Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Taghreed Hirz; Charles Dumontet

doi:10.3791/53846

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Methodenartikel

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

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DOI:

10.3791/53846

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25. März 2016

Taghreed Hirz¹ , Charles Dumontet¹

¹Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende Art von weißen Blutkörperchen. Die Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut durch die Dichtegradiententrennungsmethode und die Differenzierung von humanen promyelozytären (HL60) Zellen entlang des granulozytären Weges werden hier beschrieben; ihre Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu testen.

Zusammenfassung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommende (40% bis 75%) Art von weißen Blutkörperchen und gehören zu den ersten Entzündungszellen, die zum Ort der Entzündung wandern. Sie sind wichtige Akteure im angeborenen Immunsystem und spielen eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie. Neutrophile wurden als Schlüsselmediatoren der malignen Transformation, der Tumorprogression, der Angiogenese und bei der Modulation der Antitumorimmunität vorgeschlagen; durch ihre Freisetzung löslicher Faktoren oder ihre Wechselwirkung mit Tumorzellen. Um die spezifischen Funktionen von Neutrophilen zu charakterisieren, ist eine schnelle und zuverlässige Methode für die in vitro Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut begehrt. Hier wird eine Dichtegradienten-Trennungsmethode demonstriert, mit der sowohl neutrophile als auch mononukleäre Zellen aus dem Blut isoliert werden können. Das Verfahren besteht darin, die Dichtegradientenlösung wie Ficoll sorgfältig über das verdünnte Blut von Patienten zu schichten, bei denen chronische lymphatische Leukämie (CLL) diagnostiziert wurde, gefolgt von einer Zentrifugation, Isolierung der mononukleären Schicht, Trennung von Neutrophilen von Erythrozyten durch Dextran und anschließender Lyse der verbleibenden Erythrozyten. Es hat sich gezeigt, dass mit dieser Methode Neutrophile ≥ einer Reinheit von 90 % isoliert werden können. Um die Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen, wurden 3-dimensionale (3D) Experimente mit Basalmembranmatrix wie Matrigel durchgeführt. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro können keine 3D-Experimente mit frischen humanen Neutrophilen durchgeführt werden. Aus diesem Grund werden promyelozytäre HL60-Zellen entlang des granulozytären Weges mit den Differenzierungsinduktoren Dimethylsulfoxid (DMSO) und Retinsäure (RA) differenziert. Das Ziel unserer Experimente ist es, die Rolle von Neutrophilen auf die Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber Anti-Lymphom-Wirkstoffen zu untersuchen. Diese Methoden können jedoch verallgemeinert werden, um die Wechselwirkungen von Neutrophilen oder neutrophilenähnlichen Zellen mit einer Vielzahl von Zelltypen in verschiedenen Situationen zu untersuchen.

Einleitung

Angeborene Immunzellen bilden einen wesentlichen Teil der Zellen innerhalb der Tumor - Mikroumgebung und wurden mit Tumor Malignität in Patienten und Tiermodellen von Krebs ¹ verbunden. Vor kurzem hat es sehr geschätzt werden , dass eine chronische Immunreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemotherapien ² spielen. Makrophagen sind wichtige angeborenen Immunzellen , die direkt gezeigt worden ist, um Tumorzellantwort auf Chemotherapie ^3,4 regulieren. Allerdings ist die Rolle der Neutrophilen, wichtige Akteure in der angeborenen Immunsystems, bei der Regulierung d....