Method Article

Kapillar-basierten Kreisel Mikrofluidik-Vorrichtung zur Größe steuerbare Bildung von monodispersen Mikrotröpfchen

DOI:

10.3791/53860

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Computational Intelligence and Systems Science, Interdisciplinary Graduate School of Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 2Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Keio University, 4PRESTO, Japan Science and Technology Agency

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstrieren wir eine einfache Produktionsmethode für größensteuerbare, monodisperse Wasser-in-Öl (W/O) Mikrotröpfchen unter Verwendung eines kapillarbasierten zentrifugalen mikrofluidischen Geräts. Diese Methode benötigt nur ein geringes Probenvolumen und ermöglicht eine Produktion mit hoher Ausbeute. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für schnelle biochemische und zelluläre Analysen nützlich sein wird.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zeigen wir, ein einfaches Verfahren zur schnellen Herstellung von größen steuerbaren, monodisperse, W / O-Mikrotröpfchen eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung. W / O-Mikrotröpfchen wurden kürzlich in leistungsfähige Methoden verwendet worden, die chemische Experimente miniaturisierten ermöglichen. Um daher eine vielseitige Methode entwickeln monodisperse zu ergeben W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist. Wir haben ein Verfahren zur Erzeugung von monodispersen W / O-Mikrotröpfchen auf Basis eines Kapillar-basierten Kreisel axialsymmetrischen co fließenden Mikrofluidik-Vorrichtung entwickelt. Es gelang uns, die Größe der Mikrotröpfchen durch Steuern der Kapillaröffnung einzustellen. Unser Verfahren erfordert Geräte, die einfacher zu bedienen ist als bei anderen Mikrofluidtechniken benötigt nur ein kleines Volumen (0,1-1 & mgr; l) der Probenlösung für die Kapselung und ermöglicht die Herstellung von Hunderttausenden Anzahl von W / O-Mikrotröpfchen pro Sekunde . Wir erwarten, dass diese Methode biologische Untersuchungen helfen, die wertvollen biologischen s erfordernspiele, indem das Volumen der Proben für die schnelle quantitative Analyse biochemischen und biologischen Untersuchungen bewahren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W / O-Mikrotröpfchen 1-5 haben viele wichtige Anwendungen für die Untersuchung der Biochemie und Biotechnologie, einschließlich Proteinsynthese 6, Proteinkristallisation 7, Emulsion PCR 8,9, Zellverkapselung 10 und Konstruktion künstlicher zellenartigen Systemen 5,6. W / O-Mikrotröpfchen für diese Anwendungen, wichtige Kriterien sind Kontrolle der Größe und Monodispersibilität der W / O-Mikrotröpfchen zu erzeugen. Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Herstellung von monodispersen, Größe steuerbare W / O-Mikrotröpfchen 11 werden auf der Basis der Co-fließenden Verfahren 12,13, Fließfokussierungsverfahren 14,15, und der T-Kreuzung Verfahren 16 in Mikrokanälen. Obwohl diese Verfahren hoch monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen, benötigt die Mikroprozess komplizierte Handhabung und spezielle Techniken für die Herstellung von Mikrokanälen, und erfordert auch eine große Menge der Probenlösung gegeben (mindestens mehrere hundert81; l) wegen der unvermeidlichen Totvolumen in den Spritzenpumpen und Röhren, die die Probenlösung auf die Mikrokanäle führen. Somit ist eine einfach zu bedienende und Totraumvorrichtung Verfahren zur Erzeugung monodisperser W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist.

Dieses Papier, zusammen mit Videos von experimentellen Verfahren, beschreibt eine Kreisel Kapillare basierten axialsymmetrischen co fließende Mikrofluidvorrichtung 17 zur Erzeugung zellgroßen, monodisperse W / O-Mikrotröpfchen (Abbildung 1). Diese einfache Methode erzielt Größe Monodispersität und Größe Steuerbarkeit. Es erfordert nur eine Tischplatte Mini-Zentrifuge und eine Kapillare basierenden achsensymmetrische zusammen fließt in einer Sampling-Mikroröhrchen befestigt Mikrofluidik-Vorrichtung. Unsere Methode benötigt nur ein sehr kleines Volumen (0,1 ul) und verschwenden keine wesentliche Volumen der Probe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung eines Kapillar-basierte Mikrofluidikvorrichtung

