Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Abstract

Retroviren zeigen Unterschrift Integration Präferenzen auf beiden lokaler und globaler Ebene. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für (1) Erzeugung verschiedener Bibliotheken von retroviralen Integrationsstellen mit ligationsvermittelte PCR (LM-PCR) und Next-Generation-Sequencing (NGS), (2) die Abbildung der genomischen Ort jedes Virus- Host-Junction mit bedtools, und (3) die Daten für statistische Relevanz zu analysieren. Genomische DNA aus infizierten Zellen extrahiert wird durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch Beschallung fragmentiert. Nach geeigneter DNA end-Reparatur werden doppelsträngigen Linker ligiert an die DNA-Enden, und semi-nested PCR wird unter Verwendung der Primer komplementär zu sowohl der langen terminalen Wiederholung (LTR) Ende des Virus und dem ligierten Linker-DNA durchgeführt. Die PCR-Primer tragen Sequenzen für DNA clustering während NGS erforderlich ist, das Erfordernis für separate Adaptorligation negieren. Qualitätskontrolle (QC) wird durchgeführt, um DNA-Fragment Größenverteilung zu bewerten und anzupassener DNA-Einbau vor NGS. Sequence-Ausgabedateien werden gefiltert für LTR-haltigen liest, und die Sequenzen der LTR und den Linker definieren, werden abgeschnitten entfernt. Getrimmten Wirtszellsequenzen sind mit einem Bezugsgenom kartiert BLAT verwenden und für minimal 97% Identität zu einem eindeutigen Punkt in dem Referenzgenom filtriert. Einzigartige Integrationsstellen sind für benachbarte Nukleotid (nt) Sequenz und Verteilung in Bezug auf verschiedene genomische Merkmale geprüft. Unter Verwendung dieses Protokolls, Integrationsort Bibliotheken von hoher Komplexität kann von genomischer DNA in drei Tagen konstruiert werden. Das gesamte Protokoll, das exogene virale Infektion von empfänglichen Gewebekulturzellen zur Integrationsstelle umfasst Analyse kann somit in etwa ein bis zwei Wochen durchgeführt werden. Neue Anwendungen dieser Technologie beziehen sich auf Langzeitanalyse von Integrationsstellen von HIV-infizierten Patienten.

Introduction

Integration von viraler DNA (vDNA) in das Wirtszellgenom ist ein wesentlicher Schritt in dem retroviralen Lebenszyklus. Die Integration wird durch das virale Enzym Integrase (IN) erreicht, die zwei verschiedene katalytische Prozesse ausführt, die ¹ bis zur Gründung des stabil eingeführt Provirus führen. IN - Untereinheiten greifen in die Enden der linearen vDNA , die durch reverse Transkription erzeugt wird, die höhere Ordnung intasome mit vDNA bilden Enden zusammengehalten von einem IN Multimer ^2-4. IN spaltet die 3' - stromabwärts gelegenen Enden der vDNA aus invariant 5'-CA-3' - Sequenzen in einem Verfahren , wie 3'-Verarbeitu....

Protocol

1. Generieren Virus Stocks

Hinweis: Ein Flussdiagramm der Nassbank Aspekt dieses Protokoll in Abbildung 1 dargestellt ist , um die Details der viralen Lager Produktion und die anschließende Infektion von Gewebekulturzellen werden in der Regel auf verschiedene Arten von Retroviren gelten.. Bei einigen Experimenten kann die Zielzelle , die endogene virale Rezeptor (en) nicht exprimieren, und in solchen Fällen ist die Konstruktion von pseudotypisierten retroviralen Partikeln heterologe virale Hüll - Glycoprotein, zB das G - Glykoprotein von vesikulären Stomatitis - Virus (VSV-G) beherbergt wird erforderlich für die In....

Results

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments , die Empfindlichkeit von NGS zu veranschaulichen für die Integrationsstellen von einer Kultur von infizierten Zellen gewonnen wird . Nicht infizierte Zell - DNA wurde in dem im Durchschnitt jede Zelle eine Integration ⁴⁰ enthaltene genomische DNA von einer Infektion zu seriell verdünnt verwendet. 15.625: Verdünnungen wurden in Schritten von fünf zu einer maximalen Verdünnung von 1 hergestellt. G.......

