affinität für die B. subtilis Substrat. Darüber hinaus hat die α-Chymotrypsin Kontrolle nicht vollständig verdauen die durch Hitze abgetöteten B. subtilis Substrat innerhalb der Vertiefung (Daten nicht gezeigt). Die Aktivität der α-Chymotrypsin Steuerung beginnt zu plattierenau rund 0,3 ug im Vergleich zu der fortgesetzten Anstieg der Aktivitätseinheiten in allen Enzymmengen für das unbekannte antimikrobielle Enzym (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies kann darauf hindeuten , dass das unbekannte Enzym eine größere anhaltende Aktivität aufweist oder , dass es eine größere Anzahl von Spaltstellen zur Verfügung zu dem Enzym innerhalb der B. subtilis Substrat.

Abb . 1: Enzymaktivität gegen Salmonella enterica Ganze Zellsubstrat Der Mikrodia Diffusionstest wurde verwendet , um die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobielle gegen Hitze abgetötete Salmonella enterica subsp qualitativ bewerten ente (ATCC 10708).. Die Proteinmassen des unbekannten antimikrobiell suspendiert in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die zu den jeweiligen Vertiefungen zugegeben wurdendie Folien enthalten 25 ug (gut A), 15 & mgr; g (gut B), 10 & mgr; g (gut C), 5 ug (gut D), 1 & mgr; g (gut E) und 0,1 ug (gut F). PBS allein wurde für die negativen Kontrollen der Assays verwendet. Zonen der Lyse nach einer 6 - stündigen Inkubation abgebildet wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 2: Enzym - Aktivität gegen Bacillus subtilis Zellwand - Peptidoglycan Der Mikroobjektdiffusionsassay wurde verwendet , um qualitativ die Aktivität eines unbekannten Proteins antimikrobiell gegen Peptidoglycan von Bacillus subtilis 168 auszuwerten. Suspendiert in 20 & mgr; l PBS, 10 & mgr; g des unbekannten antimikrobiell wurde gut A der Mikroobjekt zugegeben. PBS allein wurde als negative verwendetKontrolle für den Test (gut B). Die Zone der Lyse nach einer 6-stündigen Inkubation bei 37 ° C abgebildet wurde. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig . 3: Optimale Reaktionstemperatur für ein Protein Antimicrobial Die Vielseitigkeit des Farbstoff-Freisetzungsassay erlaubt die Veränderung der physikalischen und chemischen Parameter, wie Inkubationstemperaturen und Puffer, um deren Einflüsse auf die Aktivität des Enzyms von Interesse ⁶ bestimmen. Wie in dieser Figur dargestellt ist , die Aktivität des unbekannten Proteins antimikrobielle (1 ug) wurde in PBS gegen RBB-markiertem Hitze abgetöteten Bacillus subtilis unter verschiedenen Inkubationstemperaturen ausgewertet. Angezeigt als Aktivitätseinheiten (AU) in (A), die Absorption von RBB-bound Produkte in den Überstand freigesetzt nach Hydrolyse bei 595 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen wurde. Bei jedem Temperaturzustand, Reaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes zu subtrahieren, die von der Inkubation bei verschiedenen Temperaturen geführt. Die Reaktionsüberstand auf jeder Inkubationstemperatur entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessung (B) abgebildet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Aktivitätsbereich für ein Protein Antimicrobial Der Aktivitätsbereich für das unbekannte Protein antimikrobielle wurde als Aktivitätseinheiten nach über Nacht Inkubationen gemessen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng , wie von der BCA prot gemessenein Test (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5:. Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin der Aktivitätsbereich für α-Chymotrypsin wurde als activ gemessenkeit Einheiten nach über Nacht Inkubationen für 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 und 1000 ng Enzym (A). Für diese Reaktionen, die RBB-markiertes B. subtilis Substratniveau erhöht wurde eine optische Dichte von 5,0 bei 595 nm zu geben , um sicherzustellen , daß die Reaktion mit der höchsten Menge an Enzym (1000 ng) nicht vollständig den gesamten verfügbaren Substrat innerhalb der Reaktions Inkubationsperiode hydrolysieren. Kontrollreaktionen ohne zugegebenes Enzym wurden verwendet, um die Auswirkungen eines freigesetzten Farbstoffes durch die Inkubation allein verursacht zu subtrahieren. Die Reaktionsstände zu jedem Enzymmenge entsprechen , wurden vor der Absorptionsmessungen (B) abgebildet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Der Mikrodia Diffusionstest und der Farbstoff-Freisetzungstest bieten Vorteile für den Nachweis und die zuvor nicht identifizierte Protein antimikrobielle Substanzen zu charakterisieren. Diese schnelle und empfindliche Methoden ermöglichen Hochdurchsatzscreening von Organismus-Source-Bibliotheken für die Identifizierung von Enzymen von Interesse vor der größeren Forschungsressourcen zu investieren. Als Hochprofil Zielenzyme identifiziert sind, können Variationen der Nachweistests verwendet werden, um schnell das Enzym nachzuweisen oder biochemischen Eigenschaften des Enzyms zu bestimmen. Zum Beispiel kann der Mikroobjektdiffusionsassay erkennen während eines vielstufigen Proteinreinigungsschema, schnell Fraktionen, die das Enzym von Interesse enthält. Zusätzlich Reaktions optima für das Enzym kann durch Änderung der Reaktionspuffer und Inkubationstemperaturen in dem Farbstoff-Freisetzungstest bestimmt werden.

