Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Summary

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Abstract

Immunhistochemie ist eine häufig verwendete Nachweistechnik in klinischen und Forschungslaboren zur Untersuchung der Proteinexpression und -lokalisation in Geweben. Viele semiquantitative Systeme wurden für die Bewertung der Expression mittels Immunhistochemie entwickelt, aber die inhärente Subjektivität schränkt die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Ergebnisse ein. Darüber hinaus ist die Untersuchung von räumlich überlappenden Biomarkern wie z.B. nukleären Transkriptionsfaktoren mit den derzeitigen immunhistochemischen Techniken schwierig. Wir haben ein System zur gleichzeitigen Untersuchung mehrerer Proteine mit Hochdurchsatzmethoden der multiplexierten Immunhistochemie und multispektralen Bildgebung entwickelt und optimiert. Die Multiplex-Immunhistochemie wird durch sequentielle Applikation von Primärantikörpern mit Sekundärantikörpern durchgeführt, die an Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase konjugiert sind. Verschiedene Chromogene werden verwendet, um jedes Protein von Interesse zu erkennen. Gefärbte Objektträger werden in einen automatischen Objektträgerscanner eingelegt und ein Protokoll für die automatische Bildaufnahme erstellt. Eine Spektralbibliothek wird erstellt, indem ein Satz von Objektträgern mit jeweils einem einzelnen Chromogen gefärbt wird. Eine Teilmenge repräsentativer gefärbter Bilder wird in multispektrale Bildgebungssoftware importiert und ein Algorithmus zur Unterscheidung des Gewebetyps wird erstellt, indem Gewebekompartimente auf Bildern definiert werden. Subzelluläre Kompartimente werden durch die Verwendung von Hämatoxylin-Gegenfärbung und die Anpassung des intrinsischen Algorithmus segmentiert. Die Schwellenwertbestimmung wird angewendet, um die Positivität und die Proteinkolokalisation zu bestimmen. Der endgültige Algorithmus wird dann auf den gesamten Satz von Geweben angewendet. Die resultierenden Daten ermöglichen es dem Benutzer, die Proteinexpression basierend auf dem Gewebetyp (z. B. Epithelien vs. Stroma) und dem subzellulären Kompartiment (Zellkern vs. Zytoplasma vs. Plasmamembran) zu bewerten. Die Co-Lokalisationsanalyse ermöglicht die Untersuchung von doppelt positiven, doppelt negativen und einfach positiven Zelltypen. Die Kombination von multispektraler Bildgebung mit gemultiplexter Immunhistochemie und automatisierter Bildaufnahme ist eine objektive Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung von Biomarkern in Geweben.

Introduction

Immunhistochemie (IHC) ist eine Standardlaborverfahren zum Nachweis von Protein in Gewebe und IHC ist immer noch weit verbreitet in Forschung und Diagnose der Pathologie verwendet. Die Auswertung der IHC-Färbung ist oft semi-quantitative, Potentialvorspannung in die Interpretation der Ergebnisse einzuführen. Viele semi-quantitative Ansätze wurden die ^1-4 sowohl Färbeintensität und Färbung Ausmaß in die endgültige Diagnose integrieren entwickelt. Andere Systeme sind Scoring - Intensität und subzellulären Ort, um eine bessere Ausdruck ⁵ lokalisieren. Der Einbau von Durchschnittswerte von mehreren Zuschauern wird häufig genutzt , um die Auswi....

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt hierin Färbung und Analyse eines Gewebemikroarray (TMA), die zuvor ^12,17,18 beschrieben. Das 4 um dicke TMA Abschnitt wurde aus einem Paraffinblock mit einem Standard-Mikrotom erhalten.

HINWEIS: Eine spektrale Bibliothek für die 4 Chromogene und counterstain sollte für die Bild Quantifizierung erstellt werden. Um dies zu tun, sollte das optimierte Protokoll für jeden einzelnen Antikörper mit einem Antikörper pro Folie ausgeführt werden, abzüglich der letzten counterstain. Eine fünfte Folie sollte mit Hämatoxylin gefärbt werden, um die 5 Bilder zu erzeugen, benötigt, um die spektrale Bibliothek zu erstellen.

1....

Results

In Figur 1 ist die Ausbildung auf Prostatagewebe zu segmentieren Bilder in Epithel- und Stroma - Abschnitte durchgeführt, zusammen mit dem nicht-Kompartiment. Unter Verwendung der epithelialen Membranmarker E-Cadherin, Zellsegmentierung durchgeführt , den Zellkern, Zytoplasma und Membranabschnitte zu trennen, die in 2 gezeigt.

In einem Experiment haben wir gemultiplexten IHC verwendet , um die.......

