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Methodenartikel

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von

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⸱

DOI:

10.3791/53864

⸱

17. April 2016

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Hörorgan vermittelt das Hören. Hier stellen wir eine modifizierte In-Ovo-Mikroelektroporationsmethode vor, die für die Untersuchung der Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühner-Hörorgan optimiert ist.

Zusammenfassung

Hühnerembryonen sind ideale Modellsysteme zur Untersuchung embryonaler Entwicklung als Manipulationen der Genfunktion kann mit relativer Leichtigkeit in ovo ausgeführt werden. Das Innenohr Gehörsinnesorgan ist für unsere Fähigkeit, kritisch zu hören. Es beherbergt eine hochspezialisierte Sinnesepithel, die von mechano-Umwandlungs-Haarzellen (HC-) und der umgebenden Glia artigen Stützzellen (SCs) besteht. Trotz struktureller Unterschiede in den Gehörorgane, sind die molekularen Mechanismen , die Entwicklung des Hörorgans Regulieren evolutionär konservierten zwischen Säugetieren und Aves In ovo Elektroporation frühen Stadien bei E1 weitgehend begrenzt ist -. E3. Aufgrund der relativ späte Entwicklung des Hörorgan bei E5, Manipulationen des Hörorgan durch in ovo Elektroporation Vergangenheit E3 sind aufgrund der fortgeschrittenen Entwicklung des Hühnerembryo schwer in späteren Phasen. Die hier vorgestellte Methode ist eine vorübergehende Gentransferverfahren für Gene von Interesse Targeting anStufe E4 - E4.5 im Hühner auditorischen Sinnesorgan über in - ovo - Mikro-Elektroporation zu entwickeln. Dieses Verfahren ist anwendbar für Verstärkungs- und loss-of-Funktionen mit herkömmlichen Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren und kann durch Zugabe von EDU (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) zu den gesamten Embryo in der mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden Zeitpunkt der Elektroporation. Die Verwendung von grün oder rot fluoreszierende Protein (GFP bzw. RFP) Expressionsplasmide ermöglicht dem Experimentator, um schnell festzustellen, ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Bei diesem Verfahren wird Papier, repräsentative Beispiele für GFP elektroporiert Proben veranschaulicht; 96 Stunden nach der Elektroporation und des Hörorgans zur pro-sensorischen Bereich der GFP - Targeting wurde von RNA in situ - Hybridisierung bestätigt - Embryonen wurden 18 geerntet. Das Verfahren Papier stellt auch ein optimiertes Protokoll für die Verwendung des EdU Thymidinanalogon Zelle prolif zu analysierenration; ein Beispiel für eine EdU basierte Zellproliferationsassays, die Immunmarkierung kombiniert und klicken Sie auf EdU Chemie vorgesehen.

Einleitung

Trotz der Unterschiede in der Morphologie und Zell Strukturierung zwischen Säugetieren und Vogel auditorischen Sinnesorgan, die molekularen Faktoren und Wege verantwortlich für die sensorische HC Entwicklung sind gedacht , um evolutionär 1-3 konserviert werden. Die basilar Papille, die den Gehör HCs und der sie umgebenden SCs beherbergt, entwickelt als Aussackung des Innenohrs otocyst. Früh auf einem Pool von HC und SC Vorläufern ist innerhalb der Ohrplakode / otic Tasse neuralen sensorische zuständigen Domain (NSD) angegeben. Fate-Mapping - Daten belegen , dass die neuronale und sensorischen Linien verbunden sind und von der NSD entstehen in der antero-ventralen Bereich des otic Tasse befindet oder otocyst bei Mäusen und Huhn 4,5. Zunächst delaminieren Neuroblasten aus der NSD Vorrücken in den Neuronen des auditorischen-vestibulären Ganglion zu geben, die schließlich in Hör- und Gleichgewichts Ganglien gespalten. Diese Neuronen innervieren die sensorischen HCs des Innenohrs und Kerne im Hirnstamm. Die Zellen thbei der NSD bleiben werden gedacht, Anlass zu verschiedenen Sinnes Patches zu geben, einschließlich Gehörsinnesorgan, der mechano-Umwandlungs-sensorischen HCs und ihre zugehörigen SCs aus.