Der Bereich der Enzymmasse erforderlich für die Detektion in dem Mikroobjektdiffusionsassay ist eine Funktion der Enzym CHARAKTERIstics. Detektions Einschränkungen des Assays erfordern im allgemeinen die Verwendung von höheren Mengen an Enzym als die Farbstoff-Freisetzungsassay. In dieser Studie wurde ein Vergleich der Nachweisgrenzen des Mikroobjektdiffusionstest (Figur 1) zu dem Farbstoff-Freisetzungs - Assay (Figur 4) veranschaulicht , dass der Mikroobjektdiffusionstest eine weniger empfindliche Technik ist als der Farbstoff-Freisetzungsassay ist. Wenn Enzymkonzentration kein Problem ist, kann der Mikrodia Test für schnelle anfängliche Screening von Bibliotheken für die Herstellung von Protein antimikrobielle Wirkstoffe gegen Zielsubstrate mit geringer Arbeit und Ausrüstung verlangt. Obwohl mehr Aufwand und Ausrüstung erfordern, wird das Farbstoff-Freisetzungs-Assay empfindlicher und reproduzierbarer und ergab quantitative Ergebnisse, die einen Vergleich zwischen Farbstofffreisetzungstests der gleichen oder verschiedene Enzyme für ein gegebenes Substrat zu ermöglichen. Die beiden Methoden sind leicht für hoch spezialisierte Instrumentierung, ohne dass in den meisten mikrobiologischen Laboratorien durchgeführt. In der Vertretive Assays, die Steuer Enzym α-Chymotrypsin, wurde bei Mengen so niedrig wie 100 ng (Abbildung 5) unter Verwendung der Farbstofffreisetzungsassay detektiert wird , während die minimale Menge in dem Mikroobjektdiffusionsassay detektiert 1 & mgr; g (Daten nicht gezeigt).

Bereitstellen Brauchbarkeit als qualitative Nachweistest für antimikrobielle Enzyme, wurden eine Reihe von Variationen des Diffusionstest wurden ^11,13 gemeldet. Bei der Überprüfung dieser Assays wurde die Mikroobjektdiffusionsassay für seine relativ hohe Empfindlichkeit als Anfangsbild und für seine einfache Reaktions Einhaltung entwickelt. Modifizierte aus der Arbeit von Lachica et al. ^11, bei der Agarose - Overlays wurden verwendet , um die Produktion von Nukleasen durch Stämme von Staphylococcus aureus zu erfassen, arbeitet der Mikroobjektdiffusionstest ähnlich zu der radialen Immundiffusionsverfahren ¹⁴ , wie das Protein aus dem Bohrloch in das diffundiert Agarose, enthaltend das Substrat. Die radiale immunodiffusion Verfahren hält die Ausdehnung der Zone der Immunpräzipitation, wenn das System eine komplexe Bildung Gleichgewicht zwischen dem diffundierenden Antigen und Antikörper in der Agarose erreicht. Im Gegensatz dazu ist das Substrat des Mikroobjektdiffusionsassay anfänglich durch die diffundierende Protein antimikrobielles in einer ständig wachsenden Zone der Lyse umgebenden gut verdaut. Der zunehmende Durchmesser der Zone fortgesetzt, bis die Enzymaktivität oder das Substrat verliert erschöpft ist. Die Rate der Erzeugung der Zone der Lyse wird als die Reinheit beschleunigt und damit die spezifische Aktivität des Enzyms oder der Konzentration des Enzyms zu den gut zunimmt zugegeben.

Für die enzymatische Aktivität von Protein antimikrobielle Mittel gegen Hitze abgetöteten B. quantitativ beurteilen subtilis, wobei das Farbstoff-Freisetzungsassay wurde ausgewählt. Kolorimetrische Assays Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) mit -markierten Substraten vielseitig und sensibel Bewertung von Protein antimikrobiellen activi erlaubenty. Enzymatische Hydrolyse von RBB-markiertes Substrat führt zur Freisetzung von löslichen blauen Produkte, die leicht durch ein Spektrophotometer bei 595 nm gemessen werden kann. Mehrere Variationen des RBB Farbstoff-Freisetzungstest, andere Protein antimikrobielle Enzyme zur Charakterisierung entwickelt, zeigen die Flexibilität dieses Tests für die Anwendung mit anderen Substraten. Zum Beispiel, um die Auswirkungen von Lysostaphin bakteriolytisch Aktivität bei der Bestimmung, Zhou et al., Berichtet ein Farbstoff-Freisetzungstest RBB-gefärbten Staphylokokken - Zellen und Staphylokokken peptidoglycan als Substrate ¹² verwendet wird . In einer Abwandlung der Anwendung dieses RBB Farbstoff-Freisetzungstest, Micrococcus-RBB markierte luteus Substrat wurde für die Verwendung als schnelle und empfindliche Mittel vorgeschlagen zu diagnostizieren und Bildschirm für Krankheiten wie bakterielle Infektion und das Vorhandensein eines bösartigen Karzinom, dem die menschliche Lysozym - Expressionsniveaus im Blutserum ¹⁵ korreliert werden. Darüber hinaus RBB-markierte Bakterienzellsubstrate haben eineLSO wurde in einem Zymogramm Verfahren zum Nachweis von Lysozym ¹⁶ verwendet.