Discussion

Die Verwendung von traditionellen Immunhistochemie zur Bewertung der Proteinexpression durch subjektive, semi-quantitative Methoden der Analyse ^22,23 begrenzt. Advance-Plattformen sind für Hochdurchsatz-Analyse von Biomarkern Expression und Lokalisation erstellt. Detaillierte Segmentierung der beiden Gewebe und subzellulärer Kompartimente ermöglicht es Benutzern, Biomarker Ausdruck zu studieren, Lokalisierung und Co-Lokalisation mit anderen Markern von Interesse. In früheren Studien haben wir die Brauchbarkei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylol	Fisher Chemical	X3F1GAL	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 2, Feuer – 3 , Reaktivität – 0
Ethylalkohol-200 proof	Fisher Scientific	4355223	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 0, Feuer – 3 , Reaktivität – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 2, Feuer – 0 , Reaktivität – 0
Tris Hydroxymethylaminomethan HCl	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 2, Feuer – 0 , Reaktivität – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 0, Feuer – 1 , Reaktivität – 0
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Fisher Scientific	BP2944-100	NFPA-Rating: Gesundheit – 1, Feuer – 0 , Reaktivität – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Kann Hautreizungen und Augenschäden verursachen.
Östrogenrezeptor alpha	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Nicht als gefährlich eingestuft
Androgenrezeptor	SCBT	sc-816	Nicht als gefährlich
eingestuft CD147	Biodesign	P87535M	Nicht als gefährlich
eingestuft E-Cadherin	Dako	M3612	Nicht als gefährlich
eingestuft Renoir Red Andibody Diluent	Biocare Medical	PD904	Es wurde speziell für die Arbeit mit Tris-basierten Antikörpern entwickelt
.	Biocare Medical	Modell DC2002	Treffen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung eines Schnellkochtopfs
Barrier Pen-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
Denaturierungskit-Elutionsstufe	Biocare Medical	DNS001H	Nicht als gefährlich eingestuft
Mach 2 Ziege Anti-Kaninchen HRP Polymer	Biocare Medical	RHRP520	Nicht als gefährlich eingestuft
Mach 2 Ziege Anti-Kaninchen AP Polymer	Biocare Medical	RALP525	Nicht als gefährlich eingestuft
Mach 2 Ziege Anti-Maus HRP Polymer	Biocare Medical	M3M530	Nicht als gefährlich eingestuft
Betazoid DAB Chromogen Kit	Biocare Medical	BDB2004	1. DAB steht im Verdacht, krebserregend zu sein. 2. Setzen Sie DAB-Komponenten keinem starken Licht oder direkter Sonneneinstrahlung aus. 3. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und -kleidung. 4. DAB kann zu einer Sensibilisierung der Haut führen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. 5. Beachten Sie alle Umwelteinflüsse auf Bundes-, Landes- und kommunaler Ebene in Bezug auf die Entsorgung
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosive. Säure, die Hautreizungen oder Augenschäden verursachen kann.
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	Gesundheitsschädlich bei Verschlucken
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	Entzündliche Flüssigkeit. Von Hitze, Flammen und Funken fernhalten. Gesundheitsschädlich durch Verschlucken oder Absorption. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Augen und vermeiden Sie das Einatmen.
Katze Hämatoxylin	Biocare Medical	CATHE	Lila   Lösung   mit   a   mild   Essigsäure & nbsp; Säure   (Essig)   Duft.   Mai   be   irritierend   bis   Haut   oder   Augen.   Vermeiden   Kontakt   mit   Haut   und   Augen.   Vermeiden   Ingestion.
XYL Eindeckmedien	Richard Allen	8312-4	NFPA-Bewertung: Gesundheit – 2, Feuer – 3 , Reaktivität – 0
1,5 Deckgläser	Fisher Brand	22266858	Scharfe Kanten
Inkubation (Feuchtigkeit)Kammer	veraltet	veraltet	Mehrere Anbieter verfügbar
Konvektionsofen	Stabil - Therm	C-4008-Q
Hintergrund Punisher Blocking Reagenz	Biocare Medical	BP974	Dieses Produkt ist nicht als gefährlich eingestuft.
inForm-Software	PerkinElmer	CLS135781	Primäre multispektrale Bildgebungssoftware, die in Manuskripten verwendet
wird Nuance-Software	PerkinElmer	Nuance EX	Software zur Erstellung von Spektralbibliotheken innerhalb von Manuskripten
Vectra-Mikroskop und Objektträgerscanner	PerkinElmer	VECTRA	Automatisierter Objektträgerscanner und Mikroskop zur Erstellung von IM3-Bildwürfeln