In den beiden Küken und Maus, Hörorgan sensorischen Vorläuferzellzyklus verlassen und HC Differenzierung treten bei Steigungen entgegenwirkt. In Küken beginnt auditorischen Vorläuferzellzyklus - Ausgang um ~ E5 und schreitet von der Basis bis zur Spitze, und vom Zentrum zur Peripherie 6. Einen Tag später HC Differenzierung beginnt im Scheitel und schreitet zu der Basis 7. Das Studium der Entwicklung des Innenohres in Huhn bietet viele technische Vorteile als Funktionsmechanismen können mit relativer Leichtigkeit in ovo im Gegensatz zu manipulieren Embryonen in utero in anderen Modellsystemen untersucht werden, die komplexe Operationen erfordert. Das hier beschriebene Verfahren nutzt in ovo Mikro Elektroporation Gene von Interesse in der vermutlichen Basila Zielr Papille Bereich anterior-ventral in dem Ohrbläschen speziell bei E4.

Elektroporation in ovo ist eine Technik , die gut etabliert ist und häufig verwendet 8-14. Das Prinzip der Elektroporation Technik basiert auf der Tatsache , dass Nukleotiden (zB Plasmid - DNA, synthetische DNA oder RNA - Oligonucleotide) sind negativ geladen. Die DNA wird in das interessierende Gewebe injiziert. Wenn ein elektrischer Strom über das Gewebe gelegt wird, öffnet sich der Strom transiente Poren in den Zellwänden und ermöglicht die Aufnahme der DNA, da die negativ geladenen DNA der positiven Elektrode fließt in Richtung (Anode). Für gain-of-function Experimente werden Gene von Interesse in Expressionsplasmide gewöhnlich subkloniert, die geeigneten Expressionskassetten für das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthalten. Für loss-of-function Experimente plasmid-basierten dominant negative Repressor-Konstrukten oder RNAi oder Morpholino Konstrukte commonly verwendet 15,16. Zur Hemmung microRNA (miRNA) Funktion miRNAs Schwamm Konstrukte, die typischerweise Plasmid basiert, 17 verwendet werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die Proliferation und Differenzierung in Hörorgans steuern, wie die in ovo Mikro Elektroporationsverfahren kann leicht durch Zugabe von mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden EdU auf den gesamten Embryo.

Die Elektroporation und die Zugabe von EdU bei E4 in der Ohrbläschen durchgeführt, die einen Tag vor dem Beginn der Zellzyklus-Ausgang in dem Hörorgan ist. Die Analyse des Hörorgan ist in der Regel durchgeführt, 18-96 Stunden nach der Elektroporation bei E5 (Beginn der sensorischen Vorläuferzellzyklus-Ausgang), E6 (Beginn der HC Differenzierung) und E7 (bei HC Differenzierung); und später bis ~ E9 (Ende HC Differenzierung). Dieses Elektroporation Verfahren des Gentransfers ist vergänglich etwa ~ 4 Tage dauert, because die Gene von Interesse nicht integrieren in das Genom, aber das Verfahren ist anwendbar für die Verwendung mit geeigneten Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren, die die Fähigkeit tun haben , in das Genom, beispielsweise Tol2 vermittelten Gentransfer 11 zu integrieren. Mit dieser Methode robust GFP oder RFP Ausdruck dauert ~ 4 Tage in der Cochlea, nach welchem ​​Punkt die Signale verblassen, noch bieten eine reichliche Zeitfenster die komplizierte Entwicklung des Hörorgan zu studieren. Diese in - ovo - Gentransferverfahren ist neu und ermöglicht, speziell auf die vermutliche Hörorgan bei E4 Ziel, die für die Untersuchungen optimal ist, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Es ist eine gute Ergänzung zu alternative Verfahren, die bei viel jüngeren Entwicklungsstadien 11,12 oder im Vergleich zur Verwendung von in vitro basilar Papillen Explantatkulturen 18 elektroporieren.