Wir zeigen die Nachweisgrenze gesenkt, Bequemlichkeit und Reproduzierbarkeit des Farbstoff-Freisetzungstest, so dass für eine schnelle Bibliothek-Screening für die Enzymproduktion. Modifikationen des Assays ermöglichen nachgeschalteten quantitative biochemische Charakterisierung Assays, einschließlich der Auswirkungen von Temperatur, pH und Salzgehalt , sowie die Auswirkungen anderer proteolytischer Enzyme auf die Aktivität von antimikrobiellen Proteinen ^6. Darüber hinaus kann die quantitative Farbstofffreisetzungsassay verwendet werden, die Aktivitäten mehrerer Enzyme, die für ein gegebenes Substrat zu vergleichen. Der RBB Farbstoff-Freisetzungstest wurde auf die Charakterisierung und Nachweis von Protein antimikrobielle Mittel zusätzlich Dienstprogramm für Enzyme mit Aktivität gegen Polysaccharide berichtet. Pettersson und Eriksson berichtet einen Test zum Nachweis von Endoglycanase Aktivität unter Verwendung von amorphen, RBB-gefärbten Polysaccharidkügelchen aus Cellulose, Xylan, Mannan und Chitin ^17. In einer Erweiterung dieser Feststellungen, ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chitinase von Bacillus thuringiensis Bt-107 produzierten Enzyme wurde ¹⁸ unter Verwendung von kolloidalem Chitin , markiert mit RBB entwickelt. Aus diesen und anderen Studien, im Handel erhältliche Quellen von RBB-gefärbten Substrate wurden für die Verwendung beim Nachweis von glykolytischen Aktivität, einschließlich solcher gegen Keratin, Amylopektin, Amylose, Glycogen, Laminarin, D-Xylan, Azo-barley Glucan und Stärke entstanden.

In dieser Studie zeigen wir die Nützlichkeit des Farbstoff-Freisetzungs-Assay in einem Mikroplattenformat, das Volumen des RBB-markiertem Substrat und Enzym erforderlich ist, reduziert die kolorimetrische Ergebnis zu erzeugen. Wie in 4 veranschaulicht und Figur 5 stellt die Mikrotiterplatte Farbstofffreisetzungsassay eine untere Nachweisgrenze als die Mikroobjektdiffusionsassay für die enzymatische Aktivitätserkennung. Im Hinblick auf den schnellen Einsatz, die Erhaltung der Arbeit und der Leichtigkeit der Interpretation, die microslide Diffusionsassay liefert Dienstprogramm in anfänglichen Hochdurchsatz-Screens für die Anwesenheit antimikrobieller Aktivität sowie die Angabe des antimikrobiellen Proteins in Anwesenheit nachgeschalteten Protein Isolierungs- und Reinigungsschritte. Die Kombination dieser beiden Assays ergänzen sich in der ersten Screening und ultimative Charakterisierung neuartiger Protein antimikrobielle Wirkstoffe

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-Well-Mikroplatte mit flachem Boden und niedrigem Verdampfungsdeckel	Becton Dickinson	3078
96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
Agarose	Fisher Scientific	BP162-100
α-Chymotrypsin	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
Korkbohrer	Humboldt	H-9661
Lysozym	Sigma-Aldrich	L6876-1G
McFarland Äquivalenzstandard (2.0)	Fisher Scientific	R20412
Objektträger	Fisher Scientific	22-38-103
Nährstoffbrühe	Fisher Scientific	S25959B
Peptidoglykan von Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)	Teknova	P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit	Life Technologies	23227
Synergy HT Mikrotiterplatten-Spektralphotometer	BioTek Instruments, Inc.
Remazol brillantblauer R-Farbstoff (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
Natriumazid	Fisher Scientific	S227-100
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher	Scientific S318-500
Titer Tops vorgeschnittene selbstklebende Polyethylenfolie	Diversifizierte Biotechnologie	T-TOPS-50
Ultrareines destilliertes Wasser	Invitrogen	10977-015
Name<	strong>Unternehmen	Katalognummer	<>Kommentare
Lösung
Agaroselösung 50 ml PBS 0,25 g Agarose			Geben Sie 10 % Natriumazid zur geschmolzenen PBS/Agarose-Lösung
Nährbrühe medium 4 g Nährbrühe 500 ml Wasser
250 mM Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung 1 g NaOH 99 ml Wasser
Typ I200 mM Remazol Brillantblau R Farbstoff (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml 250 mM NaOH Lösung