Discussion

Ein Protokoll für die Analyse der retroviralen Integrationsstellen von der ersten Virusinfektionsschritt durch Kartierung von genomischen Verteilungsmuster, beschrieben. Dieses Protokoll ist anwendbar auf jeden beliebigen Retrovirus und infizierbare Zelltyp. Darüber hinaus ist der Test sehr empfindlich Pipeline, mit dem Potential , eine zufriedenstellende Anzahl von einzigartigen Integrationsstellen von seriellen Verdünnungen der genomischen DNA äquivalent zu einer Infektion mit einer MOI von 6,4 x 10 ^-5 init.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Standard-Zellkulturmedium, kompatibel mit HEK293T Zellen
Fötales Rinderserum	Thermo Scientific	SH 30088.03	Verschiedene Chargen von Serum müssen möglicherweise für eine optimale Virusproduktion vorgescreent werden
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-Cl	Antibiotika, die der
Kochsalzlösung	zugesetzt werden sollen Mediatech	21-040-CV	Zur Reinigung von Zellen
Trypsin EDTA	Corning	25-053-CI	Zur Ablösung adhärenter Zellen von Gewebekulturplatten
PolyJet	SignaGen Laboratories	DNA-Transfektionsreagenz
0,45 &; Mikro; m Filter	Thermo Scientific	09-740-35B	Zur Filterung von Viruspartikel-haltigen Zellkulturmedien
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Zur Degradierung von Plasmid-DNA aus Virusstämmen
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	Wird zur Quantifizierung der Ausbeute der Virusproduktion
verwendet DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	Zur Aufreinigung genomischer DNA aus Zellen
Ultraschallgerät	Covaris	S2	Mit diesem Modell des Ultraschallgeräts führen Sie zwei Zyklen mit einem Tastverhältnis von 5 % durch, Intensität von 3 Zyklen pro Stoß von 200 Zyklen und Zeit von 80 Sekunden
Nukleasefreies Wasser	GeneMate	G-3250-125	wird empfohlen, dass im Handel erhältliches Wasser verwendet wird, um die Möglichkeit einer Kreuzkontamination der Probe zu verringern
QIAQuick PCR-Aufreinigung Kit	Qiagen	28106	Wird zur Aufreinigung von DNA während des Bibliotheksaufbaus
verwendet End-It DNA End-Repair Kit	Epicentre	ER81050	Wird zur Reparatur von DNA-Enden von beschallten DNA-Proben
verwendet Klenow-Fragment (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Wird mit dATP bis A-Schwanz reparierten DNA-Fragmenten
verwendet dATP	Thermo Scientific	R0141	Desoxyadenosintriphosphat
MseI	NEB	R0525L	Restriktionsendonuklease für die genomische DNA-Spaltung
BglII	NEB	R0144L	Restriktionsendonuklease zur Unterdrückung der Amplifikation der vorgelagerten HIV-1 U5-Sequenz
T4 DNA-Ligase	NEB	M0202L/6218	Enzym für das kovalente Fügen kompatibler DNA-Enden
DNA-Oligonukleotide	Integrierte DNA-Technologien	nach Maß	Lassen Sie das Unternehmen die Oligos aufreinigen. HPLC-Aufreinigung reicht für DNAs aus < 30 Nukleotide; PAGE reinigt längere DNAs
Vorteil 2 Polymerase-Mix	Clontech	639202	Kommerzieller Mix mit DNA-Polymerase für
PCR-dNTPs (100 mM-Lösungen)	Thermo Scientific	R0181	Verdünnen Sie die vier Chemikalien auf Eis mit sterilem Wasser, um die störenden Zwischenkonzentrationen von jeweils 2,5 mM zu erreichen dNTP
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Spektralphotometer zur Bestimmung der DNA-Konzentration
Qubit Fluorimeter	Life Technologies	Qubit® 3.0	Fluorometer zur Bestätigung der DNA-Konzentration in der Bibliothek der Integrationsstelle
2200 TapeStation System	Agilent	G2964AA	Tape-basierter Assay zur Bestätigung der Größenverteilung der DNA-Bibliothek an der Integrationsstelle
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Wird für NGS