Funktionelle Komplementierung Analyse (FCA): A Laboratory Übung konzipiert und umgesetzt, die Lehre von Biochemical Pathways zur Ergänzung

Summary

Die Validierung der enzymatischen Aktivitäten in biochemischen Wege beteiligt sind, können mit Hilfe der funktionellen Komplementierung Analyse (FCA) erläutert. Beschrieben in diesem Manuskript ist das FCA-Assay der enzymatischen Aktivität von Enzymen involviert in den Metabolismus von Aminosäuren, bakterielle stringenten Antwort und bakterielle Peptidoglycan-Biosynthese zeigen.

Abstract

Funktionelle Komplementierung Assay (FCA) ist ein in - vivo - Test , die häufig verwendet wird , um die Funktion / Rolle der Gene / Enzyme aufzuklären. Diese Technik ist in der Biochemie, Genetik und viele andere Disziplinen sehr verbreitet. Einen umfassenden Überblick über die Technik, um die Lehre der biochemischen Wege zur Ergänzung betreffend Säuren, Peptidoglycan und die bakterielle strenge Reaktion auf Amino ist in diesem Manuskript berichtet. Zwei cDNAs aus der Modellpflanzenorganismus Arabidopsis thaliana , die im Metabolismus von Lysin (L, L-Diaminopimelat - Aminotransferase (DAPL) und Tyrosin - Aminotransferase (tyrB) involviert in den Metabolismus von Tyrosin und Phenylalanin sind markiert. Zusätzlich beteiligt sind, die bakterielle Peptidoglycan anabolen Stoffwechselweg wird durch die Analyse des UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat meso -2,6-Diaminopimelat - Ligase (murE) Gen aus dem Bakterium Verrucomicrobium spinosum im Quer beteiligt hervorgehoben-Verknüpfung von Peptidoglycan. Die bakterielle stringent Antwort wird auch durch die Analyse des rsh (r ELA / s poT h omolog) bifunktionellen Gen für eine hyper mukoiden Phänotyp in dem Bakterium Novosphingobium sp berichtet. Vier Beispiele von FCA vorgestellt. Das Video konzentriert sich auf drei von ihnen, nämlich Lysin, Peptidoglykan und die strenge Antwort.

Introduction

Funktionelle Komplementation im Zusammenhang mit der Funktion Aufklären (n) / Rolle (n) eines Gens wird als die Fähigkeit einer bestimmten homologe oder orthologe Gen definiert eine bestimmte Mutante mit einer beobachtbaren Phänotyp zu dem Wildtyp-Zustand, wenn die homologe wiederherzustellen oder orthologen Gen in cis oder trans in den mutierten Hintergrund eingeführt. Diese Technik wurde verwendet, um weithin isolieren und die Funktion (en) / Rolle (n) vieler Gene zu identifizieren. Ein besonderes Beispiel ist die Isolierung und Identifizierung von Orotidin-5-phosphat - Decarboxylase aus Candida albicans unter Verwendung des ura3....

Protocol

HINWEIS: Die Autoren sind bereit, Bakterienstämme und rekombinante Plasmide bereitzustellen, um den Einbau von funktionellen Komplementierung Analyse zu Lehrzwecken für Personen zu erleichtern, die interessiert sind. Die Plasmide , die verwendet wurden funktionelle Komplementation Experimente zu erleichtern , sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Konstruktion von Plasmiden für Funktionelle Komplementierung

1. Klonierung von Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL) für Funktionelle Komplementierung.
   1. Amplify die DAPL offene Leserahmen (ORF) von der V. spinosum und cDNAs von A. thaliana und ....

Results

Die Bakterienstämme, die in den verschiedenen funktionellen Komplementierung Analysen verwendet werden , sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Funktionelle Komplementierung Analyse: L, L-Diaminopimelinat Aminotransferase (DAPL)

Die E. coli - Doppelmutante AOH1 (Δ dapD :: kan2, dapE6) birgt eine Mutation in dem Gen dapE und eine vo.......

Discussion

Viele der Kurse, die auf die Biotechnologie und Molekulare Biowissenschaften Lehrplan am Rochester Institute of Technology integral sind, haben eine Laborkomponente zusätzlich zur Vorlesung Teil des Kurses. Der Lehrplan für das akademische Jahr 2014-2015 enthält insgesamt 48 Kurse, von denen 29 eine Laborkomponente enthalten, die etwa 60% darstellen. Ein solcher Kurs ist Grundlagen der Pflanzenbiochemie und Pathologie (FPBP), einem gemischten Vorlesung / Praktikum und Bioseparations: Principles and Practices (BPP), eine.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli Mutanten	Hudson/Savka Labor oder CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Elektroporator	Biorad-USA	1652100
Elektroporationsküvetten	Biorad-USA	1652082
Temperaturgesteuerter Inkubator	Generische
Mikrozentrifuge	Generisches
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Bouillon	Thermofisher	Scientific 12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Kartoffel Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelat	Sigma-Aldrich	92591
Thymin	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosin	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanin	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartat	Sigma-Aldrich	A9256
Valin	Sigma-Aldrich	V0500
Leucin	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucin	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA-Polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platin pfx DNA-Polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA-Ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher	Scientific C4040-03
pET100D/Topo Vektor	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vektor	Thermofisher Scientific	K2030-01