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Protokoll

Die Eier und unhatched Embryonen werden gepflegt und ethisch und menschlich behandelt. Alle Protokolle für unhatched Embryo Verwendung durch das Animal Care und Use Committee an der Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland genehmigt.

1. Eier und Herstellung von Expressionskonstrukten

  1. Eier:
    1. Inkubieren 3-4 Dutzend befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) bei 37 ° C flach auf der Seite liegen.
      1. Nach 24 Stunden Inkubation ziehen 3 ccm Eiweiss mit einer Spritze aus dem runden hinteren Ende des Eis und das Loch mit durchsichtigem Klebeband abzudichten. Dies schafft eine Luftkammer zwischen dem Embryo und der Eierschale, so dass für einen leichten Zugang zu dem Embryo , ohne den Embryo an der Schale haftet , wenn für den Zugriff auf die Oberseite des Eies 19 das Fenster zu schneiden.
      2. Bei 117 h Inkubationszeit, inszenieren die Embryonen nach Hamburger und Hamilton 20 Entwicklungsstadienbei E4 (HH24-25) (siehe Figur 1D).
  2. Expressionskonstrukten:
    1. Bereiten Sie die Plasmid-DNA unter Verwendung von Reagenzien und das Protokoll vom Hersteller eines handelsüblichen Vorbereitung Kit zur Verfügung gestellt. Im letzten Schritt der Herstellung, eluieren die DNA in 500 ul TE (Tris-EDTA) -Puffer in dem Kit in ein 1,5-ml-Röhrchen bereitgestellt.
    2. Ethanol ausfällen die DNA sie zu konzentrieren durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat und 1 ml 100% Ethanol zu dem Rohr. Das Röhrchen wird bei -20 ° CO / N.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 14.000 rpm bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und an der Luft trocknen das Pellet für 10 min bei RT. Auflösen des Pellets in 15 ul TE-Puffer, die eine Konzentration von ~ 4 & mgr; g / & mgr; l ergeben sollte.
      HINWEIS: Die Expressionskontroll verwendeten Konstrukte sind hier Pmes-IRES-GFP 10, die von einem Huhn β-Aktin - Promotor oder pCI-H2B-IRES-RFP angetrieben wird 10, die durch den CMV - Promotor angetrieben wird.