  1. Einrichten der Halter
    Hinweis: Die Halterdesign ist in 2A dargestellt.
    1. Schneiden Sie jede der vier Scheiben der Halter (2A (i) - (iv)) von 2 mm dicken Polyacetal Kunststoffplatte eine Fräsmaschine. Verwenden Sie die folgenden Dimensionen für jede der vier Scheiben des Inhabers: (i) Disc 1 Durchmesser 8,5 mm, Kapillar-Loch (CH) Durchmesser 1,3 mm, Schraubenloch (SH) Durchmesser 1,8 mm; (Ii) Scheibe 2 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 2,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; (Iii) Scheibe 3 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 0,5 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; und (iv) Scheibe 4 Durchmesser 9,1 mm, CH Durchmesser 1,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm.
    2. Montieren Sie die Halter mit M2 × 40 Schrauben (2B). Ein unterer Teil des Halters (2B) aus der Platte 1 und der Scheibe 2 in 2A (i), (ii) und einem oberen Teil (Figure 2B) des Halters besteht aus der Scheibe 3 und der Scheibe 4 in Figur 2A (iii), (iv).
      1. Den unteren Teil des Halters konstruieren, legen Sie die Schraube in drei SH jeder Scheibe 1 und 2 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,9 cm (die gleiche Länge wie das Unterteil des Halters).
      2. Um den oberen Teil des Halters konstruieren, legen Schrauben in die beiden SH jeder Scheibe 3 und 4 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,7 cm (die gleiche Länge wie der obere Teil des Halters).
      3. Die Halterung montieren, kommen Sie mit den unteren und oberen Teile des Halters eine lange Schraube.
        Hinweis: Halten Sie die Länge der einzelnen Teile des Halters genau: der untere Teil ist 0,9 cm; der obere Teil ist 0,7 cm (2B).
  2. Die Herstellung der Glaskapillaren
    1. Verwenden zwei Arten von Glaskapillaren: eine innere Glaskapillare (Außendurchmesser (OD) / Innendurchmesser (ID): 1,0 / 0,6 mm), und eine äußere Glaskapillare (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
    2. Verwenden Sie einen Glasschneider den äußeren Glas Kapillare in drei gleiche Teile zu teilen und dann die Glasschneider verwenden, um die innere Glaskapillare in zwei gleiche Teile zu teilen.
    3. Schärfen jeder geteilten inneren und äußeren Glaskapillaren mit einer Glaskapillare Magnet (3A). Stellen Sie das Gewicht des Zieh bei max. Stellen Sie den Wärmeniveau des Zieh bei 60 Grad für die äußere Glas Kapillare und 70 Grad für die innere Kapillare. schärfen vorsichtig das Glas Kapillare.
      1. Halten Sie die Länge der Spitze innerhalb der verengten Teil der Glaskapillare: die innere Kapillare ist 1,5-1,8 cm; die äußere Kapillare 0,8-1,0 cm (3C). Wenn diese Länge kürzer oder länger als die beschriebene Länge handelt, sollten Sie Wärmeniveau des Zieh einzustellen.
    4. Fix die inneren oder äußeren Glas Kapillaren zur Mikroschmiede stehen mit Klebeband (3B).
    5. Schneiden Sie die Spitze der Glaskapillare weg mit der Mikroschmiede in drei Schritten (3B): (i) berühren die Spitze der Glaskapillare auf die Glasperlen auf einem Platindraht, (ii) erwärmen, um die Platindraht auf einem Fuß von Schritt Schalter für 1-2 sec, und (iii) nach 1-2 sec, durch Kühlen der Platindraht der Spitze der Glaskapillare abgeschnitten.
      1. Anpassen der Durchmesser der inneren (d i) und äußeren (d o) Kapillaröffnungen sind. Der Öffnungsdurchmesser der inneren Glas Kapillare 5, 10, und 20 & mgr; m (d i = 5,10, 20 & mgr; m) und der Außen Glaskapillare (d o) ist 60 & mgr; m (d o = 60 & mgr; m) in diesem Experiment.
        Hinweis: Die Glaskapillare stehen zur Verfügung. Wiederholen Sie die Herstellung des Glas Kapillarsystemer Jahren.

