Dieses Manuskript beschreibt ein einfaches und reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von intrazerebralen Arteriolen (eine Gruppe von Blutgefäßen, die parenchymale Arteriolen, penetrierende Arteriolen und präkapilläre Arteriolen umfasst) aus Mäusen, die in Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekularen Studien verwendet werden sollen.
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Methodenartikel
Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Intrazerebrale parenchymal Arteriolen (PAs), die parenchymal Arteriolen umfassen, eindringende Arteriolen und präkapillaren Arteriolen, sind hohe Beständigkeit Blutgefäße aus pialen Arterien und Arteriolen und tauchen in das Hirnparenchym Verzweigung. Einzelne PA einen diskreten zylindrischen Gebiet des Parenchyms perfuse und die Neuronen darin enthaltenen. Diese Arteriolen sind ein zentraler Akteur in der Regulation des zerebralen Blutflusses global beide (zerebrovaskuläre Autoregulation) und lokal (funktionelle Hyperämie). PAs sind Teil der neurovaskuläre Einheit, eine Struktur, die innerhalb des Gehirns regionalen Blutfluss zu Stoffwechselaktivität entspricht, und umfasst auch Neuronen, Inter und Astrozyten. Perfusion durch PAs ist mit der Aktivität von Neuronen in diesem bestimmten Gebiet und steigt in neuronalen Metabolismus führen zu einer Vermehrung der lokalen Perfusion verursacht durch Dilatation des Zuführungs PA verknüpft. Verordnung von PAs unterscheidet sich von der besser charakterisiertepialen Arterien. Druck-induzierte Vasokonstriktion größer in PAs und gefäßerweiternde Mechanismen variieren. Darüber hinaus erhalte PAs nicht extrinsische Innervation von perivaskulären Nerven - Innervation ist intrinsische und indirekt in der Natur durch den Kontakt mit astrozytären Endfüßen. So Regelung in Bezug auf Datenkontraktions durch Studien angehäuft pialen Arterien mit übersetzt nicht direkt an Funktion PA zu verstehen. Weiterhin bleibt es unbestimmt, wie pathologische Zustände, wie Bluthochdruck und Diabetes, PA Struktur und Reaktivität beeinflussen. Diese Wissenslücke ist eine Folge der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit PA Isolierung und Kanülierung teilweise. In diesem Manuskript präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung und Kanülierung Nagetier PAs. Weiterhin zeigen wir Beispiele von Experimenten, die mit diesen Arteriolen durchgeführt werden kann, einschließlich Agonisten induzierte Konstriktion und myogenen Reaktivität. Obwohl der Schwerpunkt dieses Manuskript auf PA Kanülierung und Druck Myographie ist, isoliert PAs kann auch für die biochemische, biophysikalische, molekularen und Imaging-Studien verwendet werden.
Einleitung
Die cerebrale Durchblutung wird eindeutig organisiert die metabolischen Anforderungen von zentralen Neuronen zu unterstützen, Zellen, die Energie speichert und sind daher sehr empfindlich gegenüber Veränderungen in der Sauerstoffdruck und die Lieferung von notwendigen Nährstoffe begrenzt haben. Als besondere neuronale Subpopulationen aktiv wird , wenn bestimmte Aufgaben durchgeführt werden, fördert die Gefäß eine stark lokalisierte Zunahme der Perfusion 1 lokale Hypoxie und die Erschöpfung der Nährstoffe zu verhindern. Dies ist eine Form von funktionellen Hyperämie als neurovaskulären Kopplung bekannt ist , und ist abhängig von der einwandfreien B....
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Protokoll
1. Cannula und Kammer Vorbereitung
- Legen Rein Borosilikat-Glaskapillaren (Außendurchmesser: 1,2 mm; Innendurchmesser: 0,69 mm; 10 mm Länge) in die Nuten einer Pipettenzieher mit einem Platinfaden (Durchmesser: 100 um).
- Mit geeigneten Einstellungen, ziehen Sie die Kapillare eine Kanüle mit einer langen und dünnen Spitze (Abbildung 2) mit einer Mikropipette Abzieher zu erzeugen. Die Einstellungen werden verwendet: Heat - 700, Pull - 100, Geschwindigkeit - 50, Zeit - 10.
- Setzen Sie eine Kanüle in den Halter der Druck Myographions Kammer. Richten Sie die entsprechend Kanülen.
- die Spitzen der Kanülen vorsichtig bre....
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Ergebnisse
5A zeigt eine repräsentative Verengung der Maus PAs auf 60 mM KCl aCSF die Integrität der Zubereitung zu bewerten. 30% in Gegenwart von 60 mM KCl - PAs sollte zwischen 15 verengen. Wenn die Verengung unter 15%, entsorgen Sie die PA und ein anderes kanülieren, wie es legt nahe, dass die Arteriolen bei der Isolierung und Kanülierung beschädigt wurde.
5B stellt PA Verengung Konzentrationen des Th.......
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Diskussion
Cerebral parenchymal Arteriolen sind hohe Beständigkeit Arteriolen mit wenigen Anastomosen und Zweige, die unterschiedliche neuronale Populationen perfuse. Diese spezialisierten Blutgefäße sind zentrale Akteure bei zerebrovaskulären Autoregulation und neurovaskulären Kopplung durch Astrozyten vermittelte Vasodilatation 1. Die Bedeutung dieser spezialisierten Blutgefäße in der zerebralen Gefäßerkrankung ist seit etwa 50 Jahren bekannt, als die Pionierarbeit von Dr. Miller Fisher in den Gebieten von lacunar Inf.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Finanziert durch NHLBI R01HL091905 (SE), das CADASIL Forschungsstipendium (FD) der United Leukodystrophy Foundation und AHA 15POST247200 (PWP). Die Autoren danken Samantha P. Ahchay für die Bereitstellung des Bildes in Abbildung 1 und Dr. Gerry Herrera, Ph.D., für die kritischen Kommentare zum Manuskript.
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Materialien
Isolation/Kanülierung
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl wasserfrei | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9647< | |
| Stereomikroskop | Olympus | SZX7 | |
| Superfeine Pinzette | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Federschere | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μ l | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0,2 μ m Steriler Spritzenvorsatzfilter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Mikropipettenabzieher | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilikatglas Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dunkelgrünes Nylongewinde | Living Systems Instrumentierung | THR-G | |
| Linear Alignment Einzelgefäß-Kammer-Lebendsysteme | Instrumentierung | CH-1-LIN | |
| Druckservoregler mit Schlauchpumpe | Living Systems Instrumentierung | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentierung | VDA-10 | |
| Vierkanal-Recorder mit LabScribe 3 Aufzeichnungs- und Analysesoftware | Living Systems Instrumentierung | DAQ-IWORX-404 | |
| Heizeinheit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatischer Temperaturregler | Warner Instruments | TC-324B |
Referenzen
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Al....
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Nachdrucke und Genehmigungen