2. Huhn In Ovo Micro-Elektroporation und in - ovo - Zellproliferationstest

  1. In Ovo Mikroinjektion von Expression Baukonstruktion und Micro-Elektroporation:
    1. Ziehen die Glaskapillaren in feinen Nadeln mit einer Mikropipettenzieher mit den folgenden optimierten Parameter für eine 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Heizdraht: Druck = 500, Wärme = 600 ° C, ziehen = 64, Geschwindigkeit = 105, und Zeit = 150 ms (siehe Tabelle 1).
    2. Die links- und rechtsgeben Mikromanipulator Stufen flankieren das Mikroskop (siehe Abbildung 1A) ein. Der Rechtshänder Mikromanipulator hält die Glaskapillare Nadel und der Linkshänder Mikromanipulator hält die Elektroden (1A).
    3. Bereiten Sie die fein gezogen Glaskapillare Nadel für Mikroinjektion durch Schneidendie Spitze der Nadel mit einer Zange während der Arbeit unter dem Mikroskop.
    4. Füllen Sie die Nadel manuell von Hand mit dem Mikromanipulator mit 2,5 ul von Plasmid-DNA mit 0,1% Fast Green getönt, während sie unter dem Mikroskop zu arbeiten.
    5. Legen Sie das Ei auf der Seite liegend in einer Form / Ei Haltevorrichtung (siehe 1A). Schneiden Sie ein rundes Fenster auf dem Ei mit einer Schere 19 (1A).
    6. Während unter dem Mikroskop arbeiten, öffnen vorsichtig die beiden Membranen den Embryo überlagert mit einer Pinzette.
    7. Während unter dem Mikroskop arbeiten, liefern mit dem Mikromanipulator und durch Mikro-Elektroporation ca. ~ 0,5 ul von Plasmid-DNA an die richtigen Ohrbläschen Lumen durch Mikroinjektion in die rechte Hand.
      1. Dazu Mikro injizieren die richtigen Ohrbläschen Lumen mit der DNA mit der rechten Mikromanipulator (1B-D) , während zur gleichen Zeit die linke Hand Holdin mitga forcep den Kopf des Embryos zu stabilisieren, weil der Kopf des Embryos in der Stufe E4 eintaucht. Nicht Mikro injizieren vorbei an den Ohrbläschen Lumen, da dies das Ohrbläschen schädigen.
      2. Unmittelbar nach der Mikroinjektion, während sie unter dem Mikroskop arbeiten, verwenden Sie die linke Mikromanipulator die positive (Anode) 2 mm Platinelektrode anterior-ventralen nach rechts Ohrbläschen und der negativen 2 mm Elektrode (Kathode) parallel zu platzieren 1 mm auseinander (Abbildung 1 C sehen). Geben Sie 4 Impulse bei 12 V mit 100 ms Dauer und 200 ms Abstand. Das linke Ohrbläschen dient als interne unbehandelten Kontrolle.
        HINWEIS: Reinigen Sie die Elektroden zwischen electroporations mit einem Wattetupfer getaucht in 1x PBS.
  2. In Ovo - Zellproliferationstest:
    1. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 50 ul 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS, indem manuell die 50 ul EdU Lösung auf die gesamte droppingEmbryo in ovo mit einer Pipette. Verschließen Sie die Eier mit einem Band und zurück in den Inkubator für 18-96 Std.
    2. Sie das Band vorsichtig entfernen und nach 18 innerhalb der Ohrbläschen , die Embryonen für Fluoreszenz GFP oder RFP Signal überprüfen - 24 Stunden ein Standard - Fluoreszenzmikroskop (siehe Abbildung 1 EE ') verwendet wird . Wenn Fluoreszenzsignal vorhanden ist, ernten an dieser Stelle die Embryonen für Analysen oder mit Klebeband wieder verschließen und senden Sie es für die Ernte in den Inkubator und Analysen in späteren Phasen (Abbildung 1 FP '' zu sehen).
      HINWEIS: Die Expression von GFP - Signal mit dem PME-IRES-GFP - Konstrukt ist offensichtlich , 6 - 7 Stunden nach der Elektroporation 10.

3. Embryo Ernten und Gewebeverarbeitung für die RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie

  1. Ernten Sie die Embryonen mit einer Pinzette. Spülen Sie den Embryo in kaltem 1x PBS. Entfernen Sie die Köpfe der Embryonen, durch Schneiden der Kopf durch den Halsmit einer Pinzette und legen die Köpfe in 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C. Stechen Sie das Gehirn eine forcep mit Durchdringung der 4% Paraformaldehyd im Inneren des Kopfes zu ermöglichen.
  2. Entwässern die Köpfe in 30% Saccharose (in 1x PBS) O / N bei 4 ° C.
  3. Montieren Sie die Köpfe in Kryoprotektivum durch schnelles Einfrieren in einem Brei aus Trockeneis und Methylbutan (2-Methyl). Alternativ frieren schneller die Köpfe in kryoprotektiver Medium mit flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die montierten Köpfe bei -80 ° C.
  4. Kryoschnittes die Köpfe in 12 & mgr; m dicke Gewebeschnitte und sammeln Sie alle Innenohr haltigen Gewebeschnitte auf superfrosted Mikroskop Objektträger aus Glas.
  5. Führen Sie Standard - RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie , wie zuvor beschrieben 4,21 und analysieren für EdU Zellproliferation nach dem Protokoll vom Hersteller des Kits zur Verfügung gestellt.
    HINWEIS: Haarzellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-α-MyosinVIIa (MYO7A) ein identifiziert werden könnentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) und fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper (1: 250, Ziege anti-Kaninchen AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Bildaufnahme- und Bildverarbeitungs

  1. Nehmen Sie Bilder mit digitalen Bildgeräte. Bild Immunhistochemie Ergebnisse mit einem Standard - Fluoreszenzmikroskop und die Ergebnisse der in situ ein Standardweitfeldmikroskop ( im Bereich von 5x bis 40x in Vergrßerung) gemessen.
  2. Verarbeiten Sie die Bilder mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware.