2. Verfahren zur Erzeugung von W / O-Mikrotröpfchen

  1. Füllen Sie eine äußere Glas Kapillare mit ölhaltigen Tensid. Die Mischung aus Öl und Tensid Hexadecan, enthaltend 2% (w / w) Sorbitanmonooleat in diesem Experiment (4A).
    Hinweis: Es gibt viele Kombinationen von Ölen und Tensiden (beispielsweise Ölen oder kohlensäurehaltigem fluorierten sein können; Tenside können ionische, nichtionische oder Fluorchemikalie).
    1. Einzuführen 10 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat in einen äußeren Glaskapillare. In 4A ist der Öffnungsdurchmesser des äußeren Glaskapillare (d o) 60 & mgr; m (d o = 60 um). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
  2. Stellen Sie die äußere Kapillare in den unteren Teil des Halters (4B).
  3. Draw etwa 0,1 & mgr; l einer wässrigen Lösung in eine innere Glaskapillare (4C) durch Kapillarwirkung. In 4C ist der Öffnungsdurchmesser des inneren Glaskapillare (d i) 10 & mgr; m (d i 10 & mgr; m =). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
  4. Stellen Sie die innere Kapillare in dem oberen Teil des Halters (4D-a). Legen Sie die innere Kapillare in die äußere Kapillare (4D-a). Mit Blick auf den weißen Punkt-Kreis, wie in Figur 4D-a, beobachten die Position der inneren Kapillare innerhalb der äußeren Kapillare (Innendurchmesser der äußeren Kapillare (w) = 130 um) (4D-b, c) unter Verwendung eines digitalen Mikroskops . Die Position der inneren Kapillare in der äußeren Kapillare muss w = 100-150 & mgr; m eingestellt werden.
    Hinweis: Um die Position der inneren ändernKapillare in der äußeren Kapillare Sie bitte die Schraube im oberen Teil der Halterung drehen. Dadurch kann Abstand w genau gesteuert werden.
  5. Einzuführen 100 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat (2% w / w) in den Boden eines 1,5 ml Mikroröhrchen Probe. Installieren Sie die Halterung, mit der inneren und äußeren Kapillaren, in der Probe Mikroröhrchen (4E-a). Achten Sie darauf, die äußere Kapillare zu überprüfen, damit es von der Luft-Öl-Grenzfläche entfernt (4E-b).
  6. Zentrifugieren Sie die Probe Mikroröhrchen ein Tischschwing-out-Typ Mini-Zentrifuge mit einer Dichte von 1,600 g für 1-2 sec unter Verwendung von Mikrotröpfchen (4F) zu erzeugen. Führen Sie alle Experimente bei RT.
    Hinweis: Verwenden Sie eine Schwing-out-Zentrifuge. Ein Tropfen können mit einer Seitenwand des Probenmikroröhre kollidieren und zerfallen, wenn ein Festwinkel-Zentrifugentyp verwendet wird.
  7. auszuarbeiten langsam die W / O-Tröpfchen mit einer Pipette und dann legte sie auf ein Glas sLiDE.
  8. Machen Sie Bilder der Mikrotröpfchen erzeugt ein digitales Mikroskop (Vergrößerung 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie zeigen wir ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von Zellgroße W / O-Mikrotröpfchen durch eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung (1) verwendet wird. Mikrofluidische Vorrichtung bestand aus einem Kapillarhalter besteht (2B), zwei Glaskapillaren (inneren und äußeren Glaskapillaren in 3C) und ein Mikroröhrchen ein Öl einschließlich Tensid enthält. Wir injizierten 0,1 & mgr; l Probenlösung in die in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit diesem Gerät wurden die monodisperse W / O-Mikrotröpfchen, die durch Plateau-Rayleigh Instabilität einer Jet-Strömung 17. Die mikroskopische Untersuchung ergab die Anwesenheit von Satellitentröpfchen. Bei der Herstellung der Vorrichtung sind drei kritischen Schritte wesentlichen erfolgreich monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen. Zuerst wird eine gerade Strömung von Öl enthaltenden Tensid und wäßriger Lösung, die Kapillarlöcher vier Scheiben zu liefern, müssen in einem konzentrischen Muster angeordnet...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den PRESTO Forschungsbereich "Design and Control of Cellular Functions" der Japan Science and Technology Agency (JST), ein Grant-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen "Molekulare Robotik" (Projekt Nr. 24104002) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan, Grant-in-Aid für junge Wissenschaftler (A) (Projekt Nr. 24680033) und Wissenschaftliche Forschung (B) (Projekt Nr. 26280097) von der Japan Society for die Promotion of Science (JSPS) und den Kurs "Creative Design for Bioscience and Biotechnology" der School of Bioscience and Biotechnology an der Tokyo Tech.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 mm dicke Polyacetal-KunststoffplatteWerkzeugNikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan)244-6432-08
FräsmaschineWerkzeugRoland DG Co., Ltd. (Japan)MDX-40A
Schaftfräser RSE230-0,5 * 2,5WerkzeugNS Tool Co., Ltd. (Japan)01-00644-00501
M2*40 SchraubenWerkzeugJujo Synthetische Chemie Labo. (Japan)Artikel-Nr.: 0001-024
GlaskapillarabzieherNarishige (Japan)PC-10
MicroforgeWerkzeugNarishige (Japan)MF-900
Inneres GlaskapillarwerkzeugNarishige (Japan)G-1
Äußeres GlaskapillarwerkzeugWorld Precision Instruments Inc. (USA)1B200-6
1,5 ml ProbenröhrchenWerkzeugINA OPTIKA CO.,LTD (Japan)ST-0150F
Hexadecan-ReagenzWako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan)080-03685 
Sorbitanmonooleat (Spanne 80)ReagenzTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan)S0060
Milli Q SystemReagenzMerck Millipore Corporation (Deutschland)ZRQSVP030
Ausschwenkbares Mini-ZentrifugenwerkzeugHitech Co., Ltd. (Japan)ATT101
Digitales MikroskopwerkzeugKEYENCE Corporation (Japan)VHX-2001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary based Centrifugal Microfluidic DeviceMonodisperse Microdroplet FormationSize controllable MicrodropletsWater in Oil MicrodropletsCentrifugal MicrofluidicsCapillary Orifice ControlMicrodroplet GenerationMicrofluidic Device AssemblyCentrifuge OperationMicrodroplet Size Control

Related Articles