Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von Coxiella burnetii

Summary

Wir haben hier eine einfache schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) Methode mit lyophilisierten Reagenzien zum Nachweis von C. burnetii in Patientenproben beschrieben.

Abstract

Coxiella burnetii, der Agent Q - Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR - basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.

Introduction

Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q - Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q - Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US - Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert.

Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu En....

Protocol

1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion

1. Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA - Konzentration zu bestimmen. Eine OD ₂₆₀ von 1 entspricht 50 ug / ul DNA.
2. Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 ⁶ g (6.330 bp x 649 g / bp). Die DNA-Konzentration des Plasmids ist 34,2 ng / & mgr; l (wie in Schritt bestimmt 1.1). 1 & mgr; l dieser DNA - Probe enthält 3....

Results

Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 - ml - Röhrchen enthält Bst DNA - Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt werde.......

Discussion

Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP - Targeting - Assay das Einsatzelement IS1111a ^14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser St.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP-Primer	Eurofins MWG Operon	10 nmol, salzfrei	Sequenz designed by customer
Bst DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0275L	8 Einheiten/ml
10x Thermopol-Puffer	New England Biolabs	B9004S
dNTP-Mischung	New England Biolabs	N0447L	je 10 mM
Betain	Sigma-Aldrich	B0300	5 M, Trimethylglycin
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 M
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	Gel-Ladepuffer
SYBR grün	Invitrogen	S7585	10.000x, visualisieren Sie Produkte in Röhrchen
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10.000x, visualisieren Sie Produkte in Gelen
Lyophilisierte Reagenzien	Gene Reach
Hydroxynaphthol blau	Fluka	33936-10G
ESEQuant Röhrchenscanner	Qiagen		Echtzeit-Detektion