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Ergebnisse

Bei diesem Verfahren wird DNA Papier Plasmid des grün fluoreszierenden Proteins aus (GFP) Expressionskassetten wurde in die Entwicklung von Hühner basilar Papille gezielte (BP) mit optimierten Parametern von 12 V und 4 Impulsen mit 100 msec Impulsdauer und Intervalle von 200 ms, ein Nachgeben ~ 50% Embryo-Überlebensrate und Effizienz von Plasmid-DNA in die BP-Targeting. Fluorescent Imaging von nativen GFP - Expression Embryonen in Entwicklungs zeigte diese Methode der Elektroporation ric...

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Diskussion

Das hier beschriebene Verfahren der in - ovo - Mikro Elektroporation wird für den Gentransfer in die Entwicklungs Hörorgan optimiert. Es ist kompatibel mit Plasmid-DNA basierenden Expressionsvektoren typischerweise verwendet, um die Genfunktion / Ausdruck zu manipulieren. Der Zeitpunkt der Elektroporation bei E4 ist für Untersuchungen optimal, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Die wichtigsten Schritte sind die DNA in das Ohrbläschen Lumen Mikrospritz ohne mit der Nadel geht zu tief und ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Doris K. Wu für Expressionsplasmide und in - situ - Sonden, die Johns Hopkins University Center für Sinnesbiologie Bildgebung Anlage und das Zentrum für Hören und Gleichgewicht. Diese Arbeit wurde von NIDCD Grants T32 DC000023 zu LE unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Steril 1x PBS pH 7,4gibco10010-023
Fast Green FCF PulverSigmaF7252-5G
EdU PulverInvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging KitInvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTX Harvard Apparat
Banane auf Micrograbber KabelsatzBTX Harvard Gerät45-0216
Rechtshänder & Mikromanipulatoren für LinkshänderWorld Precision Instruments Inc. M3301R & M3301L
Zwei 12-mm-Tische mit magnetischen Haltevorrichtungen und vertikalen 7-Zoll-PfostenWorld Precision Instruments Inc. M10
Metall Stahl Grundplatte 12x24 ZollWorld Precision Instruments Inc. 5479
Schere für Eier 12 cm lang, gebogen, 12 mm extrafeine Klingen; FederschereWorld Precision Instruments Inc. 14120
Micropippette Abzieher zum Ziehen von NadelnSutter Instrument Co.P-97
2,5x2,5 mm Box Platin HeizfilamentSutter Instrument Co. KG
Glaskapillarröhrchen/-nadeln/ohne Fasern/Borosil 1 mmFHC27-30-0
Hamilton Glasspritze 100 μ lHamilton80601 Modell 710LT
Mineralöl (schwer) für Hamilton GlasspritzeFisher ScientificO122-1
Polyethylenschlauch zum Verbinden der Glasspritze und der Glaskappennadeln / UngiftigBecton Dickinson and Company (BD)427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc EinwegspritzenBecton Dickinson and Company (BD)309657
Einwegnadeln 21 GaugeBecton Dickinson and Company (BD)305122
Ein Paar 2 mm PlatinelektrodenBulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
ElektrodenhalterBulldog Bio. / NepageneCUY580
Ein Paar Dumont Feinzange Nummer 5Fine Science Tools (FST)
Unsichtbares Klebeband mit mattem Finish zum Versiegeln von EiernOffice Depot520-928
WattestäbchenFisher Scientific23-400-101
Sterile Filterspitzen

Referenzen

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