Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Lale Evsen; Angelika Doetzlhofer

doi:10.3791/53864

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Methodenartikel

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von

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DOI:

10.3791/53864

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17. April 2016

Lale Evsen¹ , Angelika Doetzlhofer¹

¹The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Hörorgan vermittelt das Hören. Hier stellen wir eine modifizierte In-Ovo-Mikroelektroporationsmethode vor, die für die Untersuchung der Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühner-Hörorgan optimiert ist.

Zusammenfassung

Hühnerembryonen sind ideale Modellsysteme zur Untersuchung embryonaler Entwicklung als Manipulationen der Genfunktion kann mit relativer Leichtigkeit in ovo ausgeführt werden. Das Innenohr Gehörsinnesorgan ist für unsere Fähigkeit, kritisch zu hören. Es beherbergt eine hochspezialisierte Sinnesepithel, die von mechano-Umwandlungs-Haarzellen (HC-) und der umgebenden Glia artigen Stützzellen (SCs) besteht. Trotz struktureller Unterschiede in den Gehörorgane, sind die molekularen Mechanismen , die Entwicklung des Hörorgans Regulieren evolutionär konservierten zwischen Säugetieren und Aves In ovo Elektroporation frühen Stadien bei E1 weitgehend begrenzt ist -. E3. Aufgrund der relativ späte Entwicklung des Hörorgan bei E5, Manipulationen des Hörorgan durch in ovo Elektroporation Vergangenheit E3 sind aufgrund der fortgeschrittenen Entwicklung des Hühnerembryo schwer in späteren Phasen. Die hier vorgestellte Methode ist eine vorübergehende Gentransferverfahren für Gene von Interesse Targeting anStufe E4 - E4.5 im Hühner auditorischen Sinnesorgan über in - ovo - Mikro-Elektroporation zu entwickeln. Dieses Verfahren ist anwendbar für Verstärkungs- und loss-of-Funktionen mit herkömmlichen Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren und kann durch Zugabe von EDU (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) zu den gesamten Embryo in der mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden Zeitpunkt der Elektroporation. Die Verwendung von grün oder rot fluoreszierende Protein (GFP bzw. RFP) Expressionsplasmide ermöglicht dem Experimentator, um schnell festzustellen, ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Bei diesem Verfahren wird Papier, repräsentative Beispiele für GFP elektroporiert Proben veranschaulicht; 96 Stunden nach der Elektroporation und des Hörorgans zur pro-sensorischen Bereich der GFP - Targeting wurde von RNA in situ - Hybridisierung bestätigt - Embryonen wurden 18 geerntet. Das Verfahren Papier stellt auch ein optimiertes Protokoll für die Verwendung des EdU Thymidinanalogon Zelle prolif zu analysierenration; ein Beispiel für eine EdU basierte Zellproliferationsassays, die Immunmarkierung kombiniert und klicken Sie auf EdU Chemie vorgesehen.

Einleitung

Trotz der Unterschiede in der Morphologie und Zell Strukturierung zwischen Säugetieren und Vogel auditorischen Sinnesorgan, die molekularen Faktoren und Wege verantwortlich für die sensorische HC Entwicklung sind gedacht , um evolutionär ^1-3 konserviert werden. Die basilar Papille, die den Gehör HCs und der sie umgebenden SCs beherbergt, entwickelt als Aussackung des Innenohrs otocyst. Früh auf einem Pool von HC und SC Vorläufern ist innerhalb der Ohrplakode / otic Tasse neuralen sensorische zuständigen Domain (NSD) angegeben. Fate-Mapping - Daten belegen , dass die neuronale und sensorischen Linien verbunden sind und von der NSD entstehen in der antero